甘氨酸和丙酮酸對于局部缺血再灌注后的全身性保護作用

王萌，傅鋼蘭，楊艷旗*

已有研究表明，腸系膜上動脈（superior mesenteric artery，SMA）缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）既可引起局部組織I/R 損傷，又能導(dǎo)致全身血流動力學(xué)惡化和非缺血的重要器官損害［1-5］。其機制與以趨化因子、細(xì)胞因子、血源性細(xì)胞等為介質(zhì)的播散性炎癥反應(yīng)有關(guān)［6］。丙酮酸鈉是每個活細(xì)胞的檸檬酸循環(huán)的中心化合物。在心、腦和腸缺血/再灌注損傷的實驗研究中，丙酮酸的保護作用已被描述［7-10］。其保護效應(yīng)的分子機制可能包括清除活性氧簇特別是過氧化物，通過再生還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）實現(xiàn)間接抗氧化功能，改善線粒體能量供應(yīng)，降低胞漿氧化還原電位等［11］。甘氨酸是由還原型谷胱甘肽組成的氨基酸，已被報道在離體細(xì)胞、灌流器官和涉及心、肝、腎、腸和骨骼肌的體內(nèi)模型中具有抗氧化和減輕 I/R 損傷的作用［1，2，4，5］。然而，在局部組織或器官I/R 導(dǎo)致的全身炎癥狀態(tài)和遠(yuǎn)隔器官（如心肺）受傷時，丙酮酸和甘氨酸是否有保護作用尚未完全清楚。在一些影響全身的疾病模型中，例如失血性休克［12，13］、脂多糖內(nèi)毒素血癥和盲腸結(jié)扎和穿孔的膿毒癥模型中［14，15］，甘氨酸可以穩(wěn)定血流動力學(xué)參數(shù)，減輕肺、肝及腎的損傷，并降低死亡率。但丙酮酸和甘氨酸在局部（如腸系膜）的缺血再灌注后是否也具有這種全身保護作用目前尚不清楚。

本研究中采用我們前期已經(jīng)發(fā)表的可以監(jiān)測血流動力學(xué)的動物模型［16］。其中使用超聲血流測定儀（transit time flow measurement，TTFM）連續(xù)和實時監(jiān)測射入大鼠主動脈的左心室的完整血流剖面，代表大鼠心輸出量（CO），同時連續(xù)監(jiān)測心輸出量、平均動脈壓（MAP）、肺動脈壓（PAP）、中心靜脈壓（CVP）。根據(jù)這些記錄的參數(shù)，可通過計算近似估計心臟指數(shù)（CI）、體循環(huán)阻力（SVR）和肺血管阻力（PVR）的大鼠CO、MAP、PAP 和CVP。在此模型基礎(chǔ)上我們研究了丙酮酸和甘氨酸對SMA I/R 后局部損傷的影響，以及全身血流動力學(xué)和心臟、肺臟等重要臟器的保護作用。

1 材料與方法

異氟醚和氯胺酮（10%）（Ceva）、萘酚-D-氯乙酸酯酶試劑盒和鄰二苯胺（Sigma Aldrich）、Portex導(dǎo)管（內(nèi)徑：0.58 mm，外徑：0.96 mm，Smith Medical International）、丙酮酸、甘氨酸（Sigma-Aldrich）。實驗方案由中山大學(xué)實驗動物倫理委員會審查和批準(zhǔn)。盡一切努力將實驗動物痛苦降至最低。成年雄性 Sprague-Dawley（SD）大鼠，2～3 月齡，體重300～400 g，向中山大學(xué)動物實驗中心采購，放于恒溫（22±2℃）、12 h 明暗周期飼養(yǎng)，自由進食水。所有實驗嚴(yán)格遵守中山大學(xué)動物倫理委員會管理執(zhí)行。

麻醉、鎮(zhèn)痛、手術(shù)和監(jiān)護

監(jiān)測方法按照我們此前描述后方法進行。概括來說，大鼠麻醉后用異氟醚（1.0%～1.5%，100%醫(yī)用氧氣，1.0 L/min）通氣，右側(cè)胸壁注入氯胺酮（80 mg/kg 體重）鎮(zhèn)痛，體溫維持在37°C。股動脈和股靜脈插管監(jiān)測MAP 和靜脈輸液。右頸靜脈插管進行CVP 監(jiān)測。氣管插管，使用機械通氣（UNO Micro Ventilator-03）。切開胸骨和心包，用顯微器械仔細(xì)解剖胸腺、主動脈和肺動脈（PA）。經(jīng)右心室動脈圓錐將硬膜外導(dǎo)管置入PA。連續(xù)記錄MAP、CVP 和PAP。TTFM（Medistim，Oslo）探頭置于大鼠主動脈開始監(jiān)測血流。

根據(jù)平均動脈壓（MAP）、中心靜脈壓（CVP）和體重（BW）按以下公式估算心臟指數(shù)（CI）、體循環(huán)阻力（SVR）。

腸系膜缺血再灌注方案按照以前描述進行［16］。在監(jiān)測和通氣建立后，正中切開腹腔，顯露各組SMA。用血管夾夾閉SMA 并計時。阻斷1.5 h（0～90 min）后開放，再灌注2 h（90～120 min）。再灌注前靜脈注射丙酮酸50 mg/kg 或甘氨酸20 mg/kg（丙酮酸組6 例，甘氨酸組6 例）。丙酮酸和甘氨酸的用量根據(jù)以前的研究［5，8］確定。給藥前將藥物新鮮溶解于1 mL 林格液中，另一組給予純林格液1 mL（林格組，n=6）。再灌注后，切除心臟處死動物。SMA 缺血前 30 min（T1）、缺血前 5 min（T2）、再灌注前5 min（T3）、再灌注后5 min（T4）和再灌注結(jié)束時（T5）分別于缺血前30 min（T1）、缺血前5 min（T2）、再灌注 5 min（T4）和再灌注結(jié)束時（T5）采動脈血（300 μL），測定血氣分析和心肌標(biāo)志物肌酸肌酶CK 及同工酶CKMB、超酶肌鈣蛋白I（uscTnI）等。

然后對小腸和其他器官損傷進行評分/測定。心、肺、肝臟和小腸的組織水腫程度以濕干比衡量。完整的小腸，切除后等長切成10段。分別進行對于肉眼與顯微評分。用萘酚-AS-D-氯乙酸酯酶染色法檢測腸、肺、心、肝組織中性粒細(xì)胞浸潤情況。

使用GraphPad Prism（版本7.0a）進行統(tǒng)計分析。用Shapiro-Wilk 檢驗驗證連續(xù)變量的正態(tài)假設(shè)。差異計算采用單因素方差分析（ANOVA）、雙因素方差分析和Dunnett 多重比較檢驗。組織學(xué)損傷評分采用Kruskal-Wallis 秩和Mann-WhitneyU檢驗。采用Bonferroni p 校正進行Mann-WhitneyU檢驗的多重比較。P＜0.05 為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 血流動力學(xué)指標(biāo)

假手術(shù)組在整個手術(shù)過程中血流動力學(xué)穩(wěn)定。在不含丙酮酸或甘氨酸的情況下，林格組MAP 逐漸下降，但下降趨勢無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖1）。丙酮酸組和甘氨酸組MAP 略有升高，上升趨勢也不明顯（P＞0.05）。經(jīng)雙因素方差分析，四組間無顯著性差異（Time，F(xiàn)=1.33，P=0.15；Group，F(xiàn)=0.24，P=0.87）。假手術(shù)組CI 一直穩(wěn)定到觀察結(jié)束。林格組再灌注后CI 持續(xù)下降。觀察結(jié)束時，林格組CI（145.16 mL/min·kg）明顯低于假手術(shù)組（198.81 mL/min·kg，P＜0.01）。丙酮酸組、甘氨酸組和假手術(shù)組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。四組的PAP 均維持在幾乎平坦的曲線上，各組之間的多重比較顯示沒有顯著性差異（P＞0.05）。關(guān)于CVP 指標(biāo)，假手術(shù)組、林格組、丙酮酸組再灌注后中心靜脈壓穩(wěn)定。林格組SVR 顯著低于其它各組（P＜0.01）。

丙酮酸組、甘氨酸組復(fù)蘇體積相比林格液組減少（P＜0.01，圖2）。丙酮酸組與甘氨酸組比較差異無顯著性。林格組再灌注早期液體復(fù)蘇可維持CI，而再灌注約1 h 后加快輸液仍出現(xiàn)CI 持續(xù)下降。

2.2 組織損傷程度

假手術(shù)組、林格組、丙酮酸組、甘氨酸組小腸肉眼評分分別為0（0）、3.75（1）、2.35（2）、2（2.5），（χ2=17.65，P=0.001，圖3A）。經(jīng)Mann-WhitneyU檢驗，林格組、丙酮酸組和甘氨酸組得分明顯高于假手術(shù)組（U＜0.001，P=0.002）。雖然U檢驗顯示林格與丙酮酸（U=4，P=0.026）、林格與甘氨酸（U=4，P=0.026）之間有顯著性差異（P＜0.05），但經(jīng)Bonferroni 校正后，差異不顯著（P＞0.008）。鏡下各組腸損傷評分分別為 0.25（0.25）、4.13（1.75）、2.75（0.75）、2.88（1.25）（χ2=19.76，P＜0.001）。多項比較發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組損傷評分低于其他3 組（U＜0.001，P=0.002）。丙酮酸組、甘氨酸組損傷評分低于林格組（U＜0.001，P=0.002）。浸潤到腸組織的中性粒細(xì)胞呈粉紅色或紅色。經(jīng)計數(shù)，假手術(shù)組、林格組、丙酮酸組、甘氨酸組分別為4.27±0.81/HPF、50.79±2.50/HPF、36.96±1.36/HPF、40±6.35/HPF。多重比較顯示，假手術(shù)組中性粒細(xì)胞最少（P＜0.01），而林格組中性粒細(xì)胞明顯多于丙酮酸組和甘氨酸組（P＜0.01，圖3B，圖4A-D）。

林格組心臟組織學(xué)檢查顯示中性粒細(xì)胞最多。部分切片在微血管縱切面可見中性粒細(xì)胞微血栓的征象。丙酮酸組和甘氨酸組中性粒細(xì)胞減少。這些中性粒細(xì)胞分布較散在。微血栓很少見（圖4.M-P）。假手術(shù)組、林格組、丙酮酸組、甘氨酸組心肌中性粒細(xì)胞分別為3.56±0.84/HPF、18.56±1.58/HPF、12.44±1.33/HPF、14.11±1.52/HPF（P＜0.01）。丙酮酸和甘氨酸組中性粒細(xì)胞明顯多于假手術(shù)組（P＜0.01）。林格組中性粒細(xì)胞明顯多于丙酮酸組和甘氨酸組（P＜0.01）。中性粒細(xì)胞計數(shù)與小腸損傷和肺損傷評分都呈正相關(guān)（小腸，r=0.81，P＜0.01；肺r=0.57，P＜0.01）。

各組CK 均較基線值升高，可能與手術(shù)創(chuàng)傷有關(guān)（圖5）。各組在差異無統(tǒng)計學(xué)意義。假手術(shù)組CKMB穩(wěn)定在50 U/L左右，林格組、丙酮酸和甘氨酸組缺血再灌注后CKMB 上升至100 U/L 以上，明顯高于假手術(shù)對照組（P＜0.01）。林格組CKMB 高達(dá)150 U/L以上，顯著高于丙酮酸和甘氨酸組（P＜0.01）。假手術(shù)組肌鈣蛋白（CKMB）穩(wěn)定在50U/L 左右，低于其他各組（P＜0.01）。林格組CKMB 高達(dá)150 U/L以上，顯著高于丙酮酸和甘氨酸組（P＜0.05）。林格組、丙酮酸組、甘氨酸組us-cTnI升高至1.0 ng/mL以上，顯著高于假手術(shù)對照組（0.2 ng/mL，P＜0.01）。

肺組織學(xué)評分假手術(shù)組、林格組、丙酮酸組和甘氨酸組分別為 0.5（1）、4（2）、2.5（2）和 3（2）組，如圖3 所示。假手術(shù)組損傷評分最低（U＜0.001，n=6，P=0.002）。林格組與丙酮酸組（U=8，n=6，P=0.132）、林格組與甘氨酸組（U=7.5，n=6，P=0.093）、丙酮酸+甘氨酸組（U=15.5，n=6，P=0.699）之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。假手術(shù)組、林格組、丙酮酸組、甘氨酸組中性粒細(xì)胞分別為3.67±1.5/HPF、17.0±7.97/HPF、12.33±1.58/HPF、13.33±1.76/HPF（P=0.002）。假手術(shù)組中性粒細(xì)胞明顯低于其他各組（P＜0.05），但林格組與丙酮酸組和甘氨酸組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

肝臟中性粒細(xì)胞計數(shù)假手術(shù)組9.5±0.72/10 HPF，林格組 30.0±1.81/10 HPF，丙酮酸組 19.17±1.83/10 HPF，甘氨酸組18.5±1.43/10HPF（P＜0.01）。方差均勻度檢驗（Levene 統(tǒng)計量1.94，P=0.16）。丙酮酸和甘氨酸組中性粒細(xì)胞數(shù)明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01），但低于林格組（P＜0.01）。

2.3 組織水腫程度

林格組小腸和肺組織的水/干重比（9.87±0.83）顯著高于其他各組（P＜0.01）。假手術(shù)組（4.04±0.26）、丙酮酸組（6.12±1.12）和甘氨酸組（5.42±0.32）之間無顯著性差異（P＞0.05）。心臟和肝臟的水腫率在4 組間均無顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 呼吸和代謝性酸堿狀態(tài)

各組氣管插管通氣后氧分壓均下降，觀察期內(nèi)進一步下降，但組間比較差異無顯著性（P＞0.05，圖5）。林格組再灌注后代謝性酸中毒最為嚴(yán)重，pH、堿剩余均降低顯著（P＜0.01）。

3 討 論

本研究采用可監(jiān)測 SMA I/R 后 CI、MAP、PAP等指標(biāo)的動物模型，研究了丙酮酸和甘氨酸對SMA I/R 后血流動力學(xué)的保護作用。結(jié)果表明，丙酮酸和甘氨酸均能穩(wěn)定SMA I/R 后血流動力學(xué)參數(shù)，減輕低血容量性休克的影響。組織學(xué)分析表明，丙酮酸和甘氨酸均能減輕SMA I/R 后局部和遠(yuǎn)隔器官的損傷。缺血再灌注損傷涉及細(xì)胞內(nèi)過程和周圍組織的炎癥反應(yīng)［6，17］。在缺血期，缺氧和能量耗竭引起的細(xì)胞損傷是主要的致病事件。能量負(fù)債引起細(xì)胞內(nèi)鈉、鈣穩(wěn)態(tài)的紊亂，水解酶的激活，細(xì)胞內(nèi)膜和質(zhì)膜通透性的增加，進而導(dǎo)致功能改變和細(xì)胞死亡。受損、死亡的細(xì)胞以及細(xì)胞碎片是炎癥反應(yīng)的觸發(fā)因素，表現(xiàn)為粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、補體系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)的激活，活性氧（ROS）的形成和微血管灌注的障礙。在再灌注階段，過量的ROS 形成導(dǎo)致額外的細(xì)胞損傷，由異常的線粒體膜復(fù)合體驅(qū)動的電子回流，或者由于微血管灌注受損導(dǎo)致的仍然缺氧［18］。

我們在前期研究中建立了新的可持續(xù)監(jiān)測血流動力學(xué)的大鼠模型［16］。我們首次在升主動脈上應(yīng)用TTFM 探頭，參照測量的主動脈流量估算CO。Cerqueira 等人的另一項研究3 中，作者還報道了使用血流傳感器測量腎上腹主動脈和腸系膜上動脈流量后腸系膜灌注不良后的血流動力學(xué)變化，但該方法無法獲得灌注上半身的流量。因此，我們的CO 平均值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Cerqueira 研究中記錄的腹部血流量。實際上，我們相互驗證了對方的結(jié)果，測量值在正確的范圍內(nèi)。根據(jù)文獻(xiàn)所報道的CO 水平，我們對大鼠的劑量約為100 mL/min，而在巴西的Cerqueira 等人研究中，基線是20 mL/min。因此，將升主動脈血流視為CO 的近似值更為合理。我們以往的研究證實，SMA I/R 后，由于血管內(nèi)容量的重新分配，導(dǎo)致低血容量性休克，表現(xiàn)為嚴(yán)重的臟器水腫和大量漿液性積液，同時MAP 和CI 降低。早期大容量復(fù)蘇可有效逆轉(zhuǎn)血流動力學(xué)惡化。但在晚期CI 和MAP 下降與復(fù)蘇容量無關(guān)，提示心臟功能不全［16］。

在這項研究中，丙酮酸、甘氨酸在整個觀察過程中通過容量復(fù)蘇和MAP 促進CI 的維持。丙酮酸鈉是最簡單的α-酮酸，它能與過氧化氫酶反應(yīng)，清除活性氧自由基，生成水和二氧化碳。它還可減輕中性粒細(xì)胞浸潤和髓過氧化物酶［19］，恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)液氧化還原電位，通過抑制膜氧化降低丙二醛［20］。因此，丙酮酸鈉在保護器官免受I/R 損傷的實驗?zāi)Ｐ椭械玫搅藦V泛的研究。然而，在小腸等初級器官I/R 后，丙酮酸對遠(yuǎn)隔器官如心、肺和肝的影響尚未被探討。甘氨酸是最簡單的氨基酸，是最早的抗I/R 損傷的細(xì)胞保護劑之一［18］。從那時起，在各種各樣的實驗?zāi)Ｐ椭校拾彼嵋呀?jīng)被證明可以保護由于缺氧、活性氧、化學(xué)誘導(dǎo)的能量耗竭和僅僅是氧氣補充而造成的I/R 相關(guān)損傷［1，19］，包括在原代細(xì)胞和細(xì)胞系、離體灌流器官或體內(nèi)應(yīng)用甘氨酸，甚至在肝移植［20］和心臟手術(shù)［21］的臨床試驗中。目前已知其保護機制包括依賴甘氨酸受體的直接細(xì)胞保護、依賴其還原型谷胱甘肽而抑制活性氧簇、以及抑制炎癥介質(zhì)和趨化反應(yīng)等［19］。既往研究還探討了合適的劑量范圍和給藥途徑［5］。然而，甘氨酸對于局部腸道I/R 后的全身性效應(yīng)也尚未闡明。

此外，使用丙酮酸、甘氨酸溶液時所需的復(fù)蘇體積要小得多。丙酮酸和甘氨酸組的腸、心、肺水腫程度也比林格組輕。先前的研究表明，丙酮酸可以穩(wěn)定生物膜系統(tǒng)，減少丙二醛的產(chǎn)生［20］。丙酮酸還可以穩(wěn)定血管平滑肌張力［22］。而甘氨酸預(yù)處理增加的細(xì)胞谷胱甘肽可能有助于其保護膜免受脂質(zhì)過氧化的傷害功能［25］。因此，推測丙酮酸和甘氨酸可抑制微循環(huán)通透性改變，防止血管內(nèi)容量重分布。然而，還需要更多實驗來驗證此假設(shè)。

中性粒細(xì)胞活化在I/R 損傷的病理過程中起重要作用。SMA I/R 后中性粒細(xì)胞計數(shù)與腸損傷與肺損傷評分呈正相關(guān)。心臟HE 染色切片光鏡下未見明顯的形態(tài)學(xué)改變。但萘酚-ASD 氯乙酸酯酶染色也顯示中性粒細(xì)胞在浸潤心肌和滯塞微血管。而丙酮酸和甘氨酸可顯著降低腸、心、肺、肝的損傷評分、水腫比率和中性粒細(xì)胞數(shù)量。這些結(jié)果表明丙酮酸和甘氨酸不僅對局部I/R 組織有益，而且對循環(huán)血流動力學(xué)狀態(tài)以及心肺等重要器官也具保護作用。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)酮酸和甘氨酸可改善腸系膜缺血再灌注的血流動力學(xué)指標(biāo)，既可以減輕局部組織的缺血再灌注損傷，又有利于改善休克狀態(tài)的復(fù)蘇效果，維持更好的心肺功能。