高效液相色譜法測定降糖寧膠囊中人參皂苷Rg1、Re、Rb1 的含量

崔小菲，王軍棟

（煙臺市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心,山東 264670）

降糖寧膠囊處方由人參、山藥、知母、黃芪、甘草等中藥組成，具有益氣、養(yǎng)陰、生津的功效，廣泛用于糖尿病氣陰兩虛者。劉成功等[1-3]研究發(fā)現(xiàn)，降糖寧膠囊能有效提高肌體對胰島素的敏感性，控制患者病情，具有一定的臨床推廣價(jià)值。但降糖寧膠囊的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)比較簡單，作為方中的君藥人參，標(biāo)準(zhǔn)中僅有對其的薄層色譜鑒別而無定量標(biāo)準(zhǔn)，因此本試驗(yàn)對人參中3 種皂苷成分進(jìn)行了定量測定，為今后降糖寧膠囊的標(biāo)準(zhǔn)提高提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1．1 儀器 LC-20A 高效液相色譜儀（日本島津公司）；AB265-S 電子天平（瑞士梅特勒-特利多儀器有限公司）；KQ-300DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1．2 試藥 人參皂苷Rg1對照品（批號110703-201731，110703-201933）、人參皂苷Rb1對照品（批號110704-201625，110704-202028）、人參皂苷Re 對照品（批號110754-201724，110754-201626）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇均為色譜純（美國霍尼韋爾公司），水為ELGA 超純水儀制備的超純水。降糖寧膠囊樣品來自山東省各地市藥檢機(jī)構(gòu)抽樣。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Waters SymmetryshieldTMRP18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動相A 為乙睛，流動性B 為水，按表1 中擬定的方法進(jìn)行梯度洗脫；流速：1.0 ml/min；檢測波長為203 nm；柱溫：30 ℃。進(jìn)樣量10 μl。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取人參皂苷Rg1對照品10.04 mg，人參皂苷Re 對照品10.15 mg、人參皂苷Rb1對照品10.21 mg，置50 ml 量瓶中，加甲醇40 ml充分振搖溶解，放冷后加甲醇至刻度，搖勻，即得到人參皂苷Rg1濃度為0.200 8 mg/ml、人參皂苷Re 濃度為0.203 0 mg/ml、人參皂苷Rb1濃度為0.204 2 mg/ml 的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取降糖寧膠囊的內(nèi)容物，混勻，研細(xì)，精密稱取1 g，置50 ml 具塞三角燒瓶中，精密加入甲醇10 ml，密塞，稱定重量，超聲30 min，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)加到原先稱定的重量，搖勻，0.45 μm 濾膜濾過，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按照降糖寧膠囊的處方比例和工藝制備缺少人參的陰性樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果表明陰性對照對測定無干擾。見圖1。

圖1 混合對照品（A）陰性樣品（B）供試品（C）HPLC 色譜圖

2.4 線性關(guān)系考查 精密稱取人參皂苷Rg1對照品（批號110703-201933，含量以93.4%計(jì)）20.37 mg、人參皂苷Re 對照品（批號110754-201626，含量以97.4%計(jì)）19.90 mg、人參皂苷Rb1對照品（批號110704-202028，含量以93.1%計(jì)）19.91 mg，置同一25 ml 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，再分別精密量取上述溶液0.1、0.5、1、2、3 和5 ml，分別置5 ml 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得。分別精密吸取上述6 個(gè)濃度對照品溶液各10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，分別測定峰面積值。分別以對照品的濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，得到人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的線性回歸方程分別為Y=3 611 257.17X（r=1）、Y=2 807 605.10X（r=1）和Y=2 692 057.39X（r=1）；人參皂苷Rg1在0.015 22 ～0.7610 mg/ml、人參皂苷Re 在0.015 51 ～0.775 3 mg/ml、人參皂苷Rb1在0.014 83 ～0.741 4 mg/ml 濃度范圍內(nèi)與峰面積均呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取人參皂苷Rg1（0.200 8 mg/ml）、人參皂苷Re（0.203 0 mg/ml）、人參皂苷Rb1（0.204 2 mg/ml）混合對照品溶液10 μl，按照高效液相色譜法，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測其峰面積。結(jié)果人參皂苷Rg1、Re 和Rb1峰面積RSD 分別為0.14%、0.21%和0.92%，顯示儀器精密度數(shù)據(jù)符合要求，而且試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠，完全可用于指標(biāo)成分的檢測分析。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品適量（批號181201），照“2.1.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液。每隔5 h 進(jìn)樣一次，每次10 μl，測定人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的峰面積積分值，一共25 h，用以確定供試品溶液檢測的成分是否在這段時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果顯示，3 個(gè)測定成分的色譜峰的峰面積變化不大，人參皂苷Rg1、Re 和Rb1峰面積RSD 分別為0.28%、0.99%和0.13%，表明供試品溶液在25 h 內(nèi)穩(wěn)定性非常好，不會對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，也完全能夠滿足在實(shí)際生產(chǎn)過程中的測定需要。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品適量（批號181201），照“2.1.2”項(xiàng)下方法分別平行制備供試品溶液6 份。分別精密吸取對照品溶液10 μl 和6 份供試品溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀，測定，計(jì)算。結(jié)果發(fā)現(xiàn)6份樣品的含量差別不大，人參皂苷Rg1、Re 和Rb1含量之和RSD 為0.40%，表明所擬定的含量測定方法的重復(fù)性完全符合要求。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已測知含量的自制樣品（人參皂苷Rg1含量為0.038 0 %、人參皂苷Re 含量為0.014 7 %、人參皂苷Rb1含量為0.017 3 %）0.5 g，共6 份，分別置6 個(gè)50 ml 置具塞錐形瓶中，每瓶分別精密加入人參皂苷Rg1（濃度為0.020 08 mg/ml）、人參皂苷Re（濃度為0.020 30 mg/ml）、人參皂苷Rb1（濃度為0.020 42 mg/ml） 混合對照品溶液5 ml 及甲醇5 ml，密塞，稱定重量，超聲（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，取出，放冷，再分別稱定每份重量，分別用甲醇補(bǔ)足每份減失的重量，搖勻，0.45 μm 濾膜濾過，即得。分別精密吸取對照品溶液10 μl 和上述制備的6 份供試品溶液各10 μl，分別各自注入高效液相色譜儀，測定，計(jì)算。結(jié)果人參皂苷Rg1平均回收率為97.68%，RSD 為1.34%；人參皂苷Re 平均回收率為101.25%，RSD 為1.97%；人參皂苷Rb1平均回收率為95.10%，RSD 為1.71%。見表2-4。

表2 人參皂苷Rg1 加樣回收率考查結(jié)果

表3 人參皂苷Re 加樣回收率考查結(jié)果

表4 人參皂苷Rb1 加樣回收率考查結(jié)果

2.9 樣品測定 按照“2.2.2”項(xiàng)下方法供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測定17 批樣品中人參皂苷Rg1、Re 和Rb1的含量，測定結(jié)果見表5。

表5 各抽驗(yàn)樣品成分測定結(jié)果

3 討論

由于降糖寧膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定時(shí)間較早，標(biāo)準(zhǔn)比較簡單，雖然人參為方中君藥，但在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中卻并無人參的定量標(biāo)準(zhǔn)。何玲利等[4，5]曾經(jīng)采用薄層掃描法分別測定過降糖寧膠囊中人參Rg1和Re 的含量，但薄層掃描法測定過程繁瑣，重復(fù)性難以達(dá)到理想效果。

在本次試驗(yàn)中，分別考查了不同廠家品牌色譜柱：Waters SymmetryshieldTMRP18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）、SHISEIDOMG C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），按上述擬定好的試驗(yàn)條件進(jìn)行試驗(yàn)；結(jié)果人參皂苷Rg1色譜峰的理論塔板數(shù)、對稱因子都合格，表明擬定的試驗(yàn)條件適用范圍合理。同時(shí)考查了不同提取溶劑對結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)甲醇提取降糖寧膠囊中人參皂苷的提取效率高、干擾少，效果最好，因此提取溶劑被確定為甲醇。在提取方式的考查中發(fā)現(xiàn)，對于人參皂苷使用超聲提取效果明顯高于加熱回流提取，并且所用的時(shí)間比較短而利于提高效率縮短周期，故而選擇超聲提取的方式；超聲提取30 min 與45 min 效果相當(dāng)，表明30 min 的時(shí)間足夠?qū)⑺璧某煞痔崛〕鰜?，故確定提取方法為超聲提取30 min。

分析17 批降糖寧膠囊的測定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)企業(yè)間含量差異較大，許多廠家的人參投料可能并未達(dá)到處方中的含量，有的可能是采購了不合格的人參，有的可能減少了投料的量，有的甚至可能以人參莖葉進(jìn)行投料。由于人參屬于貴重藥材，因此對人參皂苷進(jìn)行限量制定是必要的。通過本次試驗(yàn)，建議進(jìn)一步提高降糖寧膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為廣大人民群眾的安全用藥提供更加有效的保證。