miR-30b和miR-30d對胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR8/SVneo遷移能力的影響

仲玉霞

子癇前期（preeclampsia，PE）是常見的妊娠相關(guān)疾病，全球發(fā)病率為3%~5%［1］。PE發(fā)病機(jī)制目前尚不完全明確，有研究認(rèn)為其與胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖凋亡異常、浸潤能力不足等相關(guān)［2］。miRNA是指非編碼的小分子RNA，在多種生理過程中發(fā)揮重要作用，且多種miRNA的異常表達(dá)可能與PE的發(fā)病相關(guān)［3］。 miR-30b 和 miR-30d 是 miR-30 的家族成員，研究發(fā)現(xiàn)二者在小鼠PE胎盤組織中表達(dá)異常，可能與PE的發(fā)病有關(guān)［4］。筆者檢測miR-30b和miR-30d在人胎盤組織中的表達(dá)及其在胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中的含量，并通過干預(yù)其表達(dá)，分析其對滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 樣本收集 選取2016年6月—2018年1月在筆者所在醫(yī)院分娩的10例子癇前期產(chǎn)婦為PE組，年齡（29.7±3.9）歲。 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合 PE 診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）分娩孕周≥28 周；（3）單胎；（4）無原發(fā)性糖尿病、高血壓、冠心病等內(nèi)外科并發(fā)癥。PE組排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）排除自發(fā)性流產(chǎn)或?qū)m內(nèi)死胎；（2）胎兒先天性疾病，染色體異常；（3）通過輔助生殖技術(shù)而懷孕。10例正常足月分娩的產(chǎn)婦作為對照組，年齡（29.4±3.8）歲；兩組產(chǎn)婦均對該研究知情同意，且研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意。收集兩組產(chǎn)婦分娩后的胎盤組織：胎盤娩出15 min內(nèi)剪取胎盤母體面中央近臍帶根部胎盤組織4 cm3，避開壞死部位、鈣化點(diǎn)等部位，清洗后立即放置于液氮中，-80℃冰箱保存，用于批量檢測。

1.2 細(xì)胞及主要試劑 人永生化滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR8/SVneo購自上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫，10%胎牛血清， 青霉素 （100 μg/ml）， 鏈霉素 （100 μg/ml），RPMI1640（100 μg/ml）培養(yǎng)基購自生物工程（上海）股份有限公司。miR-30b mimic、miR-30b mimic對照質(zhì)粒 （mimic-NC），miR-30d inhibitor、miR-30d inhibitor對照質(zhì)粒（inhibitor-NC）購自 Genecopoeia公司。

1.3 PCR檢測miR-30b和miR-30d在胎盤組織中的表達(dá) 采用RT-PCR檢測胎盤組織中miR-30b和miR-30d的表達(dá)。

反應(yīng)條件為：95℃10min，95℃15s，72℃15s，共358個循環(huán)。U6作為miR-30b和miR-30d的內(nèi)參，所有引物購自上海生工，引物如下：

miR-30b 上游引物：5’-ACACTCCAGCTGGGC TGGGATGTGGATG-3’，

下游引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGT-3’；

miR-30d 上游引物：5’-AACCTGAGTGGAGC AGA-3’，

下游引物：5’-TGTAAACATCCCCGAC-3’；

內(nèi)參 U6上游引物：5’-CTTCGGCACCACATA TACTAAAT-3’，

下游引物：5’-CAGGGGCCATGCTAAATCTTC-3’。 用 2-ΔΔCt法計算 mRNA 表達(dá)的倍數(shù)。

1.4 過表達(dá)miR-30b和抑制miR-30d對HTR8/SVneo細(xì)胞遷移能力的影響 將細(xì)胞分為miR-30b-mimic組和mimic-NC組、miR-30d inhibitor和inhibitor-NC組，分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒；同時設(shè)置空白對照組（Blank）。RT-PCR檢測各組細(xì)胞中miR-30b和miR-30d的水平以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。Transwell檢測各組細(xì)胞的遷移能力：細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-30b和miR-30d 24 h后，進(jìn)行胰酶消化，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化。清洗細(xì)胞，并用無血清培養(yǎng)基重懸，取 200 μl（含 1×105個細(xì)胞）細(xì)胞培養(yǎng)在 Transwell小室中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，用棉簽拭去Transwell小室未遷移過底膜的細(xì)胞，用-20℃預(yù)冷的甲醇固定遷移過小室底膜的下部細(xì)胞，約10 min，用蘇木素染色10 min，用蒸餾水浸洗，200倍顯微鏡下挑選9個不同視野進(jìn)行計數(shù)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料用（）表示，兩組間行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-30b和miR-30d在胎盤組織中的表達(dá)RT-PCR結(jié)果如表1所示，與對照組相比，PE組胎盤組織中miR-30b相對表達(dá)量顯著升高，miR-30d相對表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 兩組miR-30b和miR-30d表達(dá)水平比較（）

表1 兩組miR-30b和miR-30d表達(dá)水平比較（）

組別 n miR-30b miR-30d對照組 10 0.76±0.25 0.90±0.23 PE 組 10 1.32±0.48 0.65±0.26 t值 - 3.272 2.277 P值 - 0.004 0.035

2.2 miR-30b和miR-30d對細(xì)胞遷移能力的影響

2.2.1 PCR檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，RT-PCR檢測結(jié)果顯示 （圖1）：與Blank和mimic-NC組相比，miR-30b-mimic組miR-30b表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與Blank和inhibitor-NC組相比，miR-30d inhibitor組miR-30d表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2.2 Transwell檢測各組細(xì)胞遷移能力變化 如圖2所示，轉(zhuǎn)染24 h后，與Blank組、mimic-NC、inhibitor-NC相比，miR-30b-mimic組和 miR-30d inhibitor組的細(xì)胞遷移數(shù)顯著減少（P＜0.05），提示細(xì)胞遷移能力降低。

圖2見封三。

3 討論

圖1 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后各組細(xì)胞中miR-30b和miR-30d的相對含量

PE是由多種因素導(dǎo)致的妊娠期特異性疾病，臨床表現(xiàn)為蛋白尿、高血壓等，并伴有常見并發(fā)癥，病情嚴(yán)重情況下可危及母嬰生命［5］，且PE發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，研究尚無統(tǒng)一結(jié)論［6］。大部分研究認(rèn)為胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、分化、浸潤、凋亡等功能異?？梢鹛ケP血管重塑障礙，致使胎盤組織缺血缺氧，最終導(dǎo)致PE發(fā)生［7］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在不良生長的胎盤及滋養(yǎng)層細(xì)胞中存在多種異常表達(dá)的miRNAs，可能參與 PE 的發(fā)生發(fā)展［8］。Lu 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，miR-137可通過調(diào)節(jié)雌激素受體相關(guān)受體作用于胎盤滋養(yǎng)型細(xì)胞的增殖和遷移。Ji等［10］研究表明，PE患者胎盤組織中miR-136呈現(xiàn)高表達(dá)，通過影響間充質(zhì)干細(xì)胞和血管生成促進(jìn)PE的生成。 Ding 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，miR-128a 可誘導(dǎo) HTR-8/SVneo細(xì)胞凋亡促進(jìn)PE發(fā)生。另有研究指出，子癇前期產(chǎn)婦胎盤組織存在miR-30b表達(dá)升高，miR-30d表達(dá)降低［12］。動物研究發(fā)現(xiàn)miR-30b在孕鼠的胎盤組織中呈顯著性高表達(dá)，以多種途徑參與調(diào)控胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移侵襲等功能［13］。目前關(guān)于miR-30家族與PE相關(guān)性的研究較少，其機(jī)制仍不明確。該研究結(jié)果提示miR-30b和miR-30d的異常表達(dá)可能參與PE的發(fā)生發(fā)展。現(xiàn)有研究顯示，滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移和侵襲能力不足，子宮螺旋動脈重塑障礙導(dǎo)致胎盤灌注不足是引起PE特征性病理變化的主要原因，也是PE發(fā)病的關(guān)鍵因素［14］。為驗(yàn)證miR-30b、miR-30d與PE相關(guān)性并探討其機(jī)制，筆者進(jìn)一步進(jìn)行了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以探討其與細(xì)胞遷移能力的相關(guān)性。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染相關(guān)質(zhì)粒分別上調(diào)HTR-8/SVneo細(xì)胞中miR-30b水平和下調(diào)miR-30d水平后，細(xì)胞遷移能力顯著降低（P＜0.05），提示miR-30b過表達(dá)和miR-30d低表達(dá)可抑制滋養(yǎng)層HTR8/SVneo細(xì)胞的遷移能力。因此可以推測，miR-30b上調(diào)及miR-30d下調(diào)與胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移能力呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)其在胎盤組織中異常表達(dá)時，可能導(dǎo)致滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤能力不足，從而導(dǎo)致血管重塑障礙促進(jìn)PE的發(fā)生和進(jìn)展。但其詳細(xì)的調(diào)控機(jī)制還不明確，尚需進(jìn)一步研究。