浙江紅山茶CcFAD2基因克隆及其在籽仁發(fā)育中的表達(dá)分析

王仲偉，王 波，董 樂，徐立安，湯詩杰，溫 強(qiáng)，①

〔1. 江西省林業(yè)科學(xué)院 植物生物技術(shù)重點實驗室，江西 南昌 330032；2. 江蘇省中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)，江蘇 南京 210014； 3. 南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037〕

浙江紅山茶(CamelliachekiangoleosaHu)隸屬于山茶科(Theaceae)山茶屬(CamelliaLinn.)紅山茶組〔Sect.Camellia(Linn.) Dyer〕，又名浙江紅花油茶，自然分布于江西東部至西部、浙江南部、福建北部和湖南東部海拔600～1 300 m的山地[1]。浙江紅山茶的種植面積和年產(chǎn)量在具有油用價值的山茶屬種類中居第4位[2]，屬高油酸型山茶屬種類[3]，其籽油率及油質(zhì)普遍高于栽培面積最廣的油茶(CamelliaoleiferaAbel.)[4]，且其油脂的理化指標(biāo)和主要營養(yǎng)成分的綜合評分與南山茶(CamelliasemiserrataChi，又名廣寧紅花油茶)和滇山茶(CamelliareticulataLindl.，又名騰沖紅花油茶)相比也較高，分別為0.892和1.000[5]。植物種子的脂肪酸組成決定油的品質(zhì)和用途[6]。茶油中不飽和脂肪酸主要包括油酸和亞油酸等，具有降低膽固醇和血脂、改善血液流變性及預(yù)防冠心病等功能[7]。油酸是單不飽和脂肪酸，其氧化穩(wěn)定性高于多不飽和脂肪酸亞油酸，且亞油酸含量高會降低茶油的貯藏穩(wěn)定性。近年來，如何提高浙江紅山茶的油酸含量成為品種選育的一個重要方向。

FAD(fatty acid desaturase)基因是重要的脂肪酸脫氫酶基因，按反應(yīng)底物和催化產(chǎn)物可分為催化單不飽和脂肪酸向雙不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化的ω-6型(FAD2和FAD6)和催化三不飽和脂肪酸合成的ω-3型(FAD3、FAD7和FAD8)2大類。Δ12-脂肪酸脫氫酶FAD2催化油酸脫氫形成亞油酸[8]，而FAD6是其質(zhì)體型同工酶[9]。Byfield等[10]研究環(huán)境溫度對大豆〔Glycinemax(Linn.) Merr.〕不同品種種子發(fā)育過程中脂肪酸變化的影響，結(jié)果顯示：環(huán)境溫度差異可造成大豆FAD2-1基因表達(dá)存在差異，從而調(diào)節(jié)油酸與亞油酸含量的變化，其中，低溫下FAD2基因的mRNA水平顯著升高，且與油酸含量呈負(fù)相關(guān)。Chen等[11]研究FAD2基因表達(dá)對歐洲油菜(BrassicanapusLinn.) W-4株系脂肪酸及品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)FAD2基因表達(dá)水平顯著影響種子中脂肪酸的合成和積累，該基因表達(dá)下調(diào)時種子中油酸含量明顯升高，而亞油酸含量顯著降低。這些研究結(jié)果表明通過誘導(dǎo)FAD2基因表達(dá)可引起油料植物中油酸與亞油酸含量的變化，為浙江紅山茶FAD2基因的功能研究提供了借鑒。

浙江紅山茶作為典型的高油酸型油茶樹種，3月開花，9月果熟[12]。目前，已有研究人員從同屬植物油茶中克隆得到2個FAD2家族成員(登錄號分別為KJ995981和JQ739518)[13-14]，林萍等[15]隨后對其進(jìn)行了序列比較和表達(dá)模式分析，并通過表達(dá)載體的構(gòu)建初步分析了其功能。對浙江紅山茶FAD2基因功能進(jìn)行深入研究不僅可為今后定向調(diào)控不飽和脂肪酸的含量和組分奠定基礎(chǔ)，還可為該樹種油質(zhì)改良提供技術(shù)支持。鑒于此，本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[16]克隆得到了浙江紅山茶FAD2基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過分析浙江紅山茶籽仁中油酸與亞油酸相對含量的變化規(guī)律及該基因在籽仁發(fā)育不同階段的表達(dá)模式，為進(jìn)一步闡明浙江紅山茶籽仁中FAD2基因?qū)τ椭煞中纬傻挠绊懱峁┛茖W(xué)依據(jù)，并為通過分子手段選育高油酸含量浙江紅山茶品種奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試浙江紅山茶種植于江西省林木育種中心山茶屬種質(zhì)基因庫(東經(jīng)115°39′36″、北緯28°54′36″，平均海拔30 m)，選擇生長健壯且無病蟲害的同齡成年植株，分別于7月14日(籽仁形成初期)、7月29日(籽仁快速生長期)、8月11日(籽仁快速生長期)、8月25日(籽仁內(nèi)含物充實轉(zhuǎn)化期)、9月9日(籽仁內(nèi)含物充實轉(zhuǎn)化期)和9月23日(籽仁脫水成熟期)進(jìn)行取樣，每次選擇3株，每株取3個果實，鮮果采摘后立即去殼取出籽仁，置于液氮中冷凍帶回，然后置于-80 ℃冰箱中保存、備用。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 稱取浙江紅山茶籽仁發(fā)育過程中不同時間相同質(zhì)量的籽仁，液氮速凍研磨成粉末后，稱取0.3 g，采用改良的CTAB法[17]提取總RNA?？俁NA中的基因組DNA污染利用DNase Ⅰ〔寶生物工程(大連)有限公司〕去除，采用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量，剩余的置于-80 ℃冰箱保存、備用。利用購自寶生物工程(大連)有限公司的3′-Full RACE Core Set Ver.2.0和5′-Full RACE Kit合成cDNA第1鏈。

1.2.2 基因全長的克隆與序列分析 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序獲得的浙江紅山茶FAD2基因的EST序列，設(shè)計特異性引物進(jìn)行巢式PCR(nested PCR)。反應(yīng)體系總體積50.0 μL，包含10×ExTaqBuffer Ⅱ(Mg2+Free)5.0 μL、25 mmol·L-1MgCl24.0 μL、10 mmol·L-1dNTP Mixture(each)4.0 μL、ExTaqDNA Polymerase 0.3 μL、正向和反向引物各2.0 μL、模板cDNA 2.0 μL及ddH2O 30.7 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min，共32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(DP209)〔天根(北京)生化科技有限公司〕回收目的條帶，與pMD19-T載體〔寶生物工程(大連)有限公司〕連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10菌株，選取陽性克隆送南京金斯瑞生物科技公司測序。

使用BioEdit軟件預(yù)測浙江紅山茶FAD2基因全長的開放閱讀框及編碼氨基酸。使用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLASTn(https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行序列相似性比對。使用ProtParam(http：∥web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。使用Pfam(http：∥pfam.xfam.org/)數(shù)據(jù)庫推測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域。使用SinalP(http：∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和TMHMM(http：∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分別預(yù)測蛋白質(zhì)的信號肽及跨膜區(qū)。使用SOPMA工具(http：∥npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。使用I-TASSER(http：∥zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER)預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。使用ClustalX2進(jìn)行氨基酸序列的同源性比對。使用MEGA 5.0中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。使用Wolf PSORT(https：∥wolfpsort.hgc.jp/)預(yù)測亞細(xì)胞定位。

1.2.3 基因表達(dá)分析 采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析FAD2基因在浙江紅山茶籽仁發(fā)育6個階段中的表達(dá)差異。qRT-PCR采用SYBR?PremixExTaqTMⅡ〔寶生物工程(大連)有限公司〕，在ABI 7500 Real-time PCR System(美國ABI公司)上完成，內(nèi)參基因為α-tubulin基因，每個樣品3次重復(fù)。qRT-PCR引物見表1。反應(yīng)體系總體積20.0 μL，包含SYBR?PremixExTaqTMⅡ10.0 μL、正向和反向引物各0.4 μL、模板cDNA 2.0 μL、ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL及ddH2O 6.8 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s、60 ℃退火34 s、95 ℃延伸15 s，共40個循環(huán)。

表1 用于實時熒光定量PCR的引物

1.2.4 籽油提取及主要不飽和脂肪酸含量測定 參照GB/T 14488.1—2008的方法，采用索氏提取法提取浙江紅山茶籽仁的籽油并測定脂肪酸總量，參照GB 5009.168—2016的方法對籽油樣品進(jìn)行甲酯化，參考Zhong等[18]的方法，使用GC2010-Plus 氣相色譜儀(日本島津公司)進(jìn)行檢測。色譜條件：Elite-WAX色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，德國PerkinElmer公司)，進(jìn)樣口溫度220 ℃；FID檢測器，檢測器溫度280 ℃，氮氣流速1.0 mL·min-1，分流比30∶1。升溫程序：初始溫度150 ℃，保持2 min；以10 ℃·min-1升溫至260 ℃，保持10 min。通過與脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品(10 mg·mL-1，CDAB-O83811AMP，上海安譜實驗科技股份有限公司)對比鑒別油酸和亞油酸。采用峰面積歸一化法[19]計算油酸和亞油酸的相對含量。每組實驗3次重復(fù)，每個重復(fù)測定2次，結(jié)果取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用EXCEL 2007和SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果和分析

2.1 基因克隆及序列分析

根據(jù)浙江紅山茶全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中注釋為FAD2基因的部分序列信息設(shè)計引物，克隆得到的CcFAD2基因(登錄號KC342951)全長1 482 bp(圖1)，開放閱讀框長度為1 149 bp，編碼383個氨基酸，5′UTR(非翻譯區(qū))和3′UTR長度分別為141和189 bp(圖2)。BLASTn比對結(jié)果顯示：CcFAD2基因與油茶CoFAD2基因(登錄號JQ739518)的相似性最高，達(dá)98%。CcFAD2基因編碼的氨基酸序列在105～110、141～145和315～319位具有3個保守的組氨酸簇，分別是HECGHH、HRRHH和HVAHH。

M： DNA標(biāo)記DNA marker； 1： CcFAD2基因CcFAD2 gene.

下劃線分別示起始密碼子ATG和終止密碼子TGA The underlines show initiation codon ATG and termination codon TGA，respectively； 方框示保守的組氨酸簇The boxes show conservative histidine clusters.

2.2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析及亞細(xì)胞定位預(yù)測

浙江紅山茶CcFAD2蛋白的理論相對分子質(zhì)量為44 240，理論等電點為pI 8.43，無信號肽，具有4個跨膜結(jié)構(gòu)域(圖3)，分別位于55～77、82～104、178～200和250～272位。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示：CcFAD2蛋白包含44.39%的α螺旋、11.49%的延伸鏈、3.92%的β折疊和40.21%的無規(guī)卷曲。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果(圖4)顯示：CcFAD2蛋白的C值為-2.19(C值在-5.00～2.00之間，C值越大，預(yù)測結(jié)果越可靠)，具有32個配體結(jié)合位點。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示：CcFAD2蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。

： 跨膜區(qū)Transmembrane； ： 膜內(nèi)Inside； ： 膜外Outside.

圖4 浙江紅山茶CcFAD2蛋白的三級結(jié)構(gòu)

2.3 同源性比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

對浙江紅山茶CcFAD2蛋白與其他8種油料植物FAD2蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對，結(jié)果(圖5)顯示：浙江紅山茶CcFAD2蛋白與其他油料植物FAD2蛋白的氨基酸序列存在高度的保守性，均存在3個保守的組氨酸簇。根據(jù)比對結(jié)果，排除缺口位置，構(gòu)建浙江紅山茶CcFAD2蛋白與其他8種油料植物FAD2蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖6)，結(jié)果顯示：浙江紅山茶CcFAD2蛋白與油茶CoFAD2蛋白(登錄號AFK31315)先聚為一亞組，再與油橄欖(OleaeuropaeaLinn.)OeFAD2蛋白(登錄號AAW63041)聚為一組，說明三者的遺傳關(guān)系較近；蓖麻(RicinuscommunisLinn.)RcFAD2蛋白(登錄號NP001310648)、亞麻(LinumusitatissimumLinn.)LuFAD2蛋白(登錄號AGJ01133)、大豆GmFAD2蛋白(登錄號BAD89862)和芝麻(SesamumindicumLinn.)SiFAD2蛋白(登錄號XP011080227)4種草本油料植物與麻瘋樹(JatrophacurcasLinn.)JcFAD2蛋白(登錄號AEW43690)和油桐〔Verniciafordii(Hemsl.) Airy Shaw〕VfFAD2蛋白(登錄號AEE69021)聚為另一組。

Jc： 麻瘋樹Jatropha curcas Linn.； Vf： 油桐Vernicia fordii (Hemsl.) Airy Shaw； Rc： 蓖麻Ricinus communis Linn.； Lu： 亞麻Linum usitatissimum Linn.； Gm： 大豆Glycine max (Linn.) Merr.； Si： 芝麻Sesamum indicum Linn.； Cc： 浙江紅山茶Camellia chekiangoleosa Hu； Co： 油茶Camellia oleifera Abel.； Oe： 油橄欖Olea europaea Linn. 下劃線示保守的組氨酸簇The underlines show conservative histidine clusters.

Jc： 麻瘋樹Jatropha curcas Linn.； Vf： 油桐Vernicia fordii (Hemsl.) Airy Shaw； Rc： 蓖麻Ricinus communis Linn.； Lu： 亞麻Linum usitatissimum Linn.； Gm： 大豆Glycine max (Linn.) Merr.； Si： 芝麻Sesamum indicum Linn.； Cc： 浙江紅山茶Camellia chekiangoleosa Hu； Co： 油茶Camellia oleifera Abel.； Oe： 油橄欖Olea europaea Linn.

2.4 浙江紅山茶籽仁中脂肪酸含量及CcFAD2基因表達(dá)的分析

浙江紅山茶籽仁發(fā)育過程中脂肪酸含量及CcFAD2基因表達(dá)見圖7。結(jié)果顯示：隨著浙江紅山茶籽仁的發(fā)育，脂肪酸總量先穩(wěn)步上升，成熟后略有下降。在籽仁發(fā)育過程中，油酸和亞油酸的相對含量差異明顯。7月14日(籽仁形成初期)油酸相對含量最低，7月29日(籽仁快速生長期)油酸相對含量升高，之后一直處于較高的水平。亞油酸相對含量在籽仁形成初期最高，達(dá)到13.8%，之后顯著降低，且趨于穩(wěn)定。

同一指標(biāo)中不同小寫字母表示在不同時間差異顯著(P<0.05)Different lowercases of the same index indicate the significant (P<0.05) difference among different times.

實時熒光定量PCR結(jié)果顯示：在浙江紅山茶籽仁發(fā)育過程中，CcFAD2基因均有表達(dá)。CcFAD2基因的相對表達(dá)量在籽仁形成初期最高，顯著高于其他時期，之后迅速降低，相對表達(dá)量維持在較低水平且差異不顯著。

3 討論和結(jié)論

浙江紅山茶是中國南方地區(qū)集觀賞和油用于一身的重要木本油料樹種。茶油中含有多種脂肪酸，主要包括棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸等，其中，油酸和亞油酸占80%以上[3]，食用保健價值較高。油酸較亞油酸少1個不飽和鍵，不易氧化變質(zhì)，且在烹飪中產(chǎn)生的油煙少，因此，提高油酸含量、降低亞油酸含量是浙江紅山茶品質(zhì)改良和良種選育的熱點之一。

已有研究結(jié)果顯示：FAD2基因是控制油酸含量的主要基因[20-21]，且在高等植物中常以多拷貝的形式存在，構(gòu)成了FAD2基因家族[22-23]。本研究克隆得到浙江紅山茶CcFAD2基因，該基因與油茶CoFAD2基因(登錄號JQ739518)[14]的相似性最高(98%)，符合同一屬的分類定位，但與油茶FAD2基因家族另一成員(登錄號KJ995981)[13]的差異較大。林萍等[15]認(rèn)為，油茶2個FAD2基因均具有1個脂肪酸去飽和酶結(jié)構(gòu)域，屬于脂酰-脂去飽和酶基因家族，二者編碼的蛋白質(zhì)均為跨膜蛋白，本研究中浙江紅山茶CcFAD2基因與之結(jié)構(gòu)類似，符合FAD2基因的典型特征[8，24-25]，也驗證了本研究中CcFAD2序列的正確性。

浙江紅山茶CcFAD2蛋白與其他8種油料植物FAD2蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示：FAD2蛋白的氨基酸序列在不同植物中較保守，浙江紅山茶與同為木本油料植物的油茶和油橄欖聚為一組，而與草本油料植物間區(qū)別相對較大。浙江紅山茶和油茶同屬于山茶科山茶屬，茶油組分相似，含量各異[4]，親緣關(guān)系近，但與不同科屬的油橄欖也聚為一組，推測前兩者與油橄欖的OeFAD2蛋白在進(jìn)化上分歧時間較短，可能存在平行進(jìn)化的關(guān)系，最終形成相似的油脂品質(zhì)[26]。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示：CcFAD2蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。油茶中CoFAD2-1蛋白也主要定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜[27]，與二者序列相近、結(jié)構(gòu)類似、功能一致相符。

多種植物種子脂肪酸累積模式顯示：脂肪酸含量總體呈先上升后小幅度下降的變化趨勢，推測隨著種子成熟，種子含水量不斷降低，脂肪酸合成逐漸停止，而種子內(nèi)含物中其他成分(如蛋白質(zhì)和部分單糖)的合成需要消耗部分油脂，最終導(dǎo)致種子含油量下降[28-30]。生產(chǎn)上可以根據(jù)該趨勢確定采種時間，降低脂肪酸的損耗，提高種子出油率。本研究中，浙江紅山茶籽仁中的脂肪酸總量隨著籽仁發(fā)育進(jìn)程逐步增加，成熟后略有下降，亞油酸相對含量在籽仁形成初期較高到籽仁趨于成熟時下降且趨于穩(wěn)定，但作為主要成分的油酸則呈現(xiàn)先升高然后略有降低的變化趨勢，該結(jié)果可以為確定浙江紅山茶合適的采種時間提供依據(jù)。綜合CcFAD2基因的相對表達(dá)量和脂肪酸含量，CcFAD2基因的表達(dá)模式與亞油酸相對含量的變化規(guī)律基本吻合，說明浙江紅山茶籽仁發(fā)育中后期油酸的合成速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于油酸轉(zhuǎn)化為亞油酸的速率，油茶的相關(guān)研究也得到了類似結(jié)果[31-32]，這從側(cè)面驗證了CcFAD2基因在浙江紅山茶籽仁發(fā)育過程中的功能。本研究結(jié)果顯示：浙江紅山茶CcFAD2基因影響籽仁中油酸和亞油酸的比例，這為浙江紅山茶品質(zhì)改良和分子輔助育種提供了候選研究對象。此外，浙江紅山茶是二倍體油茶樹種，開花結(jié)實期短，脂肪酸組分優(yōu)于油茶，將來可以作為油茶油脂改良基因工程育種的模式物種進(jìn)一步深入研究CcFAD2基因的功能。