王不留行治療尿路感染有效部位篩選及其對(duì)膀胱IL-1β的影響

毛鑫 徐玉輝 姚榮妹

摘要 目的：篩選王不留行治療尿路感染的有效部位，并研究有效部位對(duì)膀胱組織IL-1β的影響。方法：選用SD大鼠，以膀胱注射大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 25922）的方法建立尿路感染模型，大鼠造模后給予王不留行醇溶部位及醇沉部位，給藥5 d后通過(guò)檢測(cè)尿液中的細(xì)菌數(shù)及膀胱組織病理學(xué)染色評(píng)價(jià)其有效性;取有效部位給藥后的膀胱組織，檢測(cè)組織中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）mRNA及蛋白的表達(dá)。結(jié)果：王不留行醇沉部位可明顯降低大鼠尿液細(xì)菌陽(yáng)性率，減輕膀胱組織炎性浸潤(rùn)，可明顯降低大鼠膀胱組織中IL-1β mRNA及蛋白的表達(dá)。王不留行醇沉部位的主要成分為多糖。結(jié)論：王不留行多糖提取物為其治療尿路感染的有效部位。

關(guān)鍵詞 尿路感染;王不留行;多糖;白細(xì)胞介素-1β;大腸桿菌;膀胱炎;有效部位;水提醇沉

Abstract Objective：To screen the effective parts of Vaccaria segetalis in the treatment of urinary tract infection，and and to study the effects of effective parts on IL-1β of bladder tissue.Methods：SD rats were used to inject the standard strain of Escherichia coli（ATCC 25922）into the bladder to establish a urinary tract infection model.After the rats were modeled，they were given the alcohol-soluble part and the alcohol-precipitated part of Vaccaria segetalis.The number of bacteria in urine and histopathological staining of the bladder were detected to evaluate its effectiveness; the bladder tissue after administration of the effective part was taken to detect the expression of interleukin-1β（IL-1β）mRNA and protein in the tissue.Results：Vaccaria segetalis′s alcohol precipitation site can significantly reduce the positive rate of urine bacteria in rats，and the inflammatory infiltration of bladder tissue，and can significantly reduce the expression of IL-1β mRNA and protein in rat bladder tissue.The main component of Vaccaria segetalis′s alcohol precipitation site is polysaccharide.Conclusion：Vaccaria segetalis polysaccharide extract is an effective part of treating urinary tract infection.

Keywords Urinary tract infection; Vaccaria segetalis; Polysaccharide; Interleukin-1β; Escherichia coli; Cystitis; Effective part; Water extraction and alcohol precipitation

中圖分類(lèi)號(hào)：RR285.5;R242 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.20.005

尿路感染（Urinary Tract Infections，UTIs）是臨床常見(jiàn)的細(xì)菌感染性疾病，大腸桿菌是引起的UTIs最主要的病原體，其感染占總病例的80%以上[1-2]。臨床上治療UTIs首選抗生素療法，近年來(lái)隨著抗生素濫用，大腸桿菌的耐藥菌基因（特別是超廣譜β內(nèi)酰胺酶類(lèi)ESBLs）不斷傳播，導(dǎo)致臨床一線抗生素的治療效果大打折扣[3-4]。因此尋找抗生素的替代療法成為目前研究的熱點(diǎn)。

傳統(tǒng)中藥王不留行是來(lái)源于石竹科植物麥藍(lán)菜Vaccaria segetalis（Neck.）Garcke的干燥成熟種子，具有活血通經(jīng)、下乳消腫、利尿通淋之功效，臨床可用于治療血瘀經(jīng)閉、乳汁不下以及淋癥澀痛等癥[5]。早期研究[6]發(fā)現(xiàn)，王不留行的提取物在大鼠和小鼠體內(nèi)可以改善良性前列腺增生的癥狀，而前列腺增生屬于中醫(yī)理論的“窿閉”和“淋證”[7]。本課題組根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)，從同屬于中醫(yī)“淋證”范疇的UTIs入手，進(jìn)一步完善王不留行治療“淋證”的科學(xué)內(nèi)涵。通過(guò)對(duì)王不留行治療UTIs的有效部位進(jìn)行篩選，從而為王不留行治療UTIs的新藥開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 王不留行醇沉部位（SVCP）：淺咖啡色粉末（批號(hào)：1107）;王不留行醇溶部位（SVE）：深棕色粉末（批號(hào)：1107）。阿莫西林（陽(yáng)性藥）（哈藥集團(tuán)制藥總廠，批號(hào)：A1611005）。

1.1.2 動(dòng)物 SD大鼠，SPF級(jí)，雄性，130只，體質(zhì)量180～200 g，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0004。實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地為中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所ABSL-2生物安全實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)中所有操作均遵循NIH及北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的規(guī)定。

1.1.3 細(xì)菌 大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 25922），購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)ATCC，由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所ABSL-2生物安全實(shí)驗(yàn)室傳代，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 試劑 LB培養(yǎng)基（北京索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)：20171209）;水合氯醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20151217）;麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（北京索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)：20170915）;Trizol（Ambion公司，美國(guó)，批號(hào)：149105）;RIPA裂解液（上海碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：033018180409），BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號(hào)：PLL-2016-05），SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20180613），超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：012618180413）;一步法RT-PCR檢測(cè)試劑盒（Takara Bio公司，日本，批號(hào)：AH97893A）。

白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）蛋白抗體（Abcam公司，英國(guó)，貨號(hào)：ab9722）;β-actin蛋白抗體（Proteintech公司，美國(guó)，貨號(hào)：6008-1-Ig）;辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（Proteintech公司，美國(guó)，貨號(hào)：SA00001-2）;辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體（Proteintech公司，美國(guó)，貨號(hào)：SA00001-1）

1.1.5 引物 引物由北京科奧鼎盛生物科技有限公司合成，IL-1β基因上游：TCGTGCTGTCTGACCCATGT;IL-1β基因下游：AGGCCACAGGGATTTTGTCG;β-actin基因上游：TATCCTGGCCTCACTGTCCA;β-actin基因下游：AAGGGTGTAAAACGCAGCTC。

1.1.6 儀器 生物安全柜（Thermo公司，美國(guó)，型號(hào)：A2）;電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，德國(guó)，型號(hào)：BSA3202S-CW）;低溫高速離心機(jī)（Eppendorf公司，德國(guó)，型號(hào)：5810R），多功能酶標(biāo)儀（PerkinElmer公司，德國(guó)，型號(hào)：Enspire）;化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（Proteinsimple公司，美國(guó)，型號(hào)：FluorChem FC3）;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Applied Biosystems，美國(guó)，型號(hào)：ABI7500）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 SD大鼠130只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性藥阿莫西林組（0.18 g/kg）、SVCP 5個(gè)劑量組（0.1 g/kg、0.2 g/kg、0.4 g/kg、0.8 g/kg、1.6 g/kg）、SVE 5個(gè)劑量組（0.1 g/kg、0.2 g/kg、0.4 g/kg、0.8 g/kg、1.6 g/kg），每組10只。大鼠禁食水過(guò)夜后，每只大鼠按照1 mL/100 g腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉。麻醉后暴露膀胱，除正常組同等條件下向膀胱注射生理鹽水外，其余各組向膀胱內(nèi)注入0.3 mL大腸桿菌菌液（1×108 CFU/mL），縫合腹壁切口。

1.2.2 給藥方法 手術(shù)后3 h開(kāi)始按照1 mL/100 g體質(zhì)量灌胃給藥，連續(xù)給藥4 d，正常組和模型組同等條件下給與蒸餾水。給藥4 d后麻醉大鼠，無(wú)菌條件下抽取膀胱液并摘取膀胱組織，把0.1 mL穿刺液接種于麥康凱培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，觀察記錄菌落生長(zhǎng)情況，記錄陽(yáng)性率。

1.2.3 HE染色方法 取膀胱組織使用10%福爾馬林固定，48 h后取出流水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，切片，HE染色，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察大鼠膀胱組織有無(wú)病理形態(tài)學(xué)改變，每個(gè)膀胱組織取2個(gè)視野，進(jìn)行組間比較。

病理分級(jí)：“-”：大鼠膀胱漿膜面未見(jiàn)有炎性反應(yīng)、水腫，黏膜面移行上皮未見(jiàn)有病變，肌層未見(jiàn)炎性反應(yīng)、腫脹，結(jié)構(gòu)正常?！?”：大鼠膀胱漿膜面未見(jiàn)有明顯炎性反應(yīng)、水腫，黏膜面上皮未見(jiàn)有明顯病變，肌層下有輕度瘀血?！?+”：大鼠膀胱漿膜面未見(jiàn)有明顯炎性反應(yīng)，背膜有輕度增厚;黏膜面移行上皮有輕度移行性變，黏膜有局限性輕度炎性反應(yīng)，以淋巴細(xì)胞、中性細(xì)胞為主，有輕度瘀血?！?++”：大鼠膀胱漿膜面有炎性浸潤(rùn)，以中性細(xì)胞為主，組織有腫脹，血管內(nèi)有瘀血;黏膜面、移行上皮有退行性變，細(xì)胞變小，并有空泡變。黏膜下大面積炎性反應(yīng)、瘀血，組織有腫脹。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè) 取膀胱組織，Trizol法提取總RNA。使用一步法RT-PCR檢測(cè)試劑盒，按說(shuō)明書(shū)要求配制反應(yīng)體系加入八聯(lián)管，放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，按試劑盒說(shuō)明設(shè)置反應(yīng)條件：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)（95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s），并開(kāi)始檢測(cè)。

1.2.5 Western blot檢測(cè) 取膀胱組織，RIPA裂解提取總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白含量并調(diào)平濃度，SDS-PAGE凝膠分離并轉(zhuǎn)膜后依次孵育一抗和二抗，顯色后于化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白信號(hào)，檢測(cè)結(jié)果使用imageJ軟件分析灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Ct經(jīng)過(guò)2-△△Ct處理。陽(yáng)性率比較采用Chi-Square test，病變分級(jí)比較采用Mann-Whitney test，其余采用Unpaired t test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 王不留行對(duì)尿液細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果的影響 正常組中尿液細(xì)菌培養(yǎng)未見(jiàn)陽(yáng)性結(jié)果，大鼠膀胱灌注大腸桿菌后第5天，模型組中尿液菌培養(yǎng)均為陽(yáng)性，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明模型建立成功。王不留行醇沉組1.6 g/（kg·d）劑量給藥4天后尿液細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率為40%，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。其余各組與模型組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 王不留行對(duì)膀胱組織病理表現(xiàn)的影響 正常大鼠的膀胱組織未見(jiàn)明顯病變，采用大腸桿菌感染大鼠5 d后，模型組大鼠膀胱病變明顯，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;灌胃給藥，治療4 d后，王不留行醇沉部位各劑量組膀胱病變均明顯減輕，與模型對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01或P<0.05），王不留行醇溶部位各劑量組膀胱病變無(wú)明顯減輕，與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在給藥過(guò)程中，醇溶部位顯示出一定毒性表現(xiàn)，1 600 mg/kg、800 mg/kg、200 mg/kg組各死亡小鼠4只、1只、2只。見(jiàn)圖1，表2。

2.3 王不留行醇沉部位對(duì)膀胱組織IL-1β表達(dá)的影響 大腸桿菌感染SD大鼠后，膀胱組織的IL-1β mRNA以及蛋白明顯高表達(dá)，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。王不留行醇沉部位400 mg/kg劑量可明顯抑制IL-1β mRNA以及蛋白的表達(dá)，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)圖2、圖3。

3 討論

本文驗(yàn)證了王不留行對(duì)于大腸桿菌感染引起的UTIs具有明顯的治療效果，可以抑制細(xì)菌在尿液的增殖，并且抑制膀胱組織病理?yè)p傷。王不留行治療UTIs的活性部位為其醇沉部位。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，王不留行醇沉部位的成分主要是多糖類(lèi)化合物，王不留行多糖具有抗氧化和抑制良性前列腺增生的作用[5，8-9]。

作為抵御細(xì)菌感染的第一道細(xì)胞防線，泌尿道上皮表達(dá)多種模式識(shí)別受體，參與識(shí)別細(xì)菌感染的模式識(shí)別受體主要是Toll樣受體[10]。Toll樣受體識(shí)別大腸桿菌的脂多糖以及鞭毛蛋白后激活下游通路，從而導(dǎo)致NF-κB以及促炎因子如IL-1β、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和白細(xì)胞介素-8（IL-8）等基因的激活[11]。在UTIs患者的尿液及血清中同樣可以檢測(cè)到IL-1β，IL-6以及IL-8升高[12]。促炎因子一方面可以促進(jìn)免疫細(xì)胞的趨化作用，另一方面會(huì)引起組織的炎性損傷[13]。本研究檢測(cè)了IL-1β的變化，可見(jiàn)王不留行多糖可以有效抑制其在膀胱組織的表達(dá)，從而抑制膀胱組織損傷，這與膀胱組織病理染色結(jié)果一致。

多糖類(lèi)成分通常不具有直接的殺菌和抑菌作用，但是仍能表現(xiàn)出有效的抗感染作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)多糖具有免疫調(diào)節(jié)的作用，也有研究發(fā)現(xiàn)多糖可以通過(guò)抑制細(xì)菌黏附從而抑制其感染[14-15]。王不留行多糖抑制UTIs可能的機(jī)制為抑制膀胱組織免疫反應(yīng)，但是否具有其他作用機(jī)制還需要更進(jìn)一步研究。總體來(lái)說(shuō)，本研究發(fā)現(xiàn)王不留行多糖提取物為其治療UTIs的有效部位，完善了王不留行治療“淋證”中醫(yī)理論的科學(xué)內(nèi)涵，并為王不留行治療UTIs的新藥開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]Flores-Mireles AL，Walker JN，Caparon M，et al.Urinary tract infections：epidemiology，mechanisms of infection and treatment options[J].Nature Reviews Microbiology，2015，13（5）：269-284.

[2]Whiteside SA，Razvi H，Dave S，et al.The microbiome of the urinary tract—a role beyond infection[J].Nature Reviews Urology，2015，12（2）：81-90.

[3]McDanel J，Schweizer M，Crabb V，et al.Incidence of extended-spectrum β-lactamase（ESBL）-producing Escherichia coli and Klebsiella infections in the United States：a systematic literature review[J].infection control & hospital epidemiology，2017，38（10）：1209-1215.

[4]Merino I，Hernández-García M，Turrientes M C，et al.Emergence of ESBL-producing Escherichia coli ST131-C1-M27 clade colonizing patients in Europe[J].Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2018，73（11）：2973-2980.

[5]鐘贛生.中藥學(xué)[M].北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2016：284.

[6]Zhang H，Jing Y，Wu G.Inhibitory effects of crude polysaccharides from semen vaccariae on benign prostatic hyperplasia in mice[J].Journal of ethnopharmacology，2013，145（2）：667-669.

[7]陳廣輝，陳兵，孫大林.良性前列腺增生癥中醫(yī)研究進(jìn)展[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2015，10（7）：1033-1036.

[8]李蕓達(dá)，顏?zhàn)娴?，黃濤，等.王不留行多糖的提取工藝及其抗氧化活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2015，27（3）：446-450.

[9]李青，潘再良，吳潔，等.王不留行多糖提取工藝研究及其含量測(cè)定[J].食品工業(yè)科技，2014，35（12）：299-302.

[10]Ko Y H，Choi J Y，Song P H.Host-Pathogen Interactions in Urinary Tract Infections[J].Urogenital Tract Infection，2019，14（3）：71-79.

[11]McLellan L K，Hunstad D A.Urinary tract infection：pathogenesis and outlook[J].Trends in molecular medicine，2016，22（11）：946-957.

[12]Masajtis-Zagajewska A，Nowicki M.New markers of urinary tract infection[J].Clinica chimica acta，2017，471：286-291.

[13]Mantovani A，Dinarello C A，Molgora M，et al.Interleukin-1 and related cytokines in the regulation of inflammation and immunity[J].Immunity，2019，50（4）：778-795.

[14]Bernardi A，Jiménez-Barbero J，Casnati A，et al.Multivalent glycoconjugates as anti-pathogenic agents[J].Chemical Society reviews，2013，42（11）：4709-4727.

[15]Tang C，Ding R，Sun J，et al.The impacts of natural polysaccharides on intestinal microbiota and immune responses-a review[J].Food & function，2019，10（5）：2290-2312.

（2019-05-21收稿 責(zé)任編輯：芮莉莉）