補骨脂二氫黃酮甲醚調控Gamma delta T細胞消減胃癌SGC-7901研究

丁欽 吳克儉 鄭璐

摘要 目的：探討補骨脂二氫黃酮甲醚調控γδT細胞消減胃癌SGC-7901程度。方法：獲取人外周血中單個核細胞，體外擴增γδT細胞，不同濃度BVC誘導γδT細胞、SGC-7901細胞24 h、48 h和72 h，CCK-8檢測BVC對γδT細胞增殖率、SGC-7901抑制率影響;流式細胞術測γδT細胞GZMB、PF、CD107a產生量;LDH法測γδT細胞消減SGC-7901程度。結果：體外擴增8 d，γδT細胞比例由3.54%增至85.34%。與對照組比較，BVC誘導24 h，濃度10～80 nmol/L促進γδT細胞增殖（P<0.05）。BVC誘導48 h、72 h，濃度5～80 nmol/L促進γδT細胞增殖（P<0.05）。同樣濃度，72 h γδT細胞增殖率最大。BVC作用腫瘤細胞24 h、48 h、72 h，濃度160～640 nmol/L SGC-7901生長抑制率高于對照組（P<0.05），濃度10～40 nmol/L，GZMB、PF、CD107a表達高于對照組（P<0.05）。BVC誘導γδT細胞72 h，一定濃度該T細胞消減SGC-7901程度隨濃度增高而增高，濃度40 nmol/L消減程度最大，后呈下降趨勢。結論：BVC適宜濃度促進γδT細胞增殖，抑制SGC-7901生長，加強γδT細胞消減SGC-7901程度，機制考慮：PF、GZMB、CD107a表達提高增強γδT細胞消減能力。

關鍵詞 補骨脂二氫黃酮甲醚;γδT細胞;胃癌;SGC-7901;殺傷活性;顆粒酶B;穿孔素;CD107a

Abstract Objective：To investigate the regulation of psoralen dihydroflavonoid methyl ether to reduce the degree of gastric cancer SGC-7901 by γδT cells.Methods：Human peripheral blood mononuclear cells was obtained，γδ T cells in vitro was expanded，γδ T cells and SGC-7901 cells with different concentrations of BVC for 24 h，48 h and 72 h were induced.CCK-8 detected the effect of BVC on the proliferation rate of γδ T cells and SGC inhibition rate; flow cytometry was used to measure the production of GZMB，PF，CD107a in γδ T cells; LDH method was used to measure the degree of γδ T cell depletion SGC-7901.Results：After 8 days of in vitro expansion，the proportion of γδT cells increased from 3.54% to 85.34%.Compared with the control group，BVC was induced for 24 h at a concentration of 10 to 80 nmol/L to promote the proliferation of γδT cells（P<0.05）.BVC was induced 48 h，72 h，with the concentration of 5 to 80 nmol/L promoting the proliferation of γδT cells（P<0.05）.At the same concentration，72 h γδT cell proliferation rate was the highest.BVC acted on tumor cells for 24 h，48 h，72 h，with a concentration of 160-640 nmol/L.The growth inhibition rate of SGC-7901 was higher than that of the control group（P<0.05），with a concentration of 10-40 nmol/L.GZMB，PF and CD107 expression was higher than the control group（P<0.05）.As for BVC induced γδ T cells for 72 h，the degree of depletion of SGC-7901 at a certain concentration of T cells increased with the increase of the concentration.The degree of depletion of SGC-7901 at a concentration of 40 nmol/L was the largest and then showed a downward trend.Conclusion：The appropriate concentration of BVC promotes the proliferation of γδ T cells，inhibits the growth of SGC-7901，and strengthens the degree of depletion of SGC-7901 by γδ T cells.The mechanism is considered：the expression of PF，GZMB，and CD107a increase and enhance the depletion ability of γδ T cells.

Keywords Psoralen dihydroflavonoid methyl ether; γδT cells; Gastric cancer; SGC-7901; Killing activity; Granzyme B; Perforin; CD107a

中圖分類號：R735.2 文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.20.007

目前中國正面臨著人口老齡化的挑戰(zhàn)和快速城市化的影響，癌癥的發(fā)病率也隨之增加[1]。胃癌在亞洲東部、歐洲東部以及美國熱帶南部等地區(qū)具有特別高的發(fā)病率[2]。胃癌患病率高，但療效不佳，欠缺有效的治療措施。目前，腫瘤免疫治療得到了長足的進步，為該類患者遠期療效帶來了根本性變化[3]。γδT細胞是一種能夠表達抗原受體的免疫細胞，γδT細胞參與的抗腫瘤免疫治療主要是通過分泌促凋亡分子和炎性反應細胞因子或者通過TCR依賴性途徑，對多種癌細胞產生強烈的細胞毒性，從而在免疫監(jiān)視和針對腫瘤的免疫防御中的起到重要作用[4]。甲基補骨脂黃酮是由補骨脂提取的某種化合物，具有消減腫瘤、調整免疫等多種療效[5]，補骨脂二氫黃酮甲醚（BVC）對HepaRG、HCT-116、PC-3等多種細胞具有抗增殖作用[6-7]。2014年，Chen X等[8]發(fā)現(xiàn)BVC能促使Th2向Th1飄移，進而發(fā)揮調節(jié)免疫作用。為此，我們假設其可能同樣能夠調控γδT細胞的免疫能力以及抗癌的效果，同時初探其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 將已復蘇的胃癌SGC-7901細胞株用GT-T551H3培養(yǎng)基予以懸浮，每瓶15 mL加入75 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)，每2～3天更換腫瘤細胞培養(yǎng)液，待細胞鋪滿80%左右的瓶底時，釆用0.25%的胰蛋白酶予以脫壁，待細胞懸浮完成后收取細胞，予以計數(shù)后用于后續(xù)相關實驗。

1.1.2 藥物 補骨脂二氫黃酮甲醚（Bavachinin，大連美侖生物技術公司，貨號：MB6545）。

1.1.3 試劑與儀器 二甲基亞砜（湖南九典制藥股份有限公司，批號：F25170302）;淋巴細胞分離液（天津市灝陽生物制品科技有限責任公司，貨號：LTS1077）;補骨脂二氫黃酮甲醚（大連美侖生物技術公司，貨號：MB6545）;異戊烯焦磷酸（Sigma-Aldrich，美國，批號：SLCB2751）;胎牛血清（Gibco公司，美國，貨號：10091-148）;GT-T551 H3培養(yǎng)基（TaKaRa公司，日本，批號：AK2P027）;Anti-CD3（PeproTech公司，美國，批號：25G261905121）;IL-2（雙鷺藥業(yè)，批號：S19991007）;CCK-8（日本同仁，日本，貨號：VC5001）;CD107a（Biolegend公司，美國，批號：B181677）;穿孔素（蘇州康達醫(yī)療用品貿易有限公司，批號：7297548）;顆粒酶B（Becton，Dickinson and Company，美國，批號：3200644）;破膜劑（Nordic Mubio，荷蘭，批號：16389）;胰蛋白酶（Beyotime，批號：011020200528）;乳酸脫氫酶試劑盒（寧波普瑞柏生物技術有限公司，批號：LD0359）;貝克曼AU680生化儀（貝克曼，美國，型號：AU680）;實驗顯微鏡（NiKON，日本，型號：NiKON ECLIPSE TE2000-S）;酶標儀（上?？迫A生物工程股份有限公司，型號：KHB ST-360）;流式細胞技術儀（BD公司，美國，型號：BD-FACSCalibur）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

1.2.1.1 CCK8法檢測BVC對γδT細胞生長影響 ?對照組：γδT細胞（未加入補骨脂二氫黃酮甲醚）;實驗組：γδT細胞+不同濃度的補骨脂二氫黃酮甲醚（2.5、5.0、10、20、40、80、160、320、640 nmol/L）。

1.2.1.2 CCK8法檢測BVC對胃癌SGC-7901生長改變 對照組：胃癌SGC-7901細胞株（未加入補骨脂二氫黃酮甲醚）;實驗組：胃癌SGC-7901細胞株+不同濃度的補骨脂二氫黃酮甲醚（2.5、5.0、10、20、40、80、160、320、640 nmol/L）。

1.2.1.3 流式細胞術檢測不同濃度BVC誘導前后γδT免疫細胞中藻紅蛋白標記的PF、GZMB及藻藍蛋白標記的CD107a表達 對照組：γδT細胞（未加入補骨脂二氫黃酮甲醚）。實驗組：γδT細胞+不同終濃度的補骨脂二氫黃酮甲醚（根據CCK8最終結果篩選出實驗濃度，補骨脂二氫黃酮甲醚終濃度設置為2.5、10、40、160 nmol/L）。

1.2.1.4 LDH法測定不同濃度BVC誘導前后的γδT細胞消減SGC-7901細胞程度 對照組：γδT細胞+胃癌SGC-7901細胞（未加入補骨脂二氫黃酮甲醚）;實驗組：不同濃度補骨脂二氫黃酮甲醚作用72 h后的γδT細胞+胃癌SGC-7901細胞株（補骨脂二氫黃酮甲醚終濃度分別為2.5、10、40、160 nmol/L）。

1.2.2 給藥方法

1.2.2.1 CCK8法檢測BVC對γδT細胞生長影響 ?對照組：未加入補骨脂二氫黃酮甲醚;實驗組：補骨脂二氫黃酮甲醚藥物終濃度分別為2.5、5.0、10、20、40、80、160、320、640 nmol/L。

1.2.2.2 CCK8法檢測BVC對人胃癌SGC-7901生長改變 對照組：未加入補骨脂二氫黃酮甲醚;實驗組：補骨脂二氫黃酮甲醚藥物終濃度分別為2.5、5.0、10、20、40、80、160、320、640 nmol/L。

1.2.2.3 流式細胞術檢測不同濃度BVC誘導前后γδT免疫細胞中藻紅蛋白標記的PF、GZMB及藻藍蛋白標記的CD107a表達 對照組：γδT細胞（未加入補骨脂二氫黃酮甲醚）。實驗組：補骨脂二氫黃酮甲醚終濃度設置為2.5、10、40、160 nmol/L。

1.2.2.4 LDH法測定不同濃度BVC誘導前后的γδT細胞消減SGC-7901細胞程度 對照組：γδT細胞+胃癌SGC-7901細胞（未加入補骨脂二氫黃酮甲醚）。實驗組：補骨脂二氫黃酮甲醚終濃度分別為2.5、10、40、160 nmol/L。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 γδT細胞培養(yǎng)前后純度鑒定的檢測 γδT細胞百分比、FCM。具體如下：取康壯志愿者抗凝血20 mL，用淋巴細胞分離液獲取具有單個核的細胞（1 800 r/min，離心12 min，離心半徑為12 cm，下同），等滲鹽水洗滌2次（1 800 r/min離心，9 min/次），用GT-T551 H3培養(yǎng)基調整細胞密度為1.0×105/mL，置于75 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，再放入37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，8 d后收集細胞，進行免疫細胞表型檢測和有關實驗。

1.2.3.2 BVC對γδT細胞生長影響的檢測 增殖率、CCK8法。具體如下：取培育8 d的γδT細胞，測試γδT細胞純度達到使用要求，將γδT細胞調整為細胞懸液，接種于96孔板，200 μL/孔，依據BVC的不同濃度分為10組，并將藥物終濃度0 nmol/L定為對照組。加藥時間為γδT細胞貼壁后，同一種濃度同一時間段設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)不同的時間段。各個孔滴入CCK8 20 μL，需避免氣泡，以免影響后續(xù)OD值的讀數(shù)，繼續(xù)培育4 h，棄上清液，上酶標儀（450NM）測定各孔吸光值并記錄結果。每組重復操作實驗3遍，取結果平均值，計算增殖率。

1.2.3.3 BVC對人胃癌SGC-7901生長改變的檢測 腫瘤細胞生長抑制率（%）、CCK8法。具體如下：獲得處于對數(shù)期的SGC-7901，每孔3×104個細胞接種到96孔板，根據BVC不同終濃度分為10組，同時將藥物終濃度0 nmol/L定為對照組，培育不同的時間段后，每孔加入CCK8 10 μL，再培育4 h，于酶標儀450 nm處檢測各孔吸光度（OD）值，計算腫瘤細胞抑制率。各組3個復孔，實驗操作重復3次，取其結果的平均值。腫瘤細胞生長抑制率（%）=（對照組OD值-實驗組OD值）/（對照組OD值）×100%。

1.2.3.4 不同濃度的BVC誘導前后γδT免疫細胞中藻紅蛋白標記的PF、GZMB及藻藍蛋白標記的CD107a表達的檢測 PF表達率、GZMB表達率、CD107a表達率、流式細胞術。具體如下：取BVC誘導72 h后的γδT細胞，重復清洗3遍，細胞數(shù)目為1×107/L，100 μL細胞懸液加入流式細胞技術分析管，每個試管滴anti-γδTCR-FITC20 μL，遮光培育30 min。100 μL固定液室內溫度遮光培育15 min，PBS洗滌，1 500 r/min，離心5 min，棄上清。檢測藻紅蛋白標記的GZMB、PF的管中加入破膜劑B 100 μL，各試管滴加anti-GraB-PE、anti-PFP-PE各5 μL;期間均設置同型對照抗體管。室內溫度遮光培育15 min，清洗，2 000 r/min，離心5 min，棄上清，PBS 1 mL重懸細胞，流式分析儀分析各管中藻紅蛋白標記的GZMB、PF的表達及藻藍蛋白標記的CD107a的表達。反復3次，取結果的平均。

1.2.3.5 測定不同濃度BVC誘導前后的γδT細胞消減SGC-7901細胞程度的檢測 消減活性（%）、LDH法。具體如下：各自滴入預設好濃度的BVC（終濃度為2.5、10、40、160 nmol/L），未加BVC的為對比組，各個組復孔3個，孵育72 h，作為效應細胞。效靶細胞每個均取0.5 mL，培育6 h，輕柔混好，轉速1 800 r/min，離心時間為10 min，收集上清液。選定波長下測取吸光度值（A值），計算消減活性，實驗操作重復3遍，取結果的平均值加以計算。消減活性（%）按照已定公式加以計算。

1.3 統(tǒng)計學方法 利用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間處置予以單因素的方差分析，假設檢驗的標尺以α=0.05加以比對，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 γδT細胞培養(yǎng)前后純度鑒定 FCM結果顯示，人γδT細胞體外培養(yǎng)8 d后，所占比例由培養(yǎng)前的3.54%增加到85.34%。見圖1。

2.2 BVC對γδT細胞增殖率的影響 不同濃度BVC作用γδT細胞不同的時間段，BVC誘導24 h后，與對照組比較，其濃度位于10～80 nmol/L時能夠促使γδT細胞增殖（P<0.05）。BVC誘導48 h、72 h后，與對照組比較，濃度位于5～80 nmol/L時能夠促進γδT細胞增殖（P<0.05）。當藥物濃度超過320 nmol/L時，3個時間段的γδT細胞均處于抑制狀態(tài)（P<0.05）。同樣藥物濃度時，72 h的γδT細胞增殖率最大。見表1，圖2。

2.3 BVC作用不同時間對胃癌SGC-7901細胞生長的影響 在BVC作用腫瘤細胞24 h、48 h、72 h后，與對照組比較，CCK-8檢測結果顯示，藥物濃度在160～640 nmol/L區(qū)間時胃癌SGC-7901細胞的生長抑制率要高于對照組（P<0.05），其他藥物濃度組SGC-7901細胞的生長抑制率與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），結果表明BVC在高濃度時對SGC-7901細胞的生長具有抑制作用。見表2，圖3。

2.4 不同濃度BVC對γδT細胞穿孔素、GZMB、CD107a影響 流式細胞術測驗結果表明，BVC誘導γδT細胞72 h后，當其藥物濃度在10～40 nmol/L區(qū)間時，藻紅蛋白標記GZMB、藻紅蛋白標記PF以及藻藍蛋白標記的CD107a的狀況均高于對照組（P<0.05），并且當BVC的藥物濃度超過40 nmol/L時，藻紅蛋白標記的穿孔素、藻紅蛋白標記GZMB以及藻藍蛋白標記的CD107a的狀況呈現(xiàn)下降趨勢。見表3，圖4～6。

2.5 BVC調控γδT細胞消減人胃腺癌SGC-7901細胞程度 BVC誘導γδT細胞72 h以后，在一定的濃度范圍內，γδT細胞對于人胃腺癌SGC-7901的消減隨著濃度的增高而增高，濃度為40 nmol/L時消減活性最大，并且當BVC的藥物濃度超過40 nmol/L時，γδT細胞對于胃癌SGC-7901細胞的消減活性呈現(xiàn)下降趨勢。見表4，圖7。

3 討論

胃癌（Gastric Cancer，GC）是世界上常見腫瘤之一，是全球癌癥相關死亡的第二大原因。不可切除或轉移性胃癌患者的預后較差[9]。我國是胃癌高發(fā)國家，發(fā)病和死亡例數(shù)均約占世界的50%，疾病負擔嚴重，是癌癥防治的重點[10]。

BVC是一種異戊烯基黃酮類化合物，用途廣泛，如消減癌癥細胞、抗過敏、抗炎、調節(jié)免疫等[11-12]。通過實驗發(fā)現(xiàn)，在BVC作用腫瘤細胞24 h、48 h以及72 h后，CCK-8檢測結果顯示，藥物濃度在160～640 nmol/L區(qū)間時胃癌SGC-7901細胞的生長抑制率高于對照組（P<0.05），其他藥物濃度組SGC-7901細胞的生長抑制率與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），實驗結果表明BVC在高濃度時對胃癌SGC-7901細胞的生長具有抑制作用。結合BVC有調節(jié)免疫作用，我們考慮是否可以通過輔助采用免疫治療的手段，來增強抗腫瘤的效果。

免疫細胞消減癌癥細胞是借助免疫效應細胞來控制惡性腫瘤目標的一種療法，其已成為一種新的治療腫瘤的方式。有別于αβT細胞，γδT細胞能夠以不依賴MHC的方式來識別抗原。如淋巴細胞功能相關分子（LFA）、NKG2D分子、CD16以及其他在γδT細胞識別和殺傷癌細胞中發(fā)揮關鍵作用的分子[13]。總而言之，γδT細胞在癌癥免疫治療方面有較為廣泛的應用前景。在此次實驗中，BVC誘導γδT細胞24 h后，在10～80 nmol/L的濃度范圍內，與對照組比較，γδT細胞有一定程度的增殖。BVC誘導γδT細胞48 h、72 h后，在5～80 nmol/L的濃度范圍內，與對照組比較，γδT細胞較之有一定程度的增殖。這為今后的胃癌臨床免疫治療中應用BVC提供了些許理論參考。

CTL是針對癌癥的較為理想的免疫細胞，其在接觸靶細胞后分泌的效應物主要是顆粒酶和穿孔素，二者所誘導的凋亡是細胞毒性淋巴細胞介導的抗腫瘤免疫的主要途徑。PF主要是細胞毒性淋巴細胞、自然殺傷細胞生成，他使得目標細胞滲透的壓力改變進而使其死亡，抑或于PF共同作用而導致目標的凋亡。GZMB則為CTL生成的物質，其通過半胱天冬酶的活化來誘導誘導腫瘤細胞和病毒感染細胞的凋亡。但是，在誘導靶細胞凋亡的過程中，GZMB扮演更為重要的角色。既往的研究表明，CD107a存在于細胞毒性顆粒的膜中，其能夠以特異性抗原的形式來介導殺傷，CD107a主要與細胞毒性活性相關，是細胞毒性活性的敏感標記[14-17]。本次實驗發(fā)現(xiàn)，一定濃度范圍的BVC誘導γδT細胞72 h后，PFP、GraB、CD107a的表達較對照組有一定程度的升高，并且在BVC的藥物濃度為40 nmol/L時，3種標記的表達較為明顯。另外，我們通過乳酸脫氫酶法檢測發(fā)現(xiàn)，在BVC的藥物濃度為40 nmol/L時，經過BVC誘導后的免疫細胞消減人胃腺癌SGC-7901程度同樣到達最高峰。為此，我們推測BVC有可能通過升高γδT細胞PF、GZMB以及CD107a的表達進而增強γδT細胞對腫瘤細胞的殺傷活性。

總而言之，在一定的濃度范圍，BVC使得γδT細胞增殖，增強γδT細胞對人胃腺癌SGC-7901消減，其機制考慮：PF、GZMB、CD107a的表達提高增強了γδT細胞的消減能力。另外，BVC之于人胃腺癌SGC-7901生長具有抑制效果，這為今后BVC應用于γδT免疫細胞治療胃癌提供了一定程度的參考意義和理論支撐。

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（2019-03-12收稿 責任編輯：芮莉莉）