基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討小承氣湯治療消化性潰瘍的分子機制

刁 晶，王淑萍，張 莉，張靜澤*

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193； 2.天津現(xiàn)代創(chuàng)新中藥科技有限公司，天津 300392；3.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院，天津300162； 4.武警后勤學(xué)院，天津 300309）

消化性潰瘍是消化內(nèi)科的常見病、多發(fā)病，該病誘因與胃酸過高、胃黏膜屏障功能受損等因素有關(guān)，最為常見的有胃潰瘍和十二指腸潰瘍［1］。腸道細菌感染是導(dǎo)致消化性潰瘍的主要原因之一，細菌分泌的毒素不但破壞胃腸黏膜，形成炎癥、潰瘍，造成腹痛、腹瀉等癥狀，還作用于植物神經(jīng)系統(tǒng)，致胃腸功能紊亂、腸梗阻等癥狀，甚至引發(fā)癌癥［2］。中醫(yī)治療中焦氣滯、脾胃陽虛、肝胃不和等消化道疾病的原則多為理氣和止痛［3］。

小承氣湯出自《傷寒論》，其組成為大黃四兩、枳實三兩、厚樸二兩，主治陽明熱結(jié)輕證，證見譫語，潮熱，微煩，汗多，大便硬，小便數(shù)，脈滑數(shù)等［4］。理氣、止痛效果佳，被收錄于《古代經(jīng)典名方目錄》中［5］。此前，小承氣湯常用于治療便秘、痢疾、腸梗阻等疾病，其作用機制可能與調(diào)節(jié)植物神經(jīng)系統(tǒng)、修復(fù)胃腸黏膜等方式有關(guān)［6-8］。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接等方式，從整體水平上探討小承氣湯復(fù)雜的作用機制，預(yù)測體內(nèi)潛在的靶點蛋白［9-11］。再利用分子對接技術(shù)尋找藥材中與特定靶蛋白結(jié)合密切的小分子化合物，篩選中藥的有效成分，以期對經(jīng)典名方小承氣湯今后的藥理研究和臨床推廣提供方向［10］。

1 材料與方法

1.1 活性成分的篩選 在TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）數(shù)據(jù)分析平臺中檢索“枳實”、“厚樸”、“大黃”的化學(xué)成分，將結(jié)果與相關(guān)文獻結(jié)合分析，再根據(jù)成藥性原則，篩選出符合口服生物利用度OB≥30%、類藥性DL≥0.18、相對分子量M＜500、半衰期HL≥4 h的活性成分［12］。在PubChem 有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中查找活性成分的SMILE 格式，其中未被該數(shù)據(jù)庫收錄的活性成分，可在TCMSP 網(wǎng)站中直接下載該活性成分后，利用OpenBabel 軟件，將格式轉(zhuǎn)化為Sdf 格式［13］。

1.2 活性成分的靶點預(yù)測 Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch）可精確預(yù)測生物活性分子的靶點，其可根據(jù)配體的2D、3D 結(jié)構(gòu)綜合進行預(yù)測，數(shù)據(jù)庫有多種檢索方式，可以用活性成分的SMILES 化學(xué)式作為關(guān)鍵詞進行檢索，也可以將活性成分的sdf 格式復(fù)制到繪圖區(qū)自動識別出活性成分結(jié)構(gòu)，還可以利用網(wǎng)站自帶的繪圖工具畫出活性成分，輸入篩選好活性成分后點擊submit 即可得到預(yù)測的相關(guān)靶點，再用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫UniProt 將靶點蛋白進行校正［14］。

1.3 關(guān)鍵靶點的確定 分別在孟德爾遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫OMIM、DisGeNET、pharmGKB、CTD、GeneCards 等5 個基因疾病關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫中利用“peptic ulcer”、“gastric ulcer”、“duodenal ulcer”作為關(guān)鍵詞進行已知的疾病靶點的檢索及篩選［15］。將查詢結(jié)果去重后與活性成分靶點進行比對分析，確定小承氣湯治療消化性潰瘍潛在的關(guān)鍵靶點［16］。

1.4 靶點蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過在線搜索已知的蛋白互作關(guān)系的String 數(shù)據(jù)庫［17］（https：//stringdb.org/cgi/input.pl）Multiple protein 項下輸入關(guān)鍵靶點，限定物種為人類，得到蛋白間相互作用的信息，并下載格式為tsv 的文件，直接導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1 軟件，設(shè)置節(jié)點的大小及顏色隨著度值、結(jié)合分?jǐn)?shù)的大小而變化，最終可得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖［18］。

1.5 Gene Ontology 生物過程富集分析和KEGG 京都基因與基因組數(shù)據(jù)通路注釋分析 將16 個小承氣湯潛在關(guān)鍵靶點通過Cytoscape 3.6.1 的ClueGO 插件進行Gene Ontology 生物過程富集分析和KEGG 通路注釋分析。限定基因名稱列表為人（homo sapiens），選取具有顯著性差異的所有通路，設(shè)定閾值P＜0.05，藥物靶點富集得到的通路就是藥物發(fā)揮治療作用的主要途徑［18］。

1.6 中藥-活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 運用cytoscape 3.6.1 軟件中的融合功能，構(gòu)建中藥-活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖。以彩色的節(jié)點（node）表示中藥、活性成分、關(guān)鍵靶點，邊（edge）表示其之間的相互關(guān)系［18］。

1.7 分子對接驗證 選擇string 網(wǎng)絡(luò)圖中度值（degree）排名前4 位的關(guān)鍵靶點，在蛋白結(jié)構(gòu)PDB 數(shù)據(jù)庫中找到對應(yīng)的PDB ID，利用systems Dock Web Site 在線對接網(wǎng)站與21 種活性成分進行分子對接，建立Excel 表記錄結(jié)果，用對接分?jǐn)?shù)評價活性成分和靶點蛋白的結(jié)合活性。

2 結(jié)果

2.1 小承氣湯活性成分篩選 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索得出，枳實65 種成分，厚樸139 種成分，大黃92 種成分。根據(jù)成藥性原則，篩選口服生物利用度OB≥30%、類藥性DL≥0.18、相對分子量M＜500、半衰期HL≥4 h的成分并去除重復(fù)，最終得到以下21 種活性成分，見表1。

2.2 活性成分靶點的確定 將潛在活性成分的SMILE 式或Sdf-MDL MOL format 格式文件上傳到Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫，預(yù)測枳實、厚樸、大黃活性成分在體內(nèi)潛在的靶點，去除重復(fù)的靶點后剩余92 個。再應(yīng)用OMIM、DisGeNET、pharmGKB、CTD、GeneCards數(shù)據(jù)庫搜索與消化性潰瘍（peptic ulcer）或胃潰瘍（gastric ulcer）等相關(guān)的靶點，與上述92 個靶點比對分析后，得到16 個治療消化性潰瘍的潛在作用靶點及靶點類型的信息（見表2），包括酶（氧化還原酶、激酶、蛋白酶）、轉(zhuǎn)運蛋白、離子通道、受體等，表明小承氣湯能通過不同的靶點發(fā)揮藥效。

2．3 小承氣湯潛在靶點之間作用分析 將在string 數(shù)據(jù)庫查詢到的結(jié)果直接導(dǎo)入cytoscape 軟件得到每個靶點相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖。其中網(wǎng)絡(luò)的每個節(jié)點（node）代表靶點蛋白，網(wǎng)絡(luò)的邊（edge）代表蛋白質(zhì)間共同促成的生物過程和分子功能。如圖1，16 個節(jié)點、55 條邊，度值越大，節(jié)點越大，而結(jié)合分?jǐn)?shù)越大，則邊越粗，其中具有較大度值，即degree ≥12 的靶點蛋白分別是：參與氧化還原反應(yīng)的氧化還原酶（PTGS2）；在細胞凋亡的執(zhí)行階段起著關(guān)鍵作用的胱天蛋白酶-3（CASP3）；與人類乳腺癌、結(jié)腸直腸癌和卵巢癌相關(guān)的RAC-α 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）；參與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、翻譯、細胞骨架重排，介導(dǎo)細胞生長、黏附、存活和分化等多種生物學(xué)功能的絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）；介導(dǎo)免疫應(yīng)答參與細胞因子分泌和炎癥反應(yīng)的Toll 樣受體4（TLR4）。表明小承氣湯可能通過多靶點聯(lián)合，參與到氧化還原反應(yīng)、誘導(dǎo)癌癥細胞凋亡、調(diào)節(jié)細胞生長，激活免疫應(yīng)答來發(fā)揮治療效果。

表1 小承氣湯活性成分

表2 小承氣湯活性成分潛在靶點

圖1 小承氣湯潛在靶點之間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 靶點生物學(xué)功能注釋 通過cytoscape 3.6.1 的ClueGo 插件對小承氣湯治療消化性潰瘍潛在靶點進行Gene Ontology（GO）生物學(xué)功能分析，見圖2。小承氣湯治療消化性潰瘍可能涉及了多個生物學(xué)過程，藥效機制與細胞對活性氧的反應(yīng)、對化學(xué)刺激的反應(yīng)、磷酸鹽代謝過程的積極調(diào)節(jié)、平滑肌細胞增殖的正調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)細胞群增殖、T 細胞穩(wěn)態(tài)等生物過程有關(guān)。GO 基因功能分類包括三個過程：生物過程、分子功能、細胞組分功能。分子功能中富集到血紅素結(jié)合、氧化還原酶活性調(diào)節(jié)、磷酸酶結(jié)合等生物學(xué)過程，細胞組分中富集到細胞膜、細胞質(zhì)囊泡、細胞器、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小室等。

圖2 GO 生物學(xué)功能分析

2.5 靶點通路注釋分析 27 個通路被富集，其中有12 條與癌癥相關(guān)的通路，即結(jié)腸直腸癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌等，提示藥物可能對腫瘤有抑制作用；5 條炎癥信號通路，包括HIF-1 信號通路、VEGF 信號通路、ErbB 信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、IL-17 信號通路，提示藥物有抗炎作用；4 條內(nèi)分泌和代謝、傳染病通路，即糖尿病、利什曼病、弓形體病、百日咳。另外，還涉及神經(jīng)系統(tǒng)血清素的神經(jīng)突觸、內(nèi)分泌系統(tǒng)的雌激素信號通路和參與脂質(zhì)代謝的花生四烯酸代謝途徑等。表明藥物通過多靶點富集的多條通路聯(lián)合發(fā)揮藥效。見圖3。

圖3 KEGG 通路富集分析

2.6 藥材-活性成分-靶點-通路圖 將上述得到的藥材、活性成分、靶點、通路輸入cytoscape 軟件，用軟件的merge 功能直觀的搭建起“藥材-活性成分-靶點-通路”之間的關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)中有67 個節(jié)點（包括3 味中藥材、21 種活性成分、16 個關(guān)鍵靶點、27 條富集通路）和261 條邊，活性成分的節(jié)點隨度值增大，其中新橙皮苷（neohesperidin）、甜橙黃酮（sinensetin）、黃烷酮（eriodyctiol）、柚皮素（naringenin）、橙皮素[5，7-dihydroxy-2-（3-hydroxy-4-methoxyphenyl）chroman-4-one]、川陳皮素（nobiletin）、大黃酸（rhein）、木犀草素（luteolin）等節(jié)點較大，表明其作用靶點多。此外，靶點節(jié)點越大，活性成分作用該靶點的數(shù)量越多，而圖4 中EGFR、MMP9、AKT1、MARK1、TLR4 等靶點節(jié)點較大，可能為藥物集中作用的靶點。見圖4。

圖4 藥材-成分-靶點-通路圖

2.7 分子對接 將度值較高的5 個靶點AKT1（PDB ID：3O96）、TLR4 （PDB ID：4G8A）、MARK1 （PDB ID：4IZ5）、PTGS2（PDB ID∶5F19）、CASP3（PDB ID∶5I9B）與21 種活性成分進行分子對接，結(jié)果見表3。由表可知，對接分?jǐn)?shù)大于7 的有19 種（18.1%），介于5～7 的有53種（50.5%），介于4. 25～5 的有11 種（10.5 %），小于4.25 的有16 種（15.2%），由于對接分?jǐn)?shù)與結(jié)合活性的關(guān)系是：docking score＞4.25 時，存在結(jié)合能力；docking score＞5.0 時,結(jié)合活性較強; docking score＞7.0 時，結(jié)合能力極強［19］，而小承氣湯的活性成分與關(guān)鍵靶點的對接分?jǐn)?shù)中大于4.25 分占總數(shù)84.8%，即藥物與靶點有很好的結(jié)合活性。

表3 分子對接得分情況

3 討論

調(diào)查顯示，幽門螺桿菌感染是90%以上十二指腸潰瘍和70%～80% 胃潰瘍的病因［20］，其能產(chǎn)生多種酶，分泌大量細胞毒素，在胃黏膜處形成致病因子，氧自由基、白介素、脂多糖等通過黏膜炎癥反應(yīng)、全身免疫反應(yīng)的方式引起黏膜病變［21］。

本研究在生物學(xué)過程富集分析時發(fā)現(xiàn)，小承氣湯中存在作用于消化性潰瘍的靶點基因的活性成分，這些靶點主要富集到活性氧的反應(yīng)、對化學(xué)刺激的反應(yīng)、磷酸鹽代謝過程的積極調(diào)節(jié)、平滑肌細胞增殖的正調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)細胞群增殖、T 細胞穩(wěn)態(tài)等，細胞組成中富集到細胞膜、細胞質(zhì)囊泡、細胞器、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小室等。小承氣湯組方中有大黃、枳實、厚樸，三者均含有抗炎、抗氧化以及促進胃腸動力的成分，例如大黃中富含大黃酸，有研究表明［22］，大黃酸可減少白介素（IL）-6、IL-1β和腫瘤壞死因子（TNF）-α 等促炎細胞因子的生成，同時抑制核因子（NF）-κB 和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族含pyrin 結(jié)構(gòu)域蛋白3（NLRP3）炎癥因子途徑，顯著減少免疫細胞遷移而發(fā)揮強大的抗炎作用。蘆薈大黃素能抗炎、抗氧化，通過直接抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成［23］。枳實中含有大量的黃酮類化合物，橙皮苷和橙皮素通過ERK/Nrf2 信號通路增強了抗氧化細胞防御，減少轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、選擇性環(huán)氧化酶cox-2 等慢性炎癥的標(biāo)志物［24］。李梅［25］通過研究證實，大黃中的大黃素和厚樸中的厚樸酚對胃體環(huán)行肌條的收縮活動有抑制作用, 該作用可能與電壓依賴性鈣通道有關(guān)，進一步證實兩者能促進胃腸道的運動，從而起到理氣，促進胃腸道功能恢復(fù)的作用。與本研究結(jié)果相符。

本研究在通路富集分析時，發(fā)現(xiàn)了多條已被證實的炎癥通路，其中HIF-1 信號通路、VEGF 信號通路、ErbB信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、IL-17 信號通路。祁蕾[26]研究發(fā)現(xiàn)，大黃素可以抑制NF-KB/HIF-1α-COX-2 信號通路，從而發(fā)揮抗炎作用。K. Gopinath 等[27]研究發(fā)現(xiàn)枳實中的柚皮苷通過激活Nrf2 誘導(dǎo)NAD（P）H：醌氧化還原酶-1、血紅素氧合酶-1、谷胱甘肽s -轉(zhuǎn)移酶P1、γ-谷氨酰胺半胱氨酸連接酶mRNA 表達，降低腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、環(huán)氧化酶-2（COX-2）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）等促炎介質(zhì)的表達，從而調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。小承氣湯參與的癌癥通路12條，其中包含結(jié)腸直腸癌、胃癌膀胱癌、胰腺癌，也提示小承氣湯可能會緩解潰瘍引起的癌變。前期研究表明，小承氣湯能緩解癌癥病人由于服用阿片類藥物所致便秘、腹痛等癌性疼痛，提高患者生存質(zhì)量[28]。另外，小承氣湯還花生四烯酸代謝途徑，參與生物的脂代謝和炎癥反應(yīng)，該途徑的主要代謝產(chǎn)物之一前列腺素E2（PGE2），Zhang 等[29]將前列腺素E2（PGE2）應(yīng)用于小鼠切除性皮膚損傷模型，發(fā)現(xiàn)PGE2可促進抗炎和血管生成相關(guān)因子的分泌，緩解炎癥反應(yīng)，增強組織再生潛力，對潰瘍面的自身修復(fù)起到促進作用。有研究表明，前列腺素E2還能增加血管壁的通透性，使腺體分泌黏液，起到屏障保護的作用［31，32］。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討經(jīng)典方劑小承氣湯在治療胃腸黏膜損傷中潛在的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制，篩選出21 種重要成分，其中大黃素、蘆薈大黃素、川陳皮素、橙皮素、柚皮素、桉葉油素等有較大度值，可能是治療消化道潰瘍的關(guān)鍵成分; 前列腺素G/H 合成酶2（PTGS2）、胱天蛋白酶-3（CASP3）、RACα 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、絲裂原活化蛋白激酶1（MARK1）、Toll 樣受體4（TLR4）在92 個靶點中擁有較高的度值，可能是藥物作用的關(guān)鍵靶點，其中靶點涉及到HIF-1 信號通路、VEGF 信號通路、ErbB 信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、IL-17 信號通路，血清素的神經(jīng)突觸，內(nèi)分泌系統(tǒng)的雌激素信號通路、花生四烯酸代謝途徑，也是發(fā)揮抗消化性潰瘍作用的主要潛在信號通路。本研究的優(yōu)點在于，其能規(guī)避傳統(tǒng)的藥理實驗周期長、干擾因素多的弊端，利用數(shù)據(jù)庫的整合及大數(shù)據(jù)的分析，將醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、生物信息學(xué)、計算機軟件科學(xué)等眾多學(xué)科基本理論和研究技術(shù)綜合集成，讓我們從一個新的角度，重新認(rèn)識經(jīng)典方劑小承氣湯，揭示其治療便秘、腸梗阻等疾病復(fù)雜的作用機制，并發(fā)現(xiàn)新的潛在的治療作用，預(yù)測出治療胃腸道黏膜損傷、胃腸道慢性炎癥、癌癥等新的作用靶點和通路，為今后對該組方的研究提供新思路、新方向。