山東省鐵線蓮屬植物鎮(zhèn)痛抗炎作用的試驗(yàn)評(píng)價(jià)

楊守娟

（山東中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，山東 264199）

威靈仙收錄于2015 版《中國藥典》，具有祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛之功，用于風(fēng)濕痹痛，肢體麻木，筋脈拘攣，屈伸不利，骨哽咽喉等癥［1］。《本草綱目》中記載“威言其性猛也，靈仙言其功效”。本品辛散而通，性急善走，能宣通五臟、十二經(jīng)絡(luò)，故通絡(luò)止痹痛效果強(qiáng)［2］?，F(xiàn)代藥理研究表明，威靈仙水煎劑有鎮(zhèn)痛消炎作用［3］，可治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)疼痛。威靈仙的化學(xué)成分有皂苷類化合物、黃酮化合物、揮發(fā)油等，藥理作用有抗癌活性［4］、抗炎鎮(zhèn)痛活性［5，6］、抗菌活性［7］。威靈仙在2015 版《中國藥典》中只收載3 個(gè)品種為正品來源，即毛茛科植物威靈仙Clematis chinensisOsbeck、東北鐵線蓮Clemati s manshuricaRupr、棉團(tuán)鐵線蓮Clematis hexapetalaPall的干燥根及根莖。而毛茛科鐵線蓮屬植物在山東分布廣，品種較多，資源豐富，主要有褐紫鐵線蓮（Clematis fuscaTurcz）、威 靈仙（C.chinensisOsbeck）、棉團(tuán)鐵線蓮（Clematis haxapetalaPall）、太行鐵線蓮（Clematis kirilowiiMaxim）、大葉鐵線蓮（Clematis heracleifoliaDC）、毛果揚(yáng)子鐵線蓮 [Clematis ganpiniana（Levl.et Vant.）Tamura Var.tenuisepala（Maxim.）C.T.ting]、煙 臺(tái)山蓼（Clematis haxapetalaPall. var.tchefouensisS.Y.Hu）等品種［8］，分布于山東各大山區(qū)，如嶗山、艾山、泰山等。在民間，這些品種在用法上與威靈仙相似，用于治療頭、胃、腹肌及關(guān)節(jié)疼痛。本課題以小鼠熱板法、冰醋酸所致小鼠扭體法研究山東省分布的鐵線蓮屬植物的鎮(zhèn)痛作用；以二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳腫脹研究其抗炎作用，對(duì)鐵線蓮屬植物的藥效作用進(jìn)行比較研究，旨在控制中藥的質(zhì)量，辨別藥材的真?zhèn)?，保證臨床用藥的有效性和安全性；同時(shí)擴(kuò)大藥源，促進(jìn)新藥開發(fā)。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)昆明種小鼠，體質(zhì)量18 ～21 g，合格證號(hào)：1902048，由煙臺(tái)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試驗(yàn)試劑 二甲苯（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），冰醋酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 試驗(yàn)儀器 數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海力辰邦酉儀器科技有效公司），上海沙遜機(jī)械秒表504 田徑運(yùn)動(dòng)比賽科學(xué)試驗(yàn)計(jì)時(shí)器，日本島津AUW220D 數(shù)顯電子分析天平（0.1 mg）。

1.4 試驗(yàn)藥品 威靈仙（C.chinensisOsbeck，購于山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥房）；褐紫鐵線蓮（Clematis fuscaTurcz）、大葉鐵線蓮（Clematis heracleifoliaDC）、毛果揚(yáng)子鐵線蓮[Clematis ganpiniana（Levl.et Vant.）Tamura Var.tenuisepala（Maxim.）C.T.ting]、 煙臺(tái)山蓼（Clematis haxapetalaPall. var.tchefouensisS.Y.Hu）的干燥根和根莖，采自山東嶗山。上述藥材經(jīng)山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校王興順老師鑒定為正品。

1.5 藥液制備 取藥材粗粒，加10 倍量蒸餾水浸泡30 min 后煎煮，沸后用文火煮60 min，濾出煎液；藥渣加8倍量水，沸后文火煮60 min，濾出煎液，合并濾液，70 ℃濃縮至規(guī)定量。

1.6 給藥劑量的設(shè)計(jì) 按照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中人與動(dòng)物體表面積折算的等效劑量設(shè)計(jì)給藥劑量［9］。威靈仙按照2015 版《中國藥典》規(guī)定劑量換算成小鼠等效劑量，相當(dāng)于本試驗(yàn)的小劑組，即0.74 g/ml；褐紫鐵線蓮、大葉鐵線蓮、毛果揚(yáng)子鐵線蓮、煙臺(tái)山蓼設(shè)兩個(gè)劑量組，即與威靈仙等劑量的小劑組0.74 g/ml 和3 倍量的大劑組2.22 g/ml。

2 試驗(yàn)方法

2.1 小鼠熱板鎮(zhèn)痛試驗(yàn) 按文獻(xiàn)法［9，10］調(diào)節(jié)恒溫水浴，水溫恒定在（55±0.5）℃，將500 ml 燒杯放入其中，使燒杯底部接觸水面。每次取雌性小鼠1 只，放入燒杯內(nèi)。記錄自放入燒杯至出現(xiàn)舔足所需時(shí)間（秒），作為該鼠的痛閾值。凡30 s 內(nèi)不出現(xiàn)舔足者，棄之不用。依次測量各小鼠的痛閾值。取預(yù)選合格（痛閾值在5～30 s）的昆明種雌性小鼠100 只，隨機(jī)分為10 組，即生理鹽水組、威靈仙煎劑組、試驗(yàn)藥材大劑組、試驗(yàn)藥材小劑組，每組10 只。各組灌胃1 次/d，1 ml/次，連續(xù)3 d。

檢測指標(biāo)：與末次給藥后的30、60、90 和120 min測定各鼠痛閾值。若小鼠在熱板上60 s 仍無痛覺反應(yīng)，應(yīng)取出，按60 s 計(jì)。結(jié)果記錄表內(nèi)，按不同時(shí)間測定的各小鼠痛閾平均值計(jì)算用藥后痛閾提高的百分率。痛閾提高值=(給藥后平均痛閾值-給藥前平均痛閾值)，痛閾提高值為負(fù)數(shù)時(shí)，按0 計(jì)。統(tǒng)計(jì)方法：計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)觀察其組間差異。

2.2 冰醋酸扭體試驗(yàn) 取昆明種小鼠100 只，雌雄各半，隨機(jī)分10 組，每組10 只，分組同上，每日灌胃1次，每次1 ml，連續(xù)3 日，于末次給藥后60 min，各鼠腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2 ml/只。

檢測指標(biāo)：觀察并記錄注射醋酸溶液后15 min 內(nèi)出現(xiàn)扭體反應(yīng)（腹部收縮內(nèi)凹、伸展后肢、臀部抬高、蠕行）的次數(shù)及時(shí)間。計(jì)算藥物的鎮(zhèn)痛百分率。鎮(zhèn)痛率=（對(duì)照組平均扭體次數(shù)-給藥組平均扭體次數(shù)）/對(duì)照組平均扭體次數(shù)×100%。統(tǒng)計(jì)方法：計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)觀察其組間差異。

2.3 二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳廓腫脹試驗(yàn) 按文獻(xiàn)法［9，10］將昆明種小鼠100 只，雌雄各半，隨機(jī)分成10 組，每組10 只，分組同上。各組灌胃1 次/d，1 ml/次，連續(xù)3 d，末次給藥后60 min，于小鼠左耳兩面涂100%二甲苯0.1 ml/只致腫脹，右耳不涂為正常耳。

檢測指標(biāo)：4 h 后脫頸椎處死小鼠，用8 mm 打孔器沖下左耳和右耳同一部位的圓片，于分析天平上稱重。左耳重量減去右耳重量為腫脹度，按以下公式計(jì)算：抑制率（%）=（對(duì)照組腫脹度-給藥組腫脹度）/對(duì)照組腫脹度×100%。統(tǒng)計(jì)方法：計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)觀察其組間差異。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)分析 用SPSS 13.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用+s表示，計(jì)數(shù)資料采用Ridit 檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)熱板致小鼠鎮(zhèn)痛的影響 與生理鹽水組比較，各組的給藥前痛閾無差異，說明分組均勻；第30、60、90 和120 min 時(shí)，威靈仙、大劑褐紫鐵線蓮組、大劑大葉鐵線蓮組、大劑毛果揚(yáng)子鐵線蓮組痛閾值有顯著提高（P＜0.05）；且與威靈仙組比，大劑褐紫鐵線蓮組、大劑大葉鐵線蓮組、大劑毛果揚(yáng)子鐵線蓮組痛閾值無差異（P＞0.05）。說明大劑的褐紫鐵線蓮、大葉鐵線蓮、毛果揚(yáng)子鐵線蓮與常規(guī)劑量的威靈仙具有相似的鎮(zhèn)痛效果。見表1。

表1 山東省鐵線蓮屬植物水煎液對(duì)熱板致小鼠痛閾提高值的影響（n=10，±s）s

表1 山東省鐵線蓮屬植物水煎液對(duì)熱板致小鼠痛閾提高值的影響（n=10，±s）s

注：與生理鹽水組比較，*P ＜0.05；藥后與威靈仙組比較，#P ＞0.05

組別 給藥前痛閾 藥后痛閾提高值藥后30 min 藥后60 min 藥后90 min 藥后120 min生理鹽水組 12.48±2.12 0.41±2.19 0.64±2.22 1.5±2.19 1.00±2.28威靈仙組 12.36±2.08 11.12±2.31* 12.22±2.27* 13.12±2.72* 10.10±0.81*大劑褐紫鐵線蓮組 12.56±2.41 9.92±2.36*# 10.91±2.63*# 12.03±2.43*# 7.92±2.19*#小劑褐紫鐵線蓮組 12.38±2.51 2.01±2.26 3.10±2.13 4.18±2.23 2.18±2.36大劑大葉鐵線蓮組 12.23±2.55 10.25±2.07*# 14.29±2.18*# 15.35±2.25*# 10.45±2.26*#小劑大葉鐵線蓮組 12.62±2.28 0.94±2.23 2.76±2.51 1.87±2.61 0.84±2.13大劑毛果揚(yáng)子鐵線蓮組 12.58±2.38 9.9±2.25*# 12.91±2.38*# 13.59±2.26*# 10.9±2.16*#小劑毛果揚(yáng)子鐵線蓮組 12.69±2.46 2.32±2.16 3.79±2.36 4.69±2.69 0.79±2.31大劑煙臺(tái)山蓼組 12.66±2.71 2.62±2.32 3.46±2.27 4.85±2.05 0.83±2.23小劑煙臺(tái)山蓼組 12.86±2.19 1.6±2.09 1.62±2.63 1.72±2.67 0.12±2.63

3.2 抑制冰醋酸致小鼠扭體反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果 與生理鹽水組比，威靈仙、大劑褐紫鐵線蓮組、大劑大葉鐵線蓮組、大劑毛果揚(yáng)子鐵線蓮組可明顯降低小鼠扭體次數(shù)（P＜0.05）；且與威靈仙組比，大劑褐紫鐵線蓮組、大劑大葉鐵線蓮組、大劑毛果揚(yáng)子鐵線蓮組小鼠扭體次數(shù)無差異（P＞0.05）。也就是說大劑的褐紫鐵線蓮、大葉鐵線蓮、毛果揚(yáng)子鐵線蓮與常規(guī)劑量的威靈仙具有相似的鎮(zhèn)痛效果。 見表2。

表2 對(duì)冰醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響（±s）

表2 對(duì)冰醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響（±s）

注：與生理鹽水組比較，*P ＜0.05；與威靈仙組比較，#P ＞0.05

組別 小鼠（只） 扭體次數(shù) 鎮(zhèn)痛率（%）生理鹽水組 10 48±16 -威靈仙組 10 30±10 37.5*大劑褐紫鐵線蓮組 10 33±9 31.2*#小劑褐紫鐵線蓮組 10 42±11 12.5大劑大葉鐵線蓮組 10 34±10 29.2*#小劑大葉鐵線蓮組 10 38±8 20.8大劑毛果揚(yáng)子鐵線蓮組 10 32±7 33.3*#小劑毛果揚(yáng)子鐵線蓮組 10 40±12 16.7大劑煙臺(tái)山蓼組 10 39±10 18.8小劑煙臺(tái)山蓼組 10 42±7 12.5

3.3 抑制二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳廓腫脹試驗(yàn)結(jié)果 與生理鹽水組比，威靈仙、大劑褐紫鐵線蓮組、大劑大葉鐵線蓮組、大劑毛果揚(yáng)子鐵線蓮組均可明顯降低小鼠耳廓腫脹度，提高抑制率（P＜0.05）。 見表3。

表3 對(duì)二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳廓腫脹反應(yīng)的影響（±s）

表3 對(duì)二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳廓腫脹反應(yīng)的影響（±s）

注：與生理鹽水組比較，*P ＜0.05

組別 小鼠（只） 腫脹度（%） 抑制率（%）生理鹽水組 10 8.52±2.85 -威靈仙組 10 3.27±1.52 61.6*大劑褐紫鐵線蓮組 10 5.35±1.41 37.2*小劑褐紫鐵線蓮組 10 6.69±1.59 21.5大劑大葉鐵線蓮組 10 4.98±1.98 41.9*小劑大葉鐵線蓮組 10 7.06±2.06 17.1大劑毛果揚(yáng)子鐵線蓮組 10 5.51±1.87 35.3*小劑毛果揚(yáng)子鐵線蓮組 10 7.85±2.18 7.8大劑煙臺(tái)山蓼組 10 7.65±2.63 10.2小劑煙臺(tái)山蓼組 10 7.98±2.10 6.3

4 討論

許多中藥為多來源品種，對(duì)親緣關(guān)系相近的品種進(jìn)行相應(yīng)藥效學(xué)研究，以控制中藥的質(zhì)量，辨別藥材的真?zhèn)?，為保證臨床用藥的有效性和安全性提供理論依據(jù)。以其擴(kuò)大藥源，促進(jìn)新藥開發(fā)。

本課題首次對(duì)山東分布的鐵線蓮屬植物的藥效作用進(jìn)行比較研究。以《中國藥典》收載的威靈仙為抗炎、鎮(zhèn)痛的陽性對(duì)照，對(duì)試驗(yàn)藥材進(jìn)行比較研究，從研究結(jié)果可以看出，褐紫鐵線蓮、大葉鐵線蓮、毛果揚(yáng)子鐵線蓮大劑組的抗炎、鎮(zhèn)痛效果與威靈仙療效相似, 且有隨給藥濃度升高藥效增強(qiáng)的趨勢。也就是說，加大上述三味藥的劑量可以用于鎮(zhèn)痛抗炎的治療。而本試驗(yàn)顯示煙臺(tái)山蓼不具明確的鎮(zhèn)痛抗炎效果，是否可用于臨床鎮(zhèn)痛消炎，有待進(jìn)一步探討。

山東省分布的鐵線蓮屬植物各化學(xué)成分的藥理作用機(jī)制及其構(gòu)效關(guān)系的研究尚不夠深入，下一步將進(jìn)一步研究藥理與構(gòu)效的關(guān)系。