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    小反芻獸疫病毒F基因的序列分析

    2018-12-05 02:03:26周海寧王晶鈺
    動物醫(yī)學進展 2018年11期
    關(guān)鍵詞:登錄號獸疫核苷酸

    周海寧,尹 才,馬 龍,王晶鈺

    (1.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院,陜西楊凌 712100;2.寧夏動物疾病預(yù)防控制中心,寧夏銀川 750011)

    小反芻獸疫(Peste des petits ruminants,PPR)是由小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病,能夠感染山羊、綿羊和野生小反芻獸等動物,以發(fā)熱、口腔及舌黏膜糜爛、流淚、流鼻液、腹瀉和肺炎等癥狀為主要特征[1]。

    PPRV為有囊膜的多形性單股負鏈RNA病毒,含有15 948個核苷酸。該基因共編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白和2種非結(jié)構(gòu)蛋白[2]。其中6種結(jié)構(gòu)蛋白依次為N蛋白、M蛋白、P蛋白、L蛋白,還有2種外部蛋白F和H,這兩種蛋白可在感染后激起機體保護反應(yīng)。

    PPRV F基因與所有副黏病毒一樣,其翻譯產(chǎn)物F0蛋白無活性,蛋白裂解后產(chǎn)生的F1和F2才具有活性[3]。研究顯示,PPRV-F基因編碼的融合蛋白(F蛋白)是決定病毒感染細胞的關(guān)鍵,具有誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞溶血素、促進細胞融合以及啟動病毒感染細胞等生物學活性。當前,PPR尚無有效治療方式,主要通過早期診斷和疫苗免疫的方式進行控制。有研究顯示,F(xiàn) 蛋白在麻疹病毒屬中是主要的保護性免疫原,能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體[4]。另有研究報道,不同地區(qū)來源PPRV-F基因毒株譜系不同,通過對F基因核苷酸序列進行分析,可以為該病毒在不同地理區(qū)域間的傳播途徑提供線索[5-6]。因此,本研究以寧夏地區(qū)采集的疑似PPR的病料為研究對象,提取樣品RNA,RT-PCR擴增PPRV-F基因,通過分子鑒定驗證該病料是否為PPRV陽性;同時,通過對本研究獲得的F基因進行生物信息學分析,闡明寧夏感染的PPRV的譜系以及F蛋白的分子特征,為進一步探索該病毒在不同地理區(qū)域間的傳播情況,研究該基因的功能,制備亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 病料 本試驗所用病料由寧夏動物疾病預(yù)防控制中心于2016年采集。該病料來源于寧夏回族自治區(qū)銀川市西夏區(qū)某發(fā)病山羊養(yǎng)殖場,根據(jù)臨床癥狀及剖檢變化,初步判斷為小反芻獸疫疑似病例,采集該發(fā)病山羊淋巴結(jié)、肝、脾臟等組織帶回實驗室,置-70℃保存。

    1.1.2 主要試劑 Trans Script one-step RT-PCR Super MIX購自全式金生物技術(shù)有限公司;病毒RNA提取試劑盒購自蘇州天隆科技有限公司;核酸分子標準購自北京天根生化科技有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 PPRV總RNA的提取 取2 mg發(fā)病羊組織樣本,加入石英砂,用無菌無核酶研缽充分研磨,加入無核酶PBS(pH7.4),制成1∶5~1∶10懸液,液氮反復(fù)凍融3次,8 000 r/min離心2 min,取上清液備用。用RNA提取試劑盒提取上清液樣品中病毒總RNA,具體步驟參考試劑盒說明書。提取的總RNA測定濃度及純度,置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中公布的Kurdistan株P(guān)PRV-F基因序列(登錄號:KF648287),用Primer Premier 5軟件設(shè)計1對引物,其中上游引物(F-f)為:5′-ATGACACGGGTCGCAATCTTGA-3′;下游引物(F-r)為:5′-CTACAGTGATCTCACGTACGAC-3′。預(yù)期擴增的片段大小1 641 bp,引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成,用dd H2O按10 pmol/μL稀釋,置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.3 PPRV-F基因的RT-PCR擴增 以PPRV總RNA為模板,使用TransScript one-step RT-PCR SuperMix進行一步法RT-PCR擴增。反應(yīng)體系如下:在20 μL的反應(yīng)體系中加入2×One-Step Reaction Mix 10 μL,TransScript One-Step Enzyme Mix 0.4 μL,10 pmol/μL上、下游引物各0.4 μL,RNA模板2 μL,加滅菌水水補至20 μL。反應(yīng)條件:45℃反轉(zhuǎn)錄20 min;94℃ 5 min;94℃ 30 s,54℃ 40 s,72℃ 90 s,35個循環(huán);72℃終延伸10 min。產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳,觀察和記錄結(jié)果。將目的條帶切膠回收純化后,送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進行測序。

    1.2.4 PPRV-F基因的核苷酸序列分析 將獲得的序列,輸入到GenBank數(shù)據(jù)庫中進行同源性比較(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi),驗證獲得的病料是否為PPRV陽性樣品。

    1.2.5 PPRV-F基因進化樹分析 從GenBank中下載不同毒株的PPRV-F基因序列,具體如下:China Fu Yang株(登錄號:MF443335)、China GD株(登錄號:MF443352)、China HeN株(登錄號:MF443347)、China SC株(登錄號:MF443338)、China Tibet株(登錄號:EU364809)、China XJYL株(登錄號:KM091959)、Mongolia株(登錄號:KY888168)、China ZJ株(登錄號:MF443335)、China XJBZ株(登錄號:KT633939.1)、China Tibet株(登錄號:EU364809.1)、Morocco(登錄號:KC609746.1)、Kurdistan(登錄號:KF648287.1)、India(登錄號:KF752444.1)、Netherlands(登錄號:KJ867542.1)、India(登錄號:GQ410435.1)、India(登錄號:JN632534.1)、Nigeria(登錄號:HQ197753.1)、Benin(登錄號:KR781450.1)、Ghana(登錄號:KJ466104.1)、Nigeria(登錄號:EU267274.1)、west Africa(登錄號:KP789375.1)、Cote dlvire(登錄號:EU267273.1)、Uganda(登錄號:KJ867543.1)、Kenya(登錄號:KM463083.1)、Oman(登錄號:KJ867544.1)、UAE(登錄號:KJ867545.1)。用MAGA 5.1構(gòu)建PPRV-F基因進化樹,分析本試驗獲得的樣品與其他地區(qū)分離株的親緣關(guān)系。

    1.2.6 PPRV-F基因編碼氨基酸序列分析及F蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測 應(yīng)用生物信息學方法,通過網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器對PPRV-F基因編碼的蛋白進行分析,其中包括氨基酸序列分析:SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/),ExPASY(http://web.expasy.org/protparam/);信號肽預(yù)測:(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/);跨膜區(qū)預(yù)測:(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/);抗原性預(yù)測:(http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl);二級結(jié)構(gòu)預(yù)測:Jpred3(http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred);三級結(jié)構(gòu)預(yù)測:Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)。

    2 結(jié)果

    2.1 樣品PPRV-F基因的RT-PCR擴增

    提取本中心獲得的疑似PPRV陽性樣品RNA,以此為模板,經(jīng)一步法RT-PCR擴增,獲得PPRV-F基因,經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析,片段大小約為1 600 bp,與預(yù)期的結(jié)果相符,初步證明本次獲得的病料為PPRV陽性樣品(圖1)。

    M.DNA標準DL 2 000;1~2.樣品RT-PCR擴增產(chǎn)物

    M.DNA Marker DL 2 000; 1-2.RT-PCR amplification products of PPRV samples

    圖1樣品PPRV-F基因RT-PCR擴增結(jié)果

    Fig.1 The results of PPRV-F gene amplification by RT-PCR

    2.2 PPRV-F基因核苷酸序列分析

    將PCR擴增為陽性的條帶經(jīng)膠回收純化以后,進行測序。所獲得的序列,經(jīng)測序大小為1 641 bp,將序列輸入到NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對,發(fā)現(xiàn)與Kurdistan株(登錄號:KF648287.1)F基因核苷酸的同源性為97%,進一步證實本實驗室獲得的病料為PPRV陽性樣品。

    2.3 不同毒株P(guān)PRV-F基因同源性分析

    將寧夏獲得的PPRV-F基因與GenBank下載的不同毒株的PPRV-F基因進行核苷酸同源性分析。結(jié)果顯示,寧夏獲得的PPRV-F基因與ChinaZJ(MF443335.1)、ChinaSC(MF443338.1)、ChinaHeN(MF443347.1)、ChinaGD(MF443352.1)和ChinaXJYL(KM091959.1)等毒株同源性高達99.6%,與Mongolia株(KY888168.1)同源性高達99.3%,與ChinaXJBZ株(KT633939.1)同源性為98.1%;與我國所用疫苗株Nigeria75/1株(HQ197753.1)同源性僅為92.8%(圖2)。

    圖2 PPRV-F基因核苷酸同源性分析

    2.4 不同毒株P(guān)PRV-F基因系統(tǒng)進化分析

    從GenBank下載不同毒株的PPRV-F基因序列,與本試驗獲得的PPRV-F基因一起構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果表明,寧夏獲得的PPRV-F基因與中國其他省份分離的8個毒株及印度、蒙古等國報道的7個毒株在同一個分支上,同屬譜系Ⅳ(圖3)。

    2.5 PPRV-F基因編碼的氨基酸序列分析及F蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

    利用SMART和ExPASY進行在線分析PPRV-F基因編碼的氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)該基因編碼546個氨基酸,分子質(zhì)量為59.2 ku,理論等電點(pI)為8.71;不穩(wěn)定系數(shù)是36.6,小于閾值40,屬于穩(wěn)定蛋白,脂肪系數(shù)109.98,總平均疏水指數(shù)0.201。SignalP4.0在線預(yù)測分析表明,PPRV-F蛋白有信號肽存在,為分泌型蛋白(圖4)。TMHMM2.0預(yù)測分析表明,F(xiàn)蛋白有跨膜區(qū)(圖5)。Jpred 3(http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred)在線分析發(fā)現(xiàn),PPRV F蛋白的二級結(jié)構(gòu)中α螺旋(H)占43.22%,β折疊(E)占20.5%,無規(guī)則卷曲占36.26%(圖6)。Phyre2三級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明,PPRV-F蛋白與其他麻疹病毒屬成員融合蛋白結(jié)構(gòu)相似(圖7)。

    3 討論

    PPR多流行于非洲和亞洲,并且在一些新的地區(qū)不斷有該病的報道[7],嚴重威脅養(yǎng)殖業(yè),造成巨大的經(jīng)濟損失。該病于1942年首次在科特迪瓦暴發(fā),目前已擴散到亞洲、非洲的40余個國家。近年來,小反芻獸疫逐漸跨越地理屏障,擴散趨勢不斷上升,我國周邊國家,如阿富汗、印度、尼泊爾等也都有PPR流行的報道[8]。2007年,我國西藏地區(qū)發(fā)生第一起PPR疫情,2008年-2010年在西藏先后3次發(fā)生PPR疫情[9-10]。

    圖3 PPRV-F基因的系統(tǒng)進化樹

    圖4 PPRV-F蛋白的信號肽預(yù)測結(jié)果

    從2013年底開始,國內(nèi)20多個省份先后暴發(fā)了小反芻獸疫疫情,給養(yǎng)羊業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[11-13]。2014年,寧夏出現(xiàn)首例PPR疫情[14],2016年再發(fā)生一起輸入型PPR疫情,在處置該疫情的過程中,通過發(fā)病山羊的臨床癥狀及剖檢變化初步判定為PPR感染,但仍需通過分子生物學檢測進行進一步驗證。本中心將發(fā)病山羊的病料帶回實驗室,置-70℃保存?zhèn)溆?。本試驗以該疑似PPR樣品為試驗材料,提取樣品RNA,經(jīng)一步法RT-PCR擴增,成功獲得PPRV-F基因,大小為1 641 bp,編碼546個氨基酸,分子質(zhì)量大約為59.2ku,這與趙文姬報道的西藏分離株特性相一致[15]。

    圖5 PPRV-F蛋白的跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果

    圖6 PPRV-F蛋白的二級結(jié)構(gòu)示意圖

    研究發(fā)現(xiàn),對PPRV-F基因核苷酸序列進行分析,不同地區(qū)來源毒株譜系不同。其中Ⅰ系主要來源塞內(nèi)加爾和尼日利亞的毒株,Ⅱ系為幾內(nèi)亞和科特迪瓦的毒株,Ⅲ系主要包括埃塞俄比亞、也門、蘇丹毒株,Ⅳ系均為亞洲毒株[16]。通過對F基因核苷酸序列進行分析,可以為該病毒在不同地理區(qū)域間的傳播情況提供線索[17-18]。本試驗獲得的寧夏PPRV-F基因與國內(nèi)其他省份報道的F基因序列高度同源,并且同屬譜系Ⅳ,系統(tǒng)進化樹分析顯示,該基因與我國其他地區(qū)分離到的PPRV毒株及印度、蒙古等國7個毒株在同一個分支上,與之前的報道相符[19-21]。

    當前應(yīng)用在PPR防控計劃中的小反芻獸疫疫苗為弱毒苗,免疫效果有效。但是,弱毒苗無法鑒別免疫抗體和野毒感染抗體,這在一定程度上影響了疫病的診斷。在疫病的有效防控和非疫區(qū)申報過程中,疫病暴發(fā)后的血清學檢測是一種重要的手段,為了便于血清學監(jiān)測,疫苗免疫后的同步檢測是關(guān)鍵。因此,盡管現(xiàn)在的弱毒苗可以有效的預(yù)防該病,但是為了便于血清學的監(jiān)測,標記疫苗更有發(fā)展前景。PPRV-F蛋白可幫助病毒進入宿主細胞,可促使病毒囊膜和細胞膜融合。一旦病毒結(jié)合到宿主細胞的靶位,F(xiàn)蛋白就調(diào)節(jié)病毒膜和細胞膜的融合性,并允許釋放的N蛋白進入細胞漿。在病毒感染過程中,新合成的F蛋白可使細胞間發(fā)生融合,具有很好的候選疫苗潛力[19-21]。當前已經(jīng)有學者通過基因工程手段去除了該基因的信號肽和跨膜區(qū),構(gòu)建了該基因的原核表達質(zhì)粒,并獲得了表達,表達的蛋白具有良好的免疫原性[22-23],但是并未對該蛋白做進一步的研究,因此下一步擬研究蛋白的生物學功能,為研制基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。

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