梅花鹿激活素A重組蛋白真核表達(dá)、純化及其生物活性的測(cè)定

張宇飛，曹滿園，王麗英，趙偉剛，李曉霞，常彤，許保增

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130112）

0 引言

【研究意義】激活素（Activins）是TGF-β家族的33個(gè)成員之一，其最初被確認(rèn)為垂體FSH產(chǎn)生和釋放的激活劑[1-2]。然而，激活素的生物學(xué)作用眾多且非常復(fù)雜，其在胚胎發(fā)育的早期到終末分化的細(xì)胞和組織中發(fā)揮著多種生物作用[3]。此外，激活素也被證明可以促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟同時(shí)對(duì)體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞有促進(jìn)增殖的作用[3-7]。梅花鹿（Cervus nippon）是我國(guó)東北地區(qū)一種重要的特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，對(duì)其激活素的生殖生物學(xué)功能進(jìn)行研究，將對(duì)深入了解梅花鹿卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的機(jī)制、建立高效的卵母細(xì)胞體外成熟體系、提高梅花鹿的繁殖效率和養(yǎng)殖效益等具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在哺乳動(dòng)物的卵巢內(nèi)表達(dá)的Activin基因有兩種，分別是βA亞基基因和βB亞基基因，因此它們可以產(chǎn)生3種激活素異構(gòu)體，激活素A（由βA和βA組成），激活素B（由βB和βB組成）和激活素AB（由βA和βB組成）。激活素A及其I型和II型受體在早期卵泡中表達(dá)，并可以通過(guò)自分泌或旁分泌機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育[4]。抑制素α-亞單位（Inhibin α-subunits,INHα）基因敲除小鼠顯示激活素的過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致卵巢腫瘤的發(fā)生，這充分表明激活素可促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖[5]。此外，激活素受體II基因敲除小鼠表現(xiàn)出卵泡發(fā)育停滯且不孕[6-7]。激活素除了在卵母細(xì)胞成熟和顆粒細(xì)胞增殖中的作用之外，大量研究發(fā)現(xiàn)激活素還充當(dāng)卵巢類(lèi)固醇生成的調(diào)節(jié)劑。在體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞中，激活素A可以促性腺激素刺激的細(xì)胞色素P450芳香化酶（芳香酶）活性和雌二醇的生成，同時(shí)抑制黃體酮的分泌[8-9]。在體外培養(yǎng)的卵泡膜細(xì)胞中，激活素A抑制LH誘導(dǎo)的雄激素產(chǎn)生[10]。在體外培養(yǎng)的黃體細(xì)胞中，激活素A抑制LH誘導(dǎo)的黃體酮合成[11-12]。在大多數(shù)組織中，激活素A通過(guò)結(jié)合兩種類(lèi)型的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體（Act RⅠ和Act RⅡ）啟動(dòng)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[13-14]。激活素A與其受體Act RⅡ結(jié)合后，Act RⅡ被激活，活化的Act RⅡ募集Act RⅠ并與之結(jié)合形成復(fù)合體，同時(shí)磷酸化了Act RⅠ的抑制性結(jié)構(gòu)域 GS（富含絲/蘇氨酸殘基），進(jìn)而活化Act RⅠ?；罨腁ct RⅠ促使Smad 2、3蛋白 C 端的絲氨酸殘基磷酸化，磷酸化后的Smad 2、3蛋白與Smad 4結(jié)合形成復(fù)合體并移位到細(xì)胞核內(nèi)，并與靶基因的啟動(dòng)子互相結(jié)合，從而調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[8,15]。這也是目前激活素A研究最為廣泛的一條信號(hào)通路?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】 激活素A在調(diào)控顆粒細(xì)胞擴(kuò)增和顆粒細(xì)胞介導(dǎo)的動(dòng)物繁殖生理中具有重要作用。因此，本研究對(duì)體外轉(zhuǎn)錄并純化的梅花鹿激活素A在卵巢顆粒細(xì)胞的生物學(xué)功能進(jìn)行了研究，以確定本研究獲得的激活素A具有生物活性?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)克隆了梅花鹿激活素βA（Activin βA，ACTBA）亞基基因，并成功構(gòu)建了pcDNA4/ACTBA重組表達(dá)質(zhì)粒，并在CHO細(xì)胞中表達(dá)。采用Western blot方法對(duì)表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行驗(yàn)證后，進(jìn)行分離純化，同時(shí)對(duì)其生物活性進(jìn)行了測(cè)定。旨在探索梅花鹿激活素A的表達(dá)及純化的基本條件，同時(shí)研究體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞中類(lèi)固醇合成酶基因在激活素A處理下的轉(zhuǎn)錄水平變化情況，為后續(xù)深入研究梅花鹿Activin A在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的生物學(xué)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

本試驗(yàn)于2017年6月至2018年4月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與樣品的采集

試驗(yàn)動(dòng)物梅花鹿來(lái)源于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所茸鹿實(shí)驗(yàn)基地。在2016年10月通過(guò)手術(shù)法活體摘除梅花鹿卵巢組織放入液氮中運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，放置于超低溫冰箱內(nèi)保存。

豬卵巢來(lái)源于吉林省長(zhǎng)春市東旭屠宰場(chǎng)。將從屠宰場(chǎng)收集的母豬卵巢放在加有抗生素、溫度在35—37℃生理鹽水的保溫瓶中快速帶到實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑

DMEM-F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素從HyClone公司購(gòu)買(mǎi)；胎牛血清從Gibco公司購(gòu)買(mǎi)；PrimeSTAR HS高保真DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript One Script RT-PCR Kit Ver.2）從大連寶生物工程有限公司購(gòu)買(mǎi)；RNA提取試劑盒從天根生化科技（北京）有限責(zé)任公司購(gòu)買(mǎi)；凝膠回收、質(zhì)粒小提試劑盒、去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒從康為世紀(jì)有限責(zé)任公司購(gòu)買(mǎi)；pEASY-Blunt Simple Cloning Vector平端克隆載體、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞從北京全式金生物技術(shù)有限公司購(gòu)買(mǎi)；T4 DNA 連接酶從Promega公司購(gòu)買(mǎi)；核酸染料（Super GelRed Nucleic Acid Gel Stain，10 000× in DMSO）從蘇州宇恒生物科技有限公司購(gòu)買(mǎi)；限制性?xún)?nèi)切酶、Lipofectamine?LTX、pcDNA4/myc-His真核表達(dá)載體從Thermo Scientific 公司購(gòu)買(mǎi)；Ni-NTA Spin Kit試劑盒從QIAGEN公司購(gòu)買(mǎi)。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)牛ACTBA的mRNA預(yù)測(cè)序列（No.NM_174363.2），利用Primer 5.0軟件，在ACTBA基因CDS區(qū)域設(shè)計(jì)1對(duì)可以擴(kuò)增梅花鹿的ACTBA基因完整開(kāi)放閱讀框的引物（預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小1 290 bp）。引物為：上游引物（ACTBA-F）：5′-GCTGCCAGGAT GCCCTTG-3′，下游引物（ACTBA-R）：5′- GCTCTATG AGCAACCACACTC -3′。同時(shí)利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)用于構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒的引物。引物為:上游引物（P4-ACTBA-F）：5′-CGGGATCCCGATAATGGCC TTGCTCTGGC-3′，下游引物（P4-ACTBA-R）：5′-CGG AATTCTGAGCAACCACACTCC-3′。引物在上海生工生物公司合成。

1.4 總RNA的提取

利用RNA提取試劑盒提取梅花鹿卵巢組織總RNA，利用分光光度計(jì)和1.0%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的純度及完整性。利用PrimeScript One Script RT-PCR Kit Ver.2反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 梅花鹿ACTBA基因的擴(kuò)增

以上述cDNA為模板，使用引物ACTBA-F、ACTBA-R和PrimeSTAR HS高保真DNA聚合酶，按常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系50 μL：5X PrimeSTAR Buffer 10 μL；dNTP Mixture（2.5 mmol·L-1each）4 μL；上游引物ACTBA-F 1 μL；下游引物ACTBA-R 1 μL；梅花鹿卵巢組織cDNA 2 μL；PrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U·μL-1）1 μL；ddH2O 31 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃ 變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸2 min，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6 梅花鹿ACTBA基因克隆載體的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收?；厥蘸蟮哪康幕蚱魏蚿EASY-Blunt Simple Cloning Vector平端克隆載體進(jìn)行連接。然后將連接產(chǎn)物加入50 μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，最后將菌液均勻涂布在含有Kanamycin的LB固體培養(yǎng)基上，放入37℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)過(guò)夜培養(yǎng)。用PCR法鑒定出連接成功的陽(yáng)性克隆后，送到上海生工生物公司測(cè)序。同時(shí)應(yīng)用MEGA4軟件對(duì)測(cè)序得到的梅花鹿ACTBA基因序列和GenBank已經(jīng)登陸的12種物種的參考序列進(jìn)行比較、分析同時(shí)繪制進(jìn)化樹(shù)[16-18]。

1.7 pcDNA4/ACTBA真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以上述質(zhì)粒pEASY-ACTBA為模板，使用引物P4-ACTBA-F、P4-ACTBA-R和PrimeSTAR HS高保真DNA聚合酶，按常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收。將純化后的P4-ACTBA基因與真核表達(dá)載體pcDNA4/myc-His同時(shí)利用限制性?xún)?nèi)切酶BamH I和Hind III進(jìn)行雙酶切，經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收?；厥蘸蟮腜4-ACTBA基因片段和經(jīng)同樣雙酶切的真核表達(dá)載體pcDNA4/myc-His進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物加入50 μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化。隨機(jī)挑取15株單克隆菌落，用PCR法鑒定陽(yáng)性克隆菌落。提取陽(yáng)性克隆菌的重組質(zhì)粒。用PCR法、BamH I和Hind III單雙酶切鑒定連接正確后將菌液送到上海生工生物公司測(cè)序。測(cè)序鑒定插入載體的目的基因方向及讀碼框完全正確后用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度及純度，-20℃貯存?zhèn)溆?。所得到的重組真核表達(dá)質(zhì)粒命名為pcDNA4/ACTBA。

1.8 pcDNA4/ACTBA在CHO細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)并鑒定

CHO細(xì)胞系在含10% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基中，于37℃、5%的CO2孵箱中培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染的前一天將5×106個(gè)細(xì)胞接種到直徑為60 mm的一次性培養(yǎng)皿內(nèi)。待CHO細(xì)胞匯合度為70%—80%時(shí)（大約24 h后），按照Lipofectamine? LTX試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA4/ACTBA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。同時(shí)設(shè)轉(zhuǎn)染pcDNA4/myc-His空質(zhì)粒的細(xì)胞為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染48 h后，使用兔抗His標(biāo)簽多克隆抗體對(duì)轉(zhuǎn)染重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA4/ACTBA、pcDNA4/myc-His的CHO細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光及Western blot鑒定。

1.9 梅花鹿激活素A純化

pcDNA4/ACTBA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞12 h后，用ExpiCHO? Expression Medium繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，4℃、10 000×g離心10 min，收集并保存上清液。根據(jù)Ni-NTA Spin Kit說(shuō)明書(shū)，用含10 mmol·L-1咪唑的平衡液NPI-10（不含1%Igepal?CA-630）平衡Ni-NTA離心柱。以890×g（約2 900 r/min）離心2 min。將含有梅花鹿激活素A的細(xì)胞培養(yǎng)液加入預(yù)先平衡的Ni-NTA離心柱上。以270×g（約1 600 r/min）離心5 min。用600 μL緩沖液NPI-20（含20 mmol·L-1咪唑）洗滌Ni-NTA離心柱兩次。分別以890×g（約2 900 r/min）離心2 min。最后用300 μL Buffer NPI-500（含500 mmol·L-1咪唑）將蛋白質(zhì)洗脫兩次。以890×g（約2 900 r/min）離心2 min，并收集洗脫液。用Western blot 法鑒定蛋白純化。

1.10 梅花鹿激活素A生物活性的測(cè)定

1.10.1 豬卵丘顆粒細(xì)胞的培養(yǎng) 將采集到的母豬卵巢，用含有雙抗的滅菌生理鹽水沖洗5 次，洗凈卵巢上的血污，裝入大燒杯并用37℃的滅菌生理鹽水淹沒(méi)后帶入無(wú)菌室。用滅菌紗布拭干卵巢表面，選取直徑＞2 mm的卵泡，用10 mL注射器配10號(hào)針頭抽取卵泡液。將收集的卵泡液置于37℃水浴中靜置5—10 min，棄去上清液。將沉淀用撿卵液反復(fù)清洗3—5次后在光鏡下使用拉制好的玻璃吸管撿出卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體。將撿出來(lái)的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體放入1.5 mL離心管內(nèi)，通過(guò)反復(fù)吹打脫落顆粒細(xì)胞，置于離心管內(nèi)以2 000 r/min 離心5 min。用含有10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1硫酸鏈霉素和1X GlutaMAX的DMEM-F12細(xì)胞培養(yǎng)液將顆粒細(xì)胞吹打混勻后，接種到60 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，同時(shí)利用玻璃吸管撿出所有卵母細(xì)胞并棄掉。最后置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

在豬卵丘顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%左右時(shí)，將培養(yǎng)基更換為低血清培養(yǎng)基（含有0.5%胎牛血清），繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h。然后在低血清培養(yǎng)基中加入外源性重組的梅花鹿激活素A（25 ng·mL-1）處理細(xì)胞24 h。然后用RT-qPCR和Western blot檢測(cè)芳香化酶、StAR和P450等類(lèi)固醇激素激素合成關(guān)鍵基因的mRNA和蛋白水平。

1.10.2 熒光定量PCR 將外源性重組的梅花鹿激活素A（25 ng·mL-1）處理的豬卵丘顆粒細(xì)胞以及對(duì)照組的豬卵丘顆粒細(xì)胞用冷的PBS清洗后，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA。然后利用PrimeScript One Script RT-PCR Kit Ver.2反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以正常豬卵丘顆粒細(xì)胞cDNA為模板，使用表1中的引物和PrimeSTAR HS高保真DNA聚合酶，按常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收?；厥蘸蟮哪康幕蚱魏蚿MD19-T克隆載體進(jìn)行連接。用PCR法鑒定出連接成功的陽(yáng)性克隆后，送到上海生工生物公司測(cè)序[14]，篩選出特異性的引物后進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：12.5 μL FS Universal SYBR Green Master（ROX）、0.5 μL上游引物（10 μmol·L-1）、0.5 μL下游引物（10 μmol·L-1）、2 μL cDNA（1 ng·μL-1）樣品和9.5 μL Nuclease-Free H2O。熒光定量PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性30 s、60℃退火及延伸30 s，45個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)的退火及延伸階段采集熒光信號(hào)數(shù)據(jù)。擴(kuò)增結(jié)束后立即進(jìn)行熔解曲線分析，根據(jù)熔解曲線判斷反應(yīng)的特異性，根據(jù)每個(gè)樣品的Ct值，用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)試驗(yàn)樣品設(shè)置3次重復(fù)，同是有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

表1 引物序列與real-time PCR 反應(yīng)參數(shù)Table 1 Primers sequences and real-time PCR amplification parameters

1.10.3 Western blot檢測(cè)Smad信號(hào)通路 在豬卵丘顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%左右時(shí)，將培養(yǎng)基更換為低血清培養(yǎng)基（含有0.5%胎牛血清），繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h。然后在低血清培養(yǎng)基中加入外源性重組的梅花鹿激活素A（25 ng·mL-1）處理細(xì)胞2 h。將外源性重組的梅花鹿激活素A（25 ng·mL-1）處理的豬卵丘顆粒細(xì)胞以及對(duì)照組的豬卵丘顆粒細(xì)胞用冷的PBS清洗后，按照M-PER ? Mammalian試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總蛋白。蛋白上樣量為30 μg，濃縮膠的電泳電壓為90 V，時(shí)間30 min，分離膠的電泳電壓為120 V，時(shí)間為75 min。轉(zhuǎn)膜電壓為90 V，時(shí)間為80 min。用TBST稀釋的5%BSA室溫振蕩封閉1 h。本研究中使用的一抗信息見(jiàn)表2。最佳稀釋比例的一抗在4℃冰箱孵育過(guò)夜，TBST 洗滌3次，每次10 min，再加入用5%BSA稀釋的HRP標(biāo)記的二抗（表2），37℃孵育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min，最后用ECL顯影。

1.11 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件One-way ANOVA進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果用平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差（SEM）表示，P＜0.05時(shí)判為差異顯著，P＞0.05時(shí)判為差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 梅花鹿ACTBA基因的擴(kuò)增

RT-PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物分別經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，在約1 290 bp處有一明顯擴(kuò)增條帶,與預(yù)期的目的基因ACTBA大小一致（圖1）。

2.2 真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA4/ACTBA的構(gòu)建與鑒定

構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pcDNA4/ACTBA，經(jīng)PCR、BamH I單酶切、BamH I和Hind III雙酶切鑒定結(jié)果顯示（圖2）pcDNA4/ACTBA質(zhì)粒構(gòu)建成功，然后進(jìn)一步進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，結(jié)果顯示插入pcDNA4/myc-His的ACTBA基因的讀碼框架和插入方向均正確。

表2 抗體信息表Table 2 Antibody information table

2.3 ACTBA基因核苷酸序列及氨基酸序列分析

將梅花鹿ACTBA基因核苷酸與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的8個(gè)代表性物種的ACTBA基因序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)梅花鹿ACTBA基因與牛的ACTBA基因同源性最高達(dá)98.4%，與豬的ACTBA基因同源性達(dá)92.2%（圖3）。同時(shí)我們應(yīng)用MEGA4軟件對(duì)20種不同動(dòng)物的ACTBA基因的氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這20種動(dòng)物的ACTBA基因的氨基酸序列形成6個(gè)明顯不同的大分支。其中偶蹄目（反芻獸以及豬）、奇蹄目、肉食目、靈長(zhǎng)目和嚙齒目等動(dòng)物各占一個(gè)大分支，這說(shuō)明ACTBA基因在不同物種間是非常保守的。我們克隆的梅花鹿ACTBA基因處于偶蹄目反芻動(dòng)物的小分支內(nèi)，其中梅花鹿ACTBA基因與牛的親緣關(guān)系最近，豬的ACTBA基因次之（圖4）。

2.4 ACTBA基因在CHO細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)

圖4 ACTBA基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.4 Analysis of phylogenetic tree based on the ACTBA gene

將重組質(zhì)粒pcDNA4/ACTBA和對(duì)照空載體pcDNA4/myc-His轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞48 h后進(jìn)行免疫熒光染色。結(jié)果在熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pcDNA4/ACTBA質(zhì)粒的CHO細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)有大量的紅色熒光顯現(xiàn)，細(xì)胞核內(nèi)沒(méi)有紅色熒光分布（圖5-A3）；然而轉(zhuǎn)染pcDNA4/myc-His空質(zhì)粒的細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)沒(méi)有紅色熒光（圖5-B3）。表明ACTBA在CHO細(xì)胞中表達(dá)后，主要分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。將轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA4/ACTBA和對(duì)照空載體pcDNA4/myc-His 48 h后的CHO細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blot鑒定，結(jié)果（圖6）發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA4/ACTBA的CHO細(xì)胞在45 kD處有一條特異的條帶，這與梅花鹿激活素A的bate A亞基大小一致。然而轉(zhuǎn)染空載體pcDNA4/myc-His的CHO細(xì)胞沒(méi)有條帶。

2.5 梅花鹿激活素A蛋白純化及鑒定

圖5 ACTBA在CHO細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)Fig.5 Transient expressions of ACTBA gene in CHO cells (×200)

圖6 Western blot檢測(cè)重組質(zhì)粒在CHO細(xì)胞中表達(dá)Fig.6 Western blot detected the expression of recombinant plasmid in the cells of CHO

利用無(wú)血清CHO表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)了梅花鹿激活素A，結(jié)果顯示梅花鹿激活素A條帶明顯，大小一致，約26 kD（圖7）。同時(shí)利用His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化梅花鹿激活素A，然后利用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)體外表達(dá)梅花鹿激活素A的蛋白含量為15 ng·μL-1。利用His 標(biāo)簽抗體對(duì)純化后的梅花鹿激活素A進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用非還原性SDS-PAGE上樣緩沖液變性的梅花鹿激活素A所得目的條帶有兩條，大小約為58和26 kD這與預(yù)期梅花鹿激活素A的大小一致（圖8-A）。使用還原性SDS-PAGE上樣緩沖液變性的梅花鹿激活素A所得目的條帶有兩條，大小約為45 kD和13 kD這與預(yù)期梅花鹿激活素A的大小一致（圖8-B）。體外表達(dá)的梅花鹿激活素A有兩條目的條帶主要是因?yàn)?，它包含了前體蛋白和成熟蛋白兩種形式，前體蛋白主要由一分子全長(zhǎng)ACTBA亞單位（約45 kD）和一分子切割后的成熟的ACTBA亞單位（約13 kD）組成。然而成熟的梅花鹿激活素A是由2分子成熟的ACTBA亞單位（約13 kD）組成（圖9）。

圖7 SDS-PAGE檢測(cè)激活素A的表達(dá)Fig.7 SDS-PAGE detected the expression of Activin A

2.6 梅花鹿激活素A可以激活SMAD信號(hào)通路

圖8 Western blot檢測(cè)激活素A的表達(dá)Fig.8 Western blot detected the expression of Activin A

圖9 前體和成熟形式的激活素Fig.9 Precursor and mature forms of Activins

為了檢測(cè)體外表達(dá)純化的梅花鹿激活素A是否具有生物學(xué)活性，我們利用豬顆粒細(xì)胞測(cè)試了體外表達(dá)的梅花鹿激活素A能否激活經(jīng)典的SMAD信號(hào)通路。結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用25 ng·mL-1純化的梅花鹿激活素A處理豬顆粒細(xì)胞60 min后，明顯誘導(dǎo)SMAD2與SMAD3發(fā)生磷酸化（圖10）。

2.7 梅花鹿激活素A對(duì)顆粒細(xì)胞類(lèi)固醇生成的影響

為了進(jìn)一步研究，梅花鹿激活素A在類(lèi)固醇激素生成過(guò)程中的生物學(xué)作用，我們利用純化的梅花鹿激活素A處理豬原代顆粒細(xì)胞24 h后，檢測(cè)芳香化酶（Aromatase）以及StAR（Steroidogenic acute regulatory protein）的mRNA和蛋白質(zhì)水平的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖11）梅花鹿激活素A處理后的豬原代顆粒細(xì)胞芳香化酶的mRNA和蛋白質(zhì)水平均上調(diào)，然而StAR的mRNA和蛋白質(zhì)水平均下調(diào)。

圖10 激活素A對(duì)SMAD信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響Fig.10 The effect of Activins A on the expression of SMAD signal pathway protein

圖11 激活素A對(duì)豬顆粒細(xì)胞Aromatase和StAR表達(dá)量的影響Fig.11 Effects of Activins A on Aromatase and StAR expression in pig granulosa lutein cells

與此同時(shí)我們利用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)了梅花鹿激活素A處理的豬原代顆粒細(xì)胞中P450側(cè)鏈裂解酶（P450 side chain cleavage enzyme,P450scc）、3'-羥基類(lèi)固醇脫氫酶（3'-hydroxysteroid dehydrogenase, 3β-HSD）、FSH和LH的特異性受體（FSHR and LHR）的mRNA水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖12）梅花鹿激活素A處理后的豬原代顆粒細(xì)胞中P450scc與3β-HSD mRNA表達(dá)量不發(fā)生變化，但FSHR基因表達(dá)量升高，LHR基因表達(dá)量降低。

圖12 激活素A對(duì)豬顆粒細(xì)胞細(xì)胞P450scc、3β-HSD、FSHR和LHR表達(dá)量的影響Fig.12 Effects of Activins A on P450scc, 3β-HSD, FSHR and LHR expression in pig granulosa lutein cells

3 討論

激活素A幾乎在動(dòng)物的所有發(fā)育階段，以及各種組織中發(fā)揮廣泛生物學(xué)作用。激活素A在卵巢卵泡發(fā)生以及睪丸精子發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮了重要的自分泌和旁分泌作用。在整個(gè)卵泡發(fā)生過(guò)程中激活素的表達(dá)量呈動(dòng)態(tài)變化，尤其在優(yōu)勢(shì)卵泡選擇階段，激活素A的相對(duì)表達(dá)量顯著增加[5,9,19-20]。在綿羊發(fā)情期，隨著卵泡大小的增加，卵泡液中激活素A濃度降低[11-12]。大量研究發(fā)現(xiàn)激活素A可以增強(qiáng)卵母細(xì)胞的成熟并促進(jìn)體外顆粒細(xì)胞的增殖[21-23]。本研究中，采用了分子克隆技術(shù)構(gòu)建了梅花鹿抑制素βA亞基基因的真核重組質(zhì)粒pcDNA4/ACTBA，體外轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞并制備出具有生物學(xué)活性的梅花鹿激活素A蛋白，對(duì)于深入研究梅花鹿激活素A的生物學(xué)功能至關(guān)重要。

利用無(wú)血清CHO表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)了梅花鹿激活素A?？捡R斯亮藍(lán)染色，結(jié)果顯示梅花鹿激活素A條帶明顯，大小約26 kD。因?yàn)槌墒斓拿坊笰CTBA亞單位約13 kD。然而成熟的梅花鹿激活素A是由2分子成熟的ACTBA亞單位組成約26 kD。利用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化后的梅花鹿激活素A，利用His 標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用非還原性SDS-PAGE上樣緩存液變性的梅花鹿激活素A所得目的條帶有兩條，大小約為58和26 kD。體外表達(dá)的梅花鹿激活素A有兩條目的條帶主要是因?yàn)?，它包含了前體蛋白和成熟蛋白兩種形式，前體蛋白主要由一分子全長(zhǎng)ACTBA亞單位（約45 kD）和一分子切割后的成熟的ACTBA亞單位（約13 kD）組成，約58 kD。然而成熟的梅花鹿激活素A是由2分子成熟的ACTBA亞單位組成約26 kD。使用還原性SDS-PAGE上樣緩沖液變性的梅花鹿激活素A所得目的條帶有兩條，大小約為45和13 kD。由于使用還原性SDS-PAGE上樣緩沖液變性，所以梅花鹿激活素A前體蛋白和成熟蛋白內(nèi)的二硫鍵被打開(kāi)，二聚體變?yōu)閱误w，因此45 kD蛋白為一分子全長(zhǎng)ACTBA亞單位，13 kD蛋白為成熟的ACTBA亞單位。綜上所述，本研究成功體外表達(dá)和純化的梅花鹿激活素A。

激活素A的生物學(xué)作用是由TGF-β家族I型和II型絲氨酸-蘇氨酸激酶受體組成的異四聚體復(fù)合物介導(dǎo)的[24]。首先激活素A結(jié)合激活素IIA型（ACVR2A）或激活素IIB型（ACVR2B）受體后，募集激活素I型受體ActRIB（ALK4）和ActRI（ALK2）并使其絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化[3,14]。然后，活化的ALK受體通過(guò)C末端細(xì)胞質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域磷酸化SMAD 2和SMAD 3蛋白，形成SMAD 2/3復(fù)合物，其與SMAD 4蛋白結(jié)合形成三聚體復(fù)合物。這種復(fù)合物遷移到細(xì)胞核，并與DNA結(jié)合以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。在本研究中，為了證實(shí)體外表達(dá)的梅花鹿激活素A是否具有生物學(xué)活性，利用豬顆粒細(xì)胞測(cè)試了體外表達(dá)的梅花鹿激活素A能否激活經(jīng)典的SMAD信號(hào)通路。結(jié)果發(fā)現(xiàn)純化的梅花鹿激活素A可以誘導(dǎo)豬顆粒細(xì)胞SMAD2與SMAD3發(fā)生磷酸化。這充分說(shuō)明純化的梅花鹿激活素A具有生物學(xué)活性。

除了其在卵母細(xì)胞成熟和顆粒細(xì)胞增殖中的作用外，大量證據(jù)表明激活素A還可作為卵巢類(lèi)固醇生成的調(diào)節(jié)劑。用激活素A處理大鼠和牛顆粒細(xì)胞可以增強(qiáng)細(xì)胞色素P450芳香酶（cytochrome P450 aromatase, P450 arom）活性和雌二醇分泌量，同時(shí)抑制孕酮分泌[9,14,25-26]。在人顆粒細(xì)胞中，激活素A減弱FSH和人絨毛膜促性腺激素（hCG）誘導(dǎo)的類(lèi)固醇激素急性調(diào)節(jié)蛋白（Steroidogenic acute regulatory protein，StAR）mRNA水平，并減少促性腺激素（FSH，LH或hCG）誘導(dǎo)的孕酮產(chǎn)生[27-28]。在本研究中我們對(duì)梅花鹿激活素A在類(lèi)固醇激素生成過(guò)程中的生物學(xué)作用進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)梅花鹿激活素A處理后的豬原代顆粒細(xì)胞P450 arom的mRNA和蛋白質(zhì)水平均上調(diào)，然而StAR的mRNA和蛋白質(zhì)水平均下調(diào)。目前已經(jīng)有大量研究報(bào)道激活素A可以上調(diào)P450 arom，這是由于激活素A活化的SMAD3蛋白可與P450 arom啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，可促進(jìn)P450 arom轉(zhuǎn)錄[14,25,29]。同樣也有研究發(fā)現(xiàn)激活素A可以下調(diào)人顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞中的StAR[18,30-32]。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)梅花鹿激活素A處理后的豬原代顆粒細(xì)胞P450scc與3β-HSD mRNA表達(dá)量不發(fā)生變化，但FSHR基因表達(dá)量升高，LHR基因表達(dá)量降低。這說(shuō)明激活素A可以增強(qiáng)FSH對(duì)顆粒細(xì)胞的生物學(xué)作用，也可以減弱LH對(duì)顆粒細(xì)胞的生物學(xué)作用。

4 結(jié)論

利用CHO無(wú)血清表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出具有生物活性的梅花鹿激活素A的重組蛋白，同時(shí)發(fā)現(xiàn)梅花鹿激活素A在類(lèi)固醇激素生成中具有重要作用，它可以上調(diào)P450 arom的mRNA和蛋白質(zhì)水平，下調(diào)StAR的mRNA和蛋白質(zhì)水平。另外，梅花鹿激活素A可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞FSHR基因的表達(dá)，抑制LHR基因的表達(dá)，表明其可以增強(qiáng)FSH對(duì)顆粒細(xì)胞的生物學(xué)作用，也可以減弱LH對(duì)顆粒細(xì)胞的生物學(xué)作用。