辣椒HD-Zip基因家族鑒定、系統(tǒng)進化及表達分析

邵晨冰，黃志楠，白雪瀅，王云鵬，段偉科

（淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇淮安 223003）

0 引言

【研究意義】辣椒（Capsicum annuum），屬茄科（Solanaceae）茄亞族（Solaninae Dunal）辣椒屬一年生或多年生植物，是我國重要的蔬菜作物，近幾年種植面積及產(chǎn)量均居世界首位（http://faostat.fao.org）。HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子（homeodomain-leucine zipper，HD-Zip）是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控植物光合作用、形態(tài)建成以及逆境脅迫應(yīng)答等重要生長發(fā)育過程[1-2]。通過在辣椒基因組中系統(tǒng)鑒定HD-Zip基因家族成員，并對其染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、進化關(guān)系和表達特征進行分析，對進一步認識辣椒生長發(fā)育過程及培育改良辣椒品種具有重要意義。【前人研究進展】HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子屬于同源異形域（Homeodomain，HD）轉(zhuǎn)錄因子超家族，參與調(diào)控正常生長條件和環(huán)境脅迫后植物的生長發(fā)育[3]。該轉(zhuǎn)錄因子均由同源異型域及亮氨酸拉鏈（leucine zipper，LZ）結(jié)構(gòu)域共同構(gòu)成。HD和LZ結(jié)構(gòu)域的存在共同決定了該類蛋白的轉(zhuǎn)錄因子功能[1]。根據(jù)基因序列的保守性及結(jié)構(gòu)特點，該家族可被分為4個亞族，HD-Zip I—IV：HD-Zip I亞族只包含HD和LZ結(jié)構(gòu)域；II亞族另包含一個N端保守區(qū)域（N-term）；III亞族較復(fù)雜，包含除HD和LZ結(jié)構(gòu)域之外的START、SAD和MEKHLA結(jié)構(gòu)域；IV亞族與III亞族類似但沒有C端的MEKHLA結(jié)構(gòu)域[1]。HD-Zip基因家族不同亞族參與不同的代謝途徑[1]。以模式植物擬南芥為例，HD-Zip I在非生物脅迫（ATHB1、ATHB5、ATHB6、ATHB7、ATHB12）[4]，光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（ATHB16）[5]，葉片發(fā)育（ATHB1、ATHB3、ATHB16和ATHB20）[4]等方面發(fā)揮重要的作用；HD-Zip II主要在植物發(fā)育過程中參與環(huán)境改變應(yīng)答機制，特別是光質(zhì)改變應(yīng)答調(diào)控（ATHB2、ATHB4、ATHB2）[6-7]；HD-Zip III主要參與胚胎發(fā)育（PHB和PHV）[8]，莖和花分生組織形成（ATHB15、ATHB8、REV）[9]和維管發(fā)育（REV、ATHB15）[10-11]等；HD-Zip IV則主要在植物毛狀體的形成（HDG11、HDG12、GL2）[12]，表皮細胞的發(fā)育（ATHB10、PDF2、AtML1）[13]，葉片形態(tài)和生殖細胞發(fā)育（HDG1）[14]，花色素苷積累（ANL2）[15]等過程起重要作用。HD-Zip的同一亞族在不同植物中具有相似的功能。但由于物種和環(huán)境的差異，特別是不同植物在進化過程中經(jīng)歷了不同選擇、復(fù)制和保留事件，HD-Zip基因家族同源基因在不同物種中均有不同程度的分化。比如油椰子（Elaeis guineensis）中的EgHOX1（II亞族），該基因參與早期體胚的形成，并且影響了形成層發(fā)育中胚性能力的獲得[16]。番茄中的13條HD-Zip IV基因在新葉和花朵中高度表達，對不同的植物激素和非生物脅迫具有應(yīng)答作用[17]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，該家族基因已經(jīng)在擬南芥[1]、葡萄[18]、玉米[19]等多個物種中被鑒定，并發(fā)現(xiàn)其發(fā)生不同程度的功能分化。辣椒的全基因組測序在兩個品種‘CM334’及‘遵辣1號’中已完成[20-21]，為研究相關(guān)基因的功能及關(guān)系奠定了堅實的基礎(chǔ)。雖然該家族在‘CM334’基因組中進行了初步分析[22]，但進化及表達數(shù)據(jù)分析較少，并未進行深入研究和比較分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用生物信息學(xué)手段鑒定辣椒HD-Zip基因家族，并系統(tǒng)分析其在基因組中的分布、基因結(jié)構(gòu)、進化分化特征及在不同組織中的時空表達特異性，為闡明辣椒HD-Zip基因家族分化歷程及生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗于2018—2019年在淮陰工學(xué)院園藝作物系統(tǒng)生物學(xué)實驗室進行。

1.1 辣椒HD-Zip基因家族成員的鑒定

本研究主要基于我國辣椒測序品種‘遵辣1號（Zunla-1）’進行系統(tǒng)分析，同時利用墨西哥地方品種‘CM334’進行比較分析。研究中使用的辣椒基因組數(shù)據(jù)分別從辣椒基因組網(wǎng)站（Pepper Genome Database2.0，http://peppersequence.genomics.cn/page/species/index.jsp）及PGP（Pepper genome platform，http://peppergenome.snu.ac.kr/）下載獲得。

參照前人報道[1]及PlantTFDB（Plant Transcription Factor Database http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）確定擬南芥HD-Zip基因家族成員。隨后，將其作為誘餌利用本地BLAST工具在辣椒基因組中進行比對（參數(shù)為E＜1e-10，Identity＞40%），獲得與擬南芥同源性高的HD-Zip序列信息，并利用Pfam（http://pfam.sanger.ac.uk/search）及SMART（http://smart.emblheidelberg.de/）進行驗證分析，刪除缺失結(jié)構(gòu)域的序列，最終獲得辣椒HD-Zip基因家族候選基因。

辣椒HD-Zip家族成員蛋白分子量和等電點利用在線工具EMBOSS Programs（https://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/）進行分析鑒定。

1.2 辣椒HD-Zip基因家族系統(tǒng)進化樹構(gòu)建和分組確定

利用CLUSTALW將擬南芥及辣椒HD-Zip氨基酸序列進行多序列比對分析[23]。并通過鄰接法（Neighbour-Joining，NJ）在MEGA 6.0中構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，自展值（Bootstrap）設(shè)定為1 000。HD-Zip基因的核苷酸差異同樣應(yīng)用MEGA6.0進行計算[24]。

1.3 辣椒HD-Zip家族成員結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

HD-Zip的外顯子和內(nèi)含子位置信息參考辣椒基因組注釋信息GFF文件，之后應(yīng)用本地perl語言提取位置信息轉(zhuǎn)變?yōu)镚SDS（Gene Structure Display Server；http://gsds.cbi.pku.edu.cn）可讀bed文件。應(yīng)用在線工具GSDS進行HD-Zip結(jié)構(gòu)的繪制。

應(yīng)用MEME 4.9.0預(yù)測分析HD-Zip蛋白序列的結(jié)構(gòu)域，搜尋motif值設(shè)置為16，結(jié)構(gòu)域?qū)挾仍O(shè)定為最小10、最大100，其他設(shè)定為默認參數(shù)。通過TBbool軟件繪制出MEME結(jié)構(gòu)[25]。HD及LZ結(jié)構(gòu)域通過SMART（http://smart.embl-heidelberg.de）數(shù)據(jù)庫分析確定。

1.4 辣椒HD-Zip基因家族染色體定位和基因復(fù)制類型分析

應(yīng)用本地perl語言在辣椒基因組注釋信息GFF文件中提取位置信息并構(gòu)建辣椒染色體定位圖。HD-Zip在辣椒基因組中的復(fù)制類型根據(jù)MCScanX下游程序duplicate_gene_classifier獲得[26]，并標注在染色體上。

1.5 HD-Zip直系（Orthologous）和旁系（Paralogous）同源基因分析

辣椒、番茄和擬南芥HD-Zip的直系與旁系同源關(guān)系通過OrthoMCL（http://orthomcl.org/orthomcl/）軟件進行鑒別，HD-Zip在3個基因組中的直系與旁系之間的關(guān)系圖用Circos（http://circos.ca/）軟件繪制。

1.6 辣椒HD-Zip的組織表達差異分析和共表達網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過GEO數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）獲得‘遵辣1號’材料不同時期的轉(zhuǎn)錄組（GSE45037）注釋文件[21]，運用R軟件繪制辣椒HD-Zip基因家族的表達熱圖。

辣椒HD-Zip在不同組織之間的表達關(guān)系皮爾森相關(guān)系數(shù)（Pearson’s correlation coefficient，PCC）通過本地perl語言進行計算，顯著相關(guān)共表達基因?qū)Φ木W(wǎng)絡(luò)顯示利用Cytoscape 3.1進行構(gòu)建。

2 結(jié)果

2.1 辣椒HD-Zip基因家族的成員分析和分組鑒定

利用生物信息學(xué)方法并經(jīng)過后續(xù)的篩選驗證，從辣椒‘遵辣1號’全基因組中共鑒定到42個HD-Zip家族成員，根據(jù)染色體順序依次命名為CaHDZ01—CaHDZ42，其中基因CaHDZ42并沒有錨定在染色體（表1）。

辣椒中HD-Zip家族基因長度介于459 bp（CaHDZ38）和2 529 bp（CaHDZ03）之間；分子量從最小18.09 kD（CaHDZ38）到最大93.61 kD（CaHDZ03）不等；等電點介于4.20（CaHDZ40）至9.36（CaHDZ08）之間。因此，HD-Zip基因家族的基因長度跨度很大，且與分子量具有相關(guān)性，而pI主要取決于氨基酸中酸性氨基酸和堿性氨基酸的數(shù)量比，大多數(shù)CaHDZ蛋白（70%）的pI小于7.0，證明其可能是一類酸性蛋白（表1）。

基因序列若高度同源，則可能具有相似的功能。在擬南芥HD-Zip與辣椒的HD-Zip基因家族成員對比結(jié)果中可知，大多數(shù)辣椒HD-Zip與擬南芥具有高度同源性（E-value=0，表1），為指導(dǎo)辣椒HD-Zip基因家族的生物學(xué)功能研究提供了參考。

圖1 辣椒、擬南芥HD-Zip基因家族系統(tǒng)進化樹Fig.1 The unrooted phylogenetic tree of HD-Zip gene family between pepper and Arabidopsis

為進一步了解辣椒HD-Zip基因家族和擬南芥之間的同源關(guān)系，構(gòu)建了辣椒、擬南芥HD-Zip基因家族系統(tǒng)進化樹（圖1）。由圖可知，與擬南芥一樣，辣椒HD-Zip基因家族可分為4個亞族（為I、II、III和IV）。在辣椒基因組中這4個亞族分別含有18、9、5、10個HD-Zip，I、II、III亞族數(shù)目與擬南芥中類似，其中III亞族基因個數(shù)一致，證明這3個亞族HD-Zip并沒有在辣椒基因組中大范圍變化，而辣椒中IV組基因明顯比在擬南芥中減少，可能是在辣椒全基因組復(fù)制過程中丟失較多（圖1）。

2.2 辣椒HD-Zip基因家族的結(jié)構(gòu)特征分析

從圖2可以看出辣椒HD-Zip基因家族中4個亞族的基因結(jié)構(gòu)有顯著差別。整體看來，I、II亞族的基因編碼序列較III和IV亞族結(jié)構(gòu)簡單，I亞族外顯子數(shù)目最少，均為2—3個，II亞族為3—4個，而III、IV亞族成員外顯子數(shù)目多在10個以上（圖2-B）。大多數(shù)進化樹節(jié)支點的基因具有類似的外顯子結(jié)構(gòu)，但從基因全長來看，相似的CDS長度卻有不同的基因全長，說明內(nèi)含子長度具有較大的差異性。

同時，對辣椒HD-Zip基因家族進行了蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析，共鑒定獲得16個保守基序（Motif），將這些Motif進行了注釋。Motif 1和2對應(yīng)HD，Motif 3對應(yīng)LZ。結(jié)果表明，辣椒HD-Zip成員均含有HD和Zip結(jié)構(gòu)域，但部分成員的HD結(jié)構(gòu)域并不完整，如第I亞族中CaHDZ15和III亞族CaHDZ39缺失了部分HD結(jié)構(gòu)域（Motif 2）。此外，IV亞族HD結(jié)構(gòu)域中多了Motif 7（圖2-C）。從4個亞族的結(jié)構(gòu)來看，與前人一致，I亞族只包含HD和Zip兩個結(jié)構(gòu)域；II亞族除CaHDZ38外，motif多集中于序列后半段；III亞族和IV亞族含有另外的結(jié)構(gòu)域，但它們之間并不完全保守（圖2-C）。

圖2 辣椒HD-Zip基因家族成員的結(jié)構(gòu)特征Fig.2 An analytical view of HD-Zip family in pepper

2.3 辣椒HD-Zip基因家族的染色體定位分析

依據(jù)辣椒CaHDZ染色體位置信息，除CaHDZ42外，剩下41條基因不均勻地分布在12條染色體上（圖3）。其中1號、2號、3號染色體上分布的基因較多，分別有6條、9條和7條。2號染色體上的基因大多分布在其下端，3號染色體的基因大多分布在其上端，8號和9號染色體上最少，均只分布有1條HD-Zip家族基因，其余染色體在2—4條。通過4個亞族基因在染色體上分布情況比較，發(fā)現(xiàn)I亞族基因主要集中在2號和3號染色體上，其余亞族成員不均等分布在染色體上。部分染色體僅有單個亞族的成員，比如4號、5號和9號僅有I亞族基因，8號染色體僅有III亞族基因，推測在辣椒三倍化快速擴增過程中并未均等的發(fā)生片段復(fù)制，或者復(fù)制后HD-Zip丟失較多。

此外，通過MCScanX及下游程序?qū)λ谢蜻M行共線性和復(fù)制基因分析，結(jié)果表明，CaHDZ01/CaHDZ20、CaHDZ12/CaHDZ24、CaHDZ26/CaHDZ40、CaHDZ10/CaHDZ27都發(fā)生了片段復(fù)制。片段復(fù)制使得基因數(shù)目增多，特別是I亞組基因數(shù)目的增加。

圖3 HD-Zip在辣椒染色體上的位置Fig.3 The chromosome location of the HD-Zip genes in pepper

2.4 辣椒、番茄和擬南芥HD-Zip直系、旁系同源基因的鑒定

在對辣椒、番茄和擬南芥3個物種內(nèi)部直、旁系同源基因的對比研究中（圖4），發(fā)現(xiàn)在3個物種中直系同源基因?qū)Χ己芏啵@可能是由于HD-Zip序列極度保守和相似。在表1中，辣椒和擬南芥HD-Zip的比對結(jié)果也表明大部分基因?qū)Φ腅值都很小，甚至為0，證明這類基因極保守，特別是第III亞組基因。此外，通過比較3個物種中的直系同源基因?qū)?shù)目，發(fā)現(xiàn)直系同源基因?qū)Υ篌w相同，但辣椒和番茄之間的稍多于其他組，表明辣椒與番茄兩物種間的基因相似度高，有較高的保守性。這也與辣椒和番茄的親緣關(guān)系相一致，一般親緣關(guān)系越近，兩物種間的同源基因?qū)驮蕉?。而旁系同源基因的鑒定結(jié)果則表明，擬南芥中要明顯多于番茄和辣椒，辣椒中最少，說明辣椒基因組的倍增事件并沒有導(dǎo)致HD-Zip的明顯擴增，或者是基因組復(fù)制后基因丟失較多。

圖4 擬南芥、番茄和辣椒的直系及旁系同源HD-Zip的分布Fig.4 Circle plots of paralogous and orthologous HD-Zip pairs between Arabidopsis thaliana, Solanum lycopersicum and Capsicum annuum

2.5 HD-Zip基因家族進化特征分析

為進一步明確HD-Zip基因家族進化特征，分別選取無油樟（Amborella trichopoda）、水稻（Oryza sativa）[19]、玉米（Zea mays）[19]、番茄（Solanum lycopersicum）[17]、馬鈴薯（Solanum tuberosum）[27]、辣椒‘CM334’、辣椒‘Zunla-1’、毛果楊（Populus trichocarpa）[28]、葡萄（Vitis vinifera）[18]以及擬南芥[1]9個代表物種進行分析（表2、圖5）。與孑遺植物無油樟相比，HD-Zip在其余8種植物中具有不同程度的倍增（表2），證明其在不同的進化過程中被不均等的復(fù)制保留下來。系統(tǒng)進化樹分析表明，包含無油樟在內(nèi)這9個物種的HD-Zip序列不均等的分布在4個亞族中，說明從被子植物開始，HD-Zip基因家族就穩(wěn)定存在4個亞族。在這9個物種中，I亞族含有最多的數(shù)目，而III數(shù)目最少（圖5-A），證明在被子植物全基因組復(fù)制過程中I亞族復(fù)制保留的基因最多，而III亞族基因沒有發(fā)生復(fù)制或復(fù)制后丟失。這也側(cè)面證明III亞族基因可能相對比較保守。

表2 HD-Zip在不同物種中數(shù)目情況統(tǒng)計Table 2 Numbers of HD-Zip genes in different species

圖5 HD-Zip基因家族4個亞族之間的關(guān)系Fig.5 Phylogenetic relationship of HD-Zip gene family and characteristic of the four groups

通過系統(tǒng)進化樹來看，I和II亞族具有較近的親緣關(guān)系，而III和IV亞族親緣關(guān)系較近（圖5-A）。為研究這4個亞族基因之間的親緣關(guān)系，分別鑒定了它們之間的核苷酸差異。從圖5-B中可以看出，III亞族基因內(nèi)部的核苷酸差異最小，證明該亞族基因非常保守，與前期結(jié)果一致。I亞族基因的平均核苷酸差異最大，但與II和IV亞族并未有明顯差異。II和IV亞族基因內(nèi)部的核苷酸差異則更加分散，證明II和IV亞族基因發(fā)生了明顯的分化。從不同亞族之間的差異來看，I和II亞族基因之間核苷酸差異最小，表明I和II亞族親緣關(guān)系最近，其次是III和IV亞族。根據(jù)結(jié)果可以推測最先存在的HD-Zip基因家族可分為兩組，其中一組分化成I和II亞族，而另一組則分化成為III和IV亞族。

2.6 辣椒HD-zip基因家族在不同組織中表達模式分析

對42個辣椒HD-Zip在根、莖、葉、花芽、花和果實不同發(fā)育時期的表達模式進行分析。結(jié)果顯示，該家族基因的4個亞族具有不同程度的表達趨勢，其中I亞族中的基因在辣椒不同組織中的表達量相對較高，且亞族內(nèi)部呈現(xiàn)出不同的表達模式，近一半基因在辣椒不同組織及果實發(fā)育前期均具有較高的表達量，證明這部分基因?qū)苯返纳L發(fā)育，特別是果實成熟前期具有重要的作用（圖6）。其中，CaHDZ22在莖中的表達程度最強，表明該基因可能對辣椒莖的生長有重要作用（圖6）。較I亞族相比，II、III和IV亞族基因在不同組織中的表達量相對較低，但部分基因在特定組織中具有較大的表達量，例如CaHDZ13在根、莖、芽、葉、花和果實成熟前期具有較高的表達量，CaHDZ34在辣椒果實成熟后期具有較大的表達量，CaHDZ02和CaHDZ28在果實剛剛膨大時具有較高的表達量，CaHDZ04在果實成熟前期具有較大的表達量，證實這些基因在辣椒的特定時期均具有重要的作用（圖6）。此外，CaHDZ09、CaHDZ42和CaHDZ41這3個基因在根、莖、芽、葉、花和果實成熟過程中均不表達。

此外，I亞族中大多數(shù)基因在根、莖、芽、葉和花中的表達程度相差不多。為了更好地了解辣椒HD-Zip及其同源基因之間的表達差異，通過篩選皮爾森相關(guān)系數(shù)（PCC，P＜0.05）顯著共表達基因?qū)Γ瑯?gòu)建了辣椒HD-Zip表達網(wǎng)絡(luò)（圖7）。該網(wǎng)絡(luò)包含35個節(jié)點（基因）和87個邊（調(diào)控關(guān)系），有33對基因表達趨勢PCC大于0.8，6對大于0.9，CaHDZ14/CaHDZ22及CaHDZ07/CaHDZ02之間的PCC達到0.96。雖然在不同組織中表達有強有弱，但具有明顯共表達趨勢。除了正向協(xié)同，另外有9對CaHDZ之間為負調(diào)控關(guān)系。以上結(jié)果表明HD-Zip在調(diào)控植物生長發(fā)育過程中起到了重要的協(xié)同作用，并且不同亞族之間也具有一定的協(xié)同性（圖7）。

圖7 辣椒HD-Zip共表達網(wǎng)絡(luò)Fig.7 Co-expression network of HD-Zip genes in pepper

3 討論

植物轉(zhuǎn)錄因子通過其特有結(jié)構(gòu)域與DNA及其他蛋白或轉(zhuǎn)錄因子間的相互作用，激活或抑制基因的表達來調(diào)控植物正常的生理過程或應(yīng)激反應(yīng)[3]。HD-Zip蛋白是植物界所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，包含4個亞族，而不同亞族的結(jié)構(gòu)域差異又決定了其功能的多樣性[1]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，模式植物擬南芥中的HD-Zip家族成員功能均已被解析，證實不同亞族間確實存在多樣性的功能[1,4,8,12]。但在進化過程中，隨著不同物種經(jīng)歷的不同復(fù)制選擇事件，同源基因發(fā)生不同程度的分化，常見的是產(chǎn)生次功能（Subfunctionalization）、產(chǎn)生新功能（Neofunctionalization）和丟失復(fù)制基因或功能冗余這3種類型[29]。HD-Zip基因家族目前已經(jīng)在多個植物中被詳細鑒定，包括擬南芥[1]、玉米[19]、葡萄[18]、毛果楊[28]等。研究結(jié)果表明該家族成員具有較高的系統(tǒng)發(fā)育相似性，但是在不同物種中表現(xiàn)出不同的時空表達模式，并具有明顯的組織差異性表達，對植物生長發(fā)育的調(diào)控也存在功能分化和冗余的現(xiàn)象。此外，盡管感知同樣的環(huán)境脅迫因子，但是不同成員在同樣的環(huán)境脅迫下的調(diào)控方式并不相同[1,30]。

辣椒基因組經(jīng)歷了快速三倍化擴增[20-21]，給研究重要基因復(fù)制分化提供了很好的基礎(chǔ)。本研究從我國自主選育的辣椒‘遵辣1號’基因組中鑒定獲得42條HD-Zip，在‘CM334’中鑒定得到45條HD-Zip，經(jīng)過FGENESH對基因序列進行手動矯正和重新注釋，最終確定以‘遵辣1號’基因組為主要研究對象。42條HD-Zip中除了1條沒有被錨定在染色體上，剩下41條不均等地分布在辣椒12條染色體上。通過共線性分析，發(fā)現(xiàn)片段復(fù)制是CaHDZ基因家族擴增的主要原因，這和馬鈴薯、擬南芥一致[1,27]。CaHDZ基因家族4個亞族成員的數(shù)目并不均等，I亞族最多且主要集中在2號染色體上，III亞族最少，這和擬南芥中的類似[1]。辣椒中IV亞族發(fā)生了丟失，但在擬南芥中，IV亞族保留的較多。同時，I亞族發(fā)生片段復(fù)制的基因數(shù)量最多，這可能是I亞族基因數(shù)目最多的原因。III亞族基因相對比較穩(wěn)定，并未發(fā)生復(fù)制事件或復(fù)制后丟失。在所選的9個代表物種中，同樣發(fā)現(xiàn)I亞族擴增最為明顯。特別是在茄科植物中，I亞族基因數(shù)目占比達到40%以上。IV亞族基因在被子植物中也發(fā)生了比較明顯的擴增，但在‘遵辣1號’中該亞族基因數(shù)目占比只有24%，發(fā)生了明顯的丟失。III亞族在多個物種中均只有5條基因，相對比較保守。核苷酸差異分析結(jié)果表明III亞族基因內(nèi)部的核苷酸差異確實最小，證明在物種進化過程中III亞族基因的選擇壓力比較小，因此基因也比較保守；而剩下3個亞族核苷酸差異較大，特別是I亞族，且差異比較分散?？梢酝茰y在進化過程中這3個亞族的基因，具有較大的選擇壓力，更容易進化出新的功能[29,31]。通過不同亞族之間的差異來看，I和II亞族親緣關(guān)系最近，其次是III和IV亞族。由此推測I和II亞族、III和IV亞族可能分別從相同的祖先分化而來，或者IV亞族是從III亞族分化而來。

基因結(jié)構(gòu)是研究基因功能和進化的重要依據(jù)，本研究詳細分析了辣椒HD-Zip基因家族的結(jié)構(gòu)特征和保守結(jié)構(gòu)域。辣椒HD-Zip同一亞族的基因，其結(jié)構(gòu)相似。從外顯子數(shù)目來看，I亞族最少，III亞族最多，這和玉米[19]、毛果楊[28]等一致。III和IV亞族基因長度顯著長于I和II組，證明其有更加復(fù)雜的結(jié)構(gòu)特征，保守結(jié)構(gòu)域分析也印證了這一點。I和II亞族基因的保守結(jié)構(gòu)域基本只包含了特有的HD和Zip結(jié)構(gòu)域，而III和IV保守基序更加復(fù)雜。III亞族中還包含START、SAD和MEKHLA結(jié)構(gòu)域，而IV亞族則包含START和SAD結(jié)構(gòu)域[1,8,12]，這與前人研究一致[1,6,13]。此外，III和IV亞族中的START和SAD結(jié)構(gòu)域在兩組間并不完全保守，而在亞族內(nèi)部很保守，可能在功能上也具有不同的表達模式。

辣椒HD-Zip存在明顯的組織差異性表達，I亞族差異最為明顯，而III亞族差異最小。這也證實了上面的推測，I亞族確實發(fā)生了明顯的功能分化，在不同物種中可能參與更多的代謝與發(fā)育過程[4]。I亞族基因在黃瓜中可以響應(yīng)多種環(huán)境信號[32]，煙草NaHD20可以調(diào)控花的發(fā)育[33]，蒺藜苜蓿中HB1在一定條件下可誘導(dǎo)其在初生根和側(cè)根中表達[34]。在辣椒中，發(fā)現(xiàn)I亞族基因在莖中表達的基因最多，且表達量最大，特別是CaHZD22在莖中具有最高的表達，證明該類基因?qū)苯非o的發(fā)育起到重要作用。此外，CaHZD18在根中表達量最大，CaHZD12和CaHZD22在花中表達量最大，CaHZD12和CaHZD07在果實成熟前期表達量最大，CaHZD18和CaHZD20在果實成熟后期有較大表達量，證明該亞族基因?qū)苯返男螒B(tài)建成和果實發(fā)育具有重要的作用。雖然辣椒I亞族發(fā)生了明顯的功能分化，但和擬南芥直系同源相比，仍具有一定的功能相似性，ATHB1、ATHB3、ATHB16和ATHB20[4-5,35-36]參與葉片生長發(fā)育過程，CaHZD15、14和40在葉片中具有較高的表達量，可能參與了葉發(fā)育過程。辣椒中III亞族基因變化趨勢并不顯著，說明在不同組織發(fā)育和果實發(fā)育過程中功能分化并不明顯。通過和擬南芥中同源基因相比也具有一定的相似性，擬南芥該組基因主要在植物發(fā)育過程和維管發(fā)育中起作用[8]，辣椒中該基因也在植物組織中特別是莖中具有高表達。另外，辣椒的II和IV亞族基因也發(fā)生了不同程度分化，雖然HD-Zip在辣椒中發(fā)生了明顯的表達分歧，但其仍有一定的共表達趨勢，證明其在調(diào)控植物生長發(fā)育過程中起到了重要的協(xié)同作用。此外，為維護植物的正常生長發(fā)育，同一家族基因會存在一些抑制性表達調(diào)控。

4 結(jié)論

本研究在辣椒中共鑒定到42條HD-Zip，根據(jù)進化關(guān)系和結(jié)構(gòu)特征分為4個亞族，不同亞族的基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守結(jié)構(gòu)域及表達模式不同；CaHZD不均等地分布在12條染色體上，并有多個基因發(fā)生了片段復(fù)制；在進化歷程中，CaHZD保守性高，數(shù)目沒有明顯倍增，III亞族最為保守，I和II亞族、III和IV亞族親緣關(guān)系更近；CaHZD具有明顯的組織差異性表達，協(xié)同調(diào)控了辣椒的生長發(fā)育。