智能抗逆微生物細(xì)胞工廠與綠色生物制造

許可，王靖楠，李春，

（1 清華大學(xué)化學(xué)工程系，工業(yè)生物催化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084； 2 北京理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，生物化工研究所，北京 100081）

當(dāng)前，全球81%以上的能源消耗依賴于化石燃料，大氣中的CO2濃度近幾十年來從（2～2.8）×10-4μL/L 急劇上升到4×10-4μL/L，導(dǎo)致嚴(yán)重的溫室效應(yīng)。如果持續(xù)目前的碳使用模式，預(yù)計(jì)到21 世紀(jì)中葉，大氣中CO2水平將上升到5×10-4μL/L，全球24%的動植物將面臨滅絕［1］。全球現(xiàn)有的發(fā)展模式過于依賴化石資源，以破壞環(huán)境為代價(jià)，必須尋求可持續(xù)發(fā)展之路［2］。利用可再生和低CO2排放的生物原料取代化石原料成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)。將生物元素引入到現(xiàn)有的、傳統(tǒng)的化工制造，發(fā)展綠色、可再生、安全可控的生物制造，解決目前人類面臨的環(huán)境問題、資源危機(jī)和能源可持續(xù)發(fā)展問題勢在必行［1］。鑒于此，科學(xué)家提出了全新的綠色生物制造體系。綠色生物制造以工業(yè)生物技術(shù)為核心，結(jié)合化學(xué)工程技術(shù)，從生物質(zhì)等可再生原料出發(fā)生產(chǎn)化學(xué)品、能源、材料、醫(yī)藥和食品等，可從源頭上降低碳排放，實(shí)現(xiàn)綠色清潔的生產(chǎn)工藝，改善化工產(chǎn)業(yè)“高能耗、高排放”和依賴化石資源的現(xiàn)有模式［3］。

隨著科技創(chuàng)新和技術(shù)進(jìn)步，綠色生物制造的產(chǎn)品空間進(jìn)一步拓展，發(fā)展前景更加廣闊，但也面臨一些問題，如在生產(chǎn)過程中，生產(chǎn)菌株經(jīng)常會受到培養(yǎng)環(huán)境擾動或自身代謝產(chǎn)物影響，對自身生長或代謝造成不利，稱為逆境脅迫［4-5］。包括高溫、酸堿擾動、有機(jī)溶劑、毒性副產(chǎn)物及機(jī)械損傷等［6-9］，在這些逆境脅迫下進(jìn)行生產(chǎn)，會導(dǎo)致生產(chǎn)菌株活力下降、產(chǎn)能降低、生產(chǎn)過程能耗大幅升高等，嚴(yán)重制約著綠色生物制造產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［2，10-11］。隨著生物技術(shù)與合成生物學(xué)的迅猛發(fā)展，產(chǎn)業(yè)界對能自主響應(yīng)發(fā)酵環(huán)境變化而又自行穩(wěn)定生產(chǎn)性能的優(yōu)良、智能和高效菌株的需求非常迫切。本文作者將從工業(yè)菌株的環(huán)境脅迫因子、微生物抗逆分子機(jī)制、智能抗逆基因線路設(shè)計(jì)等方面開展智能微生物細(xì)胞工廠的設(shè)計(jì)構(gòu)建與綠色生物制造的論述。

1 綠色生物制造中微生物細(xì)胞工廠面臨的環(huán)境脅迫因子

生物發(fā)酵過程是綠色生物制造的核心。微生物利用生物質(zhì)作為原料，廣泛生產(chǎn)燃料、氨基酸、表面活性劑、洗滌劑等產(chǎn)品，生物經(jīng)濟(jì)已從“糧食生物質(zhì)”步入“非糧生物質(zhì)”時(shí)代。然而，由于生物發(fā)酵過程具有產(chǎn)熱、酸堿度變化、酶催化影響、原料產(chǎn)物影響等因素，使高成本和高能耗逐漸成為產(chǎn)業(yè)特征。

生物乙醇作為綠色生物制造產(chǎn)業(yè)的典型產(chǎn)品，是目前全球最主要的液體可再生燃料，也是公認(rèn)的汽油最佳替代燃料［12］，作為生物乙醇發(fā)酵的“核心”，釀酒酵母的性能決定了生產(chǎn)過程的經(jīng)濟(jì)性和綠色指數(shù)。早在2004 年，Ingledew 等［13］對影響酵母生長和發(fā)酵各因子的“警戒水平”進(jìn)行了研究［圖1（a）］。他們發(fā)現(xiàn)，單一脅迫因子超出“警戒水平”會對酵母的生長及生產(chǎn)性能產(chǎn)生較大的影響，且各脅迫因子共同作用會產(chǎn)生負(fù)協(xié)同效應(yīng)。基于此，分析生物乙醇現(xiàn)行發(fā)酵工藝面臨的環(huán)境脅迫因子如下。

（1）高溫脅迫—酵母菌最適生長溫度通常在30℃左右，但是在生物乙醇發(fā)酵過程中，由于受到外部因素和酵母細(xì)胞自身代謝熱的影響，發(fā)酵罐內(nèi)溫度一般維持在32～37 ℃［14］，出現(xiàn)生長最適溫度和真實(shí)發(fā)酵溫度不匹配的情況［15］。發(fā)酵溫度的升高導(dǎo)致酵母細(xì)胞蛋白質(zhì)、染色體、細(xì)胞膜、細(xì)胞器等結(jié)構(gòu)的破壞，且進(jìn)一步引起細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基（ROS） 的升高， 產(chǎn)生氧化毒性［圖1（b）］［16］。

（2）高濃度乙醇脅迫—發(fā)酵中后期，高濃度乙醇對酵母造成有機(jī)溶劑脅迫，亦稱為產(chǎn)物抑制［17］。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)＜3.0%，其抑制作用可忽略，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)＞4.0%，對酵母菌株生長明顯抑制，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)一步提升到＞12.0%時(shí)，細(xì)胞膜的完整性遭到破壞，且嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)的折疊和染色體的正常功能，酵母生長和發(fā)酵停止甚至迅速死亡［圖1（c）］［18-19］。

（3）高糖醪導(dǎo)致的滲透壓脅迫—發(fā)酵前期，高濃度糖醪液造成發(fā)酵環(huán)境滲透壓升高，致使酵母脫水、導(dǎo)致細(xì)胞變形［20］。有研究表明，酵母細(xì)胞的最適滲透壓與2.6%的葡萄糖溶液相當(dāng)［21］。當(dāng)?shù)孜镏衅咸烟菨舛龋?%時(shí)，即使有足夠的氧存在，酵母細(xì)胞的生長速率也會明顯下降［22］。

（4）酸脅迫—發(fā)酵過程中pH 的擾動會對宿主細(xì)胞產(chǎn)生極大影響。燃料乙醇單個(gè)發(fā)酵罐容積均在上千立方米，從節(jié)省堿消耗費(fèi)用及減少酸堿中和產(chǎn)生鹽的角度，工業(yè)生產(chǎn)中均不控制發(fā)酵過程pH，由于雜菌污染及乙醇發(fā)酵過程產(chǎn)生副產(chǎn)物有機(jī)酸和CO2等，發(fā)酵初期pH 逐漸降低至2.5 左右，發(fā)酵中期隨著碳源的逐漸消耗，發(fā)酵過程副產(chǎn)物有機(jī)酸部分被吸收，pH 可逐漸回升［23］。酸脅迫導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的持續(xù)酸化，破壞對酸敏感的DNA，降低部分中性糖酵解酶的酶活，嚴(yán)重情況下會導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性，最終影響細(xì)胞的生長［24］［圖1（d）］。

脅迫因子幾乎存在于所有微生物發(fā)酵體系中，并且通常表現(xiàn)為多因子同時(shí)存在，產(chǎn)生脅迫效應(yīng)的疊加，嚴(yán)重制約了生物制造產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［14］。因此，構(gòu)建在多重脅迫條件下有良好智能表現(xiàn)的高版本微生物細(xì)胞工廠，為綠色生物制造迎來了新的機(jī)遇，也提出了新的挑戰(zhàn)。

圖1 釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇過程中面臨的脅迫因子［13-24］Fig.1 Stress factors faced in ethanol production by Saccharomyces cerevisiae［13-24］

2 微生物細(xì)胞抵抗環(huán)境脅迫的分子機(jī)制

微生物細(xì)胞工廠在脅迫環(huán)境下，其自身的基因表達(dá)、蛋白質(zhì)和代謝物會發(fā)生一系列的動態(tài)變化，調(diào)節(jié)內(nèi)在脅迫防御系統(tǒng)以維持細(xì)胞正常功能［25］。

2.1 單一脅迫因子在酵母細(xì)胞的傳導(dǎo)途徑

以釀酒酵母為例，研究人員針對不同的單一脅迫因子在酵母細(xì)胞的傳導(dǎo)方面進(jìn)行了相關(guān)研究。作為對熱脅迫的反應(yīng)，釀酒酵母通常表現(xiàn)為下列基因的轉(zhuǎn)錄變化：代謝相關(guān)酶（如己糖激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、6-磷酸脫氫酶等），抗氧化酶（如硫氧還蛋白3、硫氧還蛋白卟啉），熱激蛋白及其輔因子（如hsp104、hsp82、hsp60、hsp30、cpr1、sti1和zpr1）和全局轉(zhuǎn)錄因子（如hsf1、msn2/4 和yap1）等［26］；在高滲脅迫下，細(xì)胞生長和應(yīng)激反應(yīng)的信號網(wǎng)絡(luò)是相互協(xié)同的，RAS-PKA 途徑、細(xì)胞壁完整性途徑和SVG 途徑與脅迫信號傳導(dǎo)關(guān)系緊密，關(guān)鍵基因BCY1和Ras2的敲除可以增加RAS-PKA 通路的活性，提高對高滲的抵抗［27］；乙醇脅迫影響酵母細(xì)胞中包括葡萄糖和氨基酸的代謝，降低糖酵解途徑酶活。液泡和膜上的H＋-ATPase 系統(tǒng)似乎在乙醇脅迫的恢復(fù)過程中起著重要作用［28］；ROS 的積累和小熱激蛋白的表達(dá)波動則出現(xiàn)在多種脅迫因子的傳導(dǎo)過程［29］［圖2（a）］。

2.2 熱激應(yīng)答系統(tǒng)（heat shock response system）

熱激應(yīng)答系統(tǒng)由熱激轉(zhuǎn)錄因子（HSF）進(jìn)行調(diào)控，相關(guān)基因涉及蛋白質(zhì)合成、碳源代謝及細(xì)胞結(jié)構(gòu)等［30］。HSF 通常狀態(tài)下以單體或二聚體狀態(tài)存在，在脅迫條件下，無活性的HSF 形成多聚體，造成構(gòu)象的改變，使得活性區(qū)域暴露出來，與熱激元件的啟動子上長度為5個(gè)堿基的保守序列發(fā)生特異性結(jié)合，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因并翻譯形成熱激蛋白（HSP）。HSP 除主要參與維持蛋白質(zhì)天然構(gòu)象外，同時(shí)參與細(xì)胞的多種生理調(diào)節(jié)，對其抗脅迫提供幫助［31］［圖2（b）］。

圖2 微生物細(xì)胞抵抗環(huán)境脅迫的分子機(jī)制［29-33，39］Fig.2 Molecular mechanism underlying microbial cells'response to environmental stresses［29-33，39］

2.3 抗氧化防御系統(tǒng)（antioxidant defense system）

抗氧化防御系統(tǒng)由酶促防御體系和非酶促防御體系組成。脅迫環(huán)境會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大量活性氧自由基積累，細(xì)胞面臨氧化脅迫，酶促防御體系啟動，清除胞內(nèi)活性氧自由基和過氧化氫。超氧化物歧化酶（SOD）通過清除機(jī)體內(nèi)·O2-來保護(hù)細(xì)胞；過氧化氫酶可以促使H2O2分解，清除細(xì)胞內(nèi)的H2O2；過氧化物酶行使多種保護(hù)功能，包括抗氧化、分子伴侶功能和調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。非酶防御體系由小分子物質(zhì)組成，包括谷胱甘肽、硫氧還蛋白、維生素C等，作為還原劑清除自由基的小分子［17，32-33］［圖2（c）］。

2.4 蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)（protein quality control system）

蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)通過維持胞內(nèi)蛋白質(zhì)平衡提高細(xì)胞的生存能力［34］。該系統(tǒng)具有兩部分功能：變性蛋白重折疊與新合成蛋白的折疊組裝；變性失活蛋白的降解。以酵母細(xì)胞為例，其蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)主要包括自噬系統(tǒng)和26S泛素蛋白酶體系統(tǒng)。自噬系統(tǒng)是一種介于蛋白質(zhì)水平與細(xì)胞水平的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)，可以清除細(xì)胞中的問題蛋白，從而減少細(xì)胞因變性蛋白質(zhì)聚集而產(chǎn)生的毒害，在維持各種自由氨基、脂肪酸和有機(jī)物的循環(huán)利用、保持細(xì)胞內(nèi)平衡中起到重要作用。26S 泛素蛋白酶體系統(tǒng)由泛素、泛素啟動酶系統(tǒng)以及蛋白酶體組成，泛素、泛素啟動酶系統(tǒng)負(fù)責(zé)變性蛋白的泛素化，蛋白酶體被稱為“細(xì)胞內(nèi)的再生與回收中心”，泛素化的蛋白在此被分解為短肽和游離氨基酸，而泛素被回收再利用［35-36］。

2.5 微生物膜系統(tǒng)（microbial membrane system）

微生物膜系統(tǒng)作為一種生物屏障，在調(diào)節(jié)微生物的耐受性方面起著重要作用。膜損傷通常被認(rèn)為是多種脅迫因子的主要作用機(jī)制之一，在脅迫環(huán)境下，微生物膜起到保護(hù)屏障的作用，將細(xì)胞質(zhì)從細(xì)胞外脅迫環(huán)境中分離出來［37］。微生物細(xì)胞工廠在很大程度上依賴于膜內(nèi)穩(wěn)態(tài)和膜內(nèi)脂蛋白相互作用，涉及諸多關(guān)鍵的生理功能，包括能量代謝、溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞生長等［38］，因此，維持膜內(nèi)穩(wěn)態(tài)，包括調(diào)節(jié)脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成并維持其生物物理特性，是維持細(xì)胞工廠性能行之有效的方法［39］［圖2（d）］。

2.6 海藻糖調(diào)節(jié)系統(tǒng)（trehalose regulation system）

海藻糖是一種性質(zhì)穩(wěn)定的非還原性二糖［40］，廣泛存在于低等植物和微生物中。海藻糖是大多數(shù)昆蟲和真菌的主要儲能物質(zhì)，也是一種良好的生物保護(hù)劑，能夠保護(hù)細(xì)胞中的生物大分子免受干燥、高溫和高滲透壓等脅迫環(huán)境的破壞［41］。近年來，科研人員對海藻糖的作用機(jī)制及其代謝調(diào)控進(jìn)行了一定的研究。結(jié)果表明，海藻糖具有在脅迫條件下防止酵母體內(nèi)蛋白質(zhì)聚集和幫助蛋白質(zhì)正確折疊的功能，是一種在生物界廣泛存在的具有生物抗逆保護(hù)作用的重要物質(zhì)。盡管海藻糖在不同環(huán)境脅迫下對生物的保護(hù)機(jī)制尚不完全清楚，但可以肯定的是，這些重要的生理功能是與其獨(dú)特的理化性質(zhì)分不開的［42］。

除以上的抗逆機(jī)制外，細(xì)胞內(nèi)糖蛋白的表達(dá)也與細(xì)胞抵御外界脅迫密切相關(guān)［43］，最近研究表明，鈣穩(wěn)態(tài)有可能是脅迫環(huán)境下真核細(xì)胞存活的關(guān)鍵因素［44］。

3 非理性技術(shù)對抗逆性能的提高

研究人員在充分了解微生物抗逆機(jī)制的基礎(chǔ)上，采用非理性技術(shù)增強(qiáng)細(xì)胞自身防御系統(tǒng)，提高其抗逆性能［45］。

3.1 非理性改造結(jié)合反向代謝工程策略

結(jié)合微生物細(xì)胞的脅迫因子傳導(dǎo)，可以采取反向代謝工程策略進(jìn)行酵母細(xì)胞抗逆的研究。根據(jù)基因組、轉(zhuǎn)錄組、數(shù)量性狀基因定位（QTL）等數(shù)據(jù)比較，挖掘潛在的關(guān)鍵基因，進(jìn)一步通過基因敲除、過表達(dá)來驗(yàn)證基因功能。Nielsen 等［46］采用適應(yīng)性馴化的方法，得到40 ℃下生長的耐熱酵母菌株，并通過轉(zhuǎn)錄組研究了關(guān)鍵作用基因。Alper等［47］采用全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控方法通過突變或過表達(dá)全局轉(zhuǎn)錄因子，增加了釀酒酵母對高溫、乙醇及抑制物的耐受［圖3（a）］。

3.2 基于分子抗逆響應(yīng)實(shí)現(xiàn)微生物基因組的非理性改造

利用最新的基因編輯技術(shù)同樣可以實(shí)現(xiàn)微生物基因組的非理性改造，并借助高通量篩選得到抗逆性能優(yōu)秀的細(xì)胞工廠。Zhao Huimin 課題組［48］開發(fā)了一種在釀酒酵母中實(shí)現(xiàn)自動化多基因編輯的方法，以所需的功能基因線路構(gòu)建cDNA 文庫，用CRISPR-Cas 將多個(gè)片段整合到基因組，篩選到乙酸耐受和丁醇耐受的酵母菌株［圖3（b）］；元英進(jìn)課題組［49］在人工染色體酵母細(xì)胞中使用SCRaMbLE 技術(shù)進(jìn)行基因組重排，篩選到耐受42 ℃高溫和耐受咖啡因的酵母菌株，并找到了關(guān)鍵作用基因［圖3（c）］；Snoek 等［50］通過靶向性基因組重排得到了3000 個(gè)突變株，進(jìn)一步篩選得到8 株發(fā)酵效果優(yōu)于原始菌株的突變株；Elela 團(tuán)隊(duì)［51］構(gòu)建了釀酒酵母全部內(nèi)含子的單獨(dú)敲除細(xì)胞，通過對所有內(nèi)含子單敲細(xì)胞的表型、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及遺傳性狀進(jìn)行綜合分析，揭示出內(nèi)含子自身獨(dú)立于其編碼基因的通用功能——介導(dǎo)細(xì)胞對饑餓的應(yīng)答。

盡管研究人員基于非理性育種技術(shù)獲得了具有不同抗逆特征的微生物細(xì)胞工廠，但是也凸顯出該方法獲得的菌株智能響應(yīng)環(huán)境脅迫變化的能力較弱。究其原因，細(xì)胞內(nèi)部防御系統(tǒng)大多是脅迫環(huán)境下的應(yīng)答系統(tǒng)，無法使微生物獲得穩(wěn)定的抗逆性能，且常常以犧牲微生物的生產(chǎn)性能為代價(jià)，表現(xiàn)為生產(chǎn)菌株在多重脅迫下生產(chǎn)性能大幅降低。如何實(shí)現(xiàn)細(xì)胞工廠智能響應(yīng)發(fā)酵過程的環(huán)境變化進(jìn)而實(shí)現(xiàn)剛?cè)岵?jì)是亟待解決的問題。

圖3 非理性技術(shù)增強(qiáng)細(xì)胞自身防御系統(tǒng)提高其抗逆性能［48-49］Fig.3 Random and semirational technologies to engineer microbial cell self-defense systems for stress response［48-49］

4 抗逆基因線路設(shè)計(jì)與智能型細(xì)胞工廠的構(gòu)建

合成生物學(xué)融入了工程學(xué)思想和策略，將自然存在的基因元件標(biāo)準(zhǔn)化、去耦合、模塊化來設(shè)計(jì)新的生物系統(tǒng)或改造已有的生物系統(tǒng)［52-53］。隨著合成生物技術(shù)的發(fā)展，基于分子層面的人工合成體系的構(gòu)建得到廣泛關(guān)注［54］，這使得對魯棒性和智能型細(xì)胞工廠的需求更為迫切，重編程微生物時(shí)代正在到來。

極端環(huán)境微生物代表著生命的極限，蘊(yùn)藏著豐富的特殊功能基因資源，有著不可估量的生物技術(shù)開發(fā)前景［55-56］。通過研究極端環(huán)境微生物的抗逆分子機(jī)制，運(yùn)用合成生物學(xué)技術(shù)將其植入到細(xì)胞工廠的改造，可以極大提升生物制造產(chǎn)業(yè)的能力［57-58］。

當(dāng)前，抗逆基因線路設(shè)計(jì)思路主要是通過系統(tǒng)設(shè)計(jì)和改造，對極端環(huán)境微生物抗逆基因及調(diào)控序列進(jìn)行發(fā)掘、分類和定義；克隆或人工合成相關(guān)基因和調(diào)控元件；進(jìn)一步進(jìn)行抗逆基因線路模塊化組裝，研究底盤宿主與抗逆基因線路的適配性機(jī)理等［59］。

4.1 微生物智能熱量調(diào)節(jié)引擎的設(shè)計(jì)

嗜熱菌可以在高溫條件下生長，不但可以降低發(fā)酵過程反應(yīng)系統(tǒng)的冷卻能耗，而且不易被中溫微生物污染。李春等［60］通過挖掘及分析嗜熱微生物的耐熱元件，發(fā)明了微生物熱量智能調(diào)節(jié)引擎（IMHeRE）。IMHeRE的基因線路包括從嗜熱微生物中篩選得到的HSP作為耐熱功能元件，以及人工設(shè)計(jì)的RNA溫度響應(yīng)開關(guān)作為調(diào)控元件，利用對不同溫度響應(yīng)的RNA溫度響應(yīng)開關(guān)調(diào)控在不同溫度下效果最佳的HSP 實(shí)現(xiàn)了工程菌株的梯級耐熱。李春等［60］進(jìn)一步研究了IMHeRE與底盤宿主的適配性，并對模式工業(yè)宿主大腸桿菌和釀酒酵母進(jìn)行了模塊化組裝與適配性研究，實(shí)現(xiàn)了菌體耐熱與細(xì)胞數(shù)量調(diào)控的智能化，拓寬了其最適生長溫度的范圍，使大腸桿菌在37～43 ℃、釀酒酵母在30～40 ℃正常生長，大幅度提高了底盤宿主的耐熱性，IMHeRE應(yīng)用于賴氨酸40 ℃高溫發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)賴氨酸產(chǎn)量較對照提高了2～5倍［圖4（a）］。

圖4 抗逆基因線路設(shè)計(jì)及魯棒性、智能型細(xì)胞工廠的構(gòu)建［15，60-61，63］Fig.4 Designing of tolerant gene circuits to construct robust and intelligent cell factory［15，60-61，63］

4.2 蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)提高微生物細(xì)胞工廠的耐受性

生物發(fā)酵過程中，多種脅迫因子協(xié)同作用導(dǎo)致生產(chǎn)菌株的功能蛋白變性失活，造成其蛋白質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，嚴(yán)重影響細(xì)胞的生長代謝。維持胞內(nèi)蛋白質(zhì)平衡是提高細(xì)胞工廠多重耐受性的關(guān)鍵。Xu等［15］從嗜熱菌、耐熱菌及釀酒酵母蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)中挖掘并驗(yàn)證了大量基因，根據(jù)其功能相關(guān)性，組合成多功能基因線路，構(gòu)建了人工蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)（APQC），并將其應(yīng)用于釀酒酵母高溫乙醇發(fā)酵。高溫發(fā)酵培養(yǎng)及生理特性研究表明，APQC與單功能耐熱基因線路相比，能更好地提高酵母的耐熱性、細(xì)胞活力與細(xì)胞壁完整性，證明APQC可以在多重脅迫因子環(huán)境下有效調(diào)控酵母細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)代謝平衡［圖4（b）］。

4.3 基于抗氧化防御系統(tǒng)提高微生物細(xì)胞工廠的耐受性

好氧生物在進(jìn)行有氧代謝的過程中會產(chǎn)生ROS，進(jìn)而造成細(xì)胞膜脂質(zhì)氧化及核酸損傷等。發(fā)酵過程中，多種脅迫因子協(xié)同作用加速ROS 的積累，導(dǎo)致氧化脅迫。Xu等［32］基于對釀酒酵母抗氧化防御體系的分析，挖掘嗜熱棲熱菌和釀酒酵母內(nèi)的抗氧化蛋白，初步表征和探討抗氧化蛋白的性能，并將驗(yàn)證結(jié)果較好的基因組合成多功能基因線路，構(gòu)建人工抗氧化防御系統(tǒng)并將其整合到工業(yè)釀酒酵母基因組，經(jīng)發(fā)酵驗(yàn)證表明，工程菌株細(xì)胞生長量及乙醇產(chǎn)量均比對照有明顯提高，ROS 含量測定和線粒體完整性檢測結(jié)果顯示導(dǎo)入人工抗氧化防御系統(tǒng)可以減少ROS 對宿主細(xì)胞的脅迫。

4.4 細(xì)胞膜工程化設(shè)計(jì)

膜損傷通常被認(rèn)為是脅迫導(dǎo)致細(xì)胞毒性的主要機(jī)制。研究人員可以通過工程化設(shè)計(jì)改變磷脂分布強(qiáng)化微生物膜的功能。Tan 等［61］在大腸桿菌中提出了一種新的磷脂頭部工程策略，通過增加磷脂酰絲氨酸合成酶（+pssA）的表達(dá)顯著提高了大腸桿菌對辛酸和其他相關(guān)抑制劑如糠醛、乙酸、甲苯、乙醇和低pH 的耐受性。工程菌株中，除磷乙醇胺（PE）頭部基團(tuán)相對豐度增加，脂肪酸尾部組成也發(fā)生變化，導(dǎo)致菌株在膜完整性、表面電位、電化學(xué)電位和疏水性、細(xì)胞內(nèi)酸化敏感性等方面均有顯著變化。進(jìn)一步研究表明，磷乙醇胺含量的增加是導(dǎo)致雙層膜厚度增加的原因，而疏水核厚度的增加是脂肪酸頭部和尾部同時(shí)改變的結(jié)果［圖4（c）］。

4.5 基于核糖體開關(guān)的pH感應(yīng)基因線路

Pham 等［62］認(rèn)為，環(huán)境pH 是指導(dǎo)活細(xì)胞新陳代謝的基本信號，細(xì)胞對環(huán)境pH 的精確響應(yīng)對于其日益復(fù)雜的功能化至關(guān)重要，針對這一情況，他們設(shè)計(jì)了一套基于核糖體開關(guān)的pH 感應(yīng)基因線路，根據(jù)不同的環(huán)境pH 控制基因表達(dá)。基因線路中應(yīng)用的核糖體開關(guān)可以精確調(diào)控pH 依賴性基因表達(dá)，其OFF-ON 輸出差異最大為31 倍。為了進(jìn)一步闡明pH 感應(yīng)基因線路的應(yīng)用，研究人員將基因線路、易錯(cuò)PCR 和熒光細(xì)胞標(biāo)記綜合應(yīng)用，對大腸桿菌進(jìn)行自主進(jìn)化編程和耐酸表型富集，獲得了耐受性顯著提高的細(xì)胞工廠。

4.6 多重防御系統(tǒng)構(gòu)建抗逆工業(yè)酵母及其應(yīng)用

Li 等［63］為應(yīng)對多重脅迫因子的協(xié)同作用，提出了構(gòu)建微生物多重防御系統(tǒng)的研究思路。他們將具有不同抗逆性能的基因元件進(jìn)行重排組合，采用Golden Gate Assembly 進(jìn)行包含多個(gè)抗逆基因線路的多重抗逆防御系統(tǒng)的快速構(gòu)建，并將不同組合方式的多重抗逆防御系統(tǒng)高效轉(zhuǎn)化工業(yè)釀酒酵母，獲得攜帶不同抗逆機(jī)制的工業(yè)酵母菌株庫。采用燃料乙醇工廠工藝水模擬發(fā)酵物料配制培養(yǎng)基，利用高通量全自動篩選儀器平臺模擬工業(yè)高溫、高糖、乙醇毒害等多重壓力，得到了一株在工業(yè)液化醪中高產(chǎn)乙醇的菌株A223。液化醪中試發(fā)酵結(jié)果表明，A223 乙醇產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高6.9%，總糖殘留僅為出發(fā)菌株的51%。細(xì)胞凋亡水平、細(xì)胞膜完整性、線粒體完整性、活性氧及丙二醛含量均表明工程菌株的耐受性高于出發(fā)菌株。轉(zhuǎn)錄組分析表明，在多重脅迫下，工程菌的線粒體氧化磷酸化、三羧酸循環(huán)和過氧化物酶體的代謝水平明顯加強(qiáng)。顯著降低了發(fā)酵過程的控溫能耗，提高了糖醇轉(zhuǎn)化率，發(fā)酵能耗降低45.1%，提高產(chǎn)值近0.4億元［圖4（d）］。

4.7 動態(tài)調(diào)控酵母胞內(nèi)活性氧與乙酸含量

木質(zhì)纖維素是豐富的可再生資源，可通過發(fā)酵生產(chǎn)各種生物燃料和化學(xué)品。釀酒酵母是目前利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物乙醇的優(yōu)良菌株。與實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)相比，酵母在工業(yè)木質(zhì)纖維素發(fā)酵中受到多重脅迫壓力，例如高溫、高糖和乙酸等。部分壓力會造成胞內(nèi)活性氧上升，使細(xì)胞生產(chǎn)率受到壓力的阻礙。增強(qiáng)木糖發(fā)酵酵母的健壯性對于改善木質(zhì)纖維素乙醇的生產(chǎn)很重要，Qin等［64］采用脅迫驅(qū)動的啟動子構(gòu)建抗逆基因線路，增強(qiáng)了釀酒酵母中谷胱甘肽的生物合成途徑和乙酸降解途徑，進(jìn)而增強(qiáng)酵母對活性氧和乙酸升高引起的脅迫的耐受性。作者從轉(zhuǎn)錄組中挖掘的應(yīng)激驅(qū)動啟動子，實(shí)現(xiàn)抗逆遺傳線路的動態(tài)反饋調(diào)節(jié)，維持細(xì)胞內(nèi)低活性氧的同時(shí)減輕代謝負(fù)擔(dān)，最終提高酵母的健壯性和乙醇產(chǎn)量。在脅迫和非脅迫條件下，工程菌株的細(xì)胞生長、木糖利用率和乙醇產(chǎn)量均得到提高。該工程菌株在36°C 的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基和工業(yè)木質(zhì)纖維素培養(yǎng)基中的乙醇生產(chǎn)率分別比其親本菌株高49.5%和17.5%。使用工業(yè)木質(zhì)纖維素培養(yǎng)基（乙二胺預(yù)處理的玉米秸稈），通過同步糖化共發(fā)酵，工程菌株96 h可生產(chǎn)90.7 g/L乙醇［64］。

5 結(jié) 語

綜上所述，綠色生物制造是關(guān)系到未來國際競爭地位的戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)，其發(fā)展對合成生物學(xué)技術(shù)提出了新的要求：以工程化思維、借助合成生物學(xué)技術(shù)有效改善微生物細(xì)胞工廠的抗逆性能，提高其在脅迫條件下的生存能力。目前該領(lǐng)域研究尚處于初始階段，局限于應(yīng)對單一脅迫因子的基因線路的設(shè)計(jì)。對多重脅迫因子的信號傳導(dǎo)方式尚不清楚，不能有針對性地對脅迫信號傳導(dǎo)進(jìn)行阻斷調(diào)控是制約其發(fā)展的重要原因。因此，在了解微生物代謝調(diào)控的基礎(chǔ)上，從分子水平上研究其抗逆機(jī)制，闡明阻斷調(diào)控細(xì)胞工廠脅迫級聯(lián)傳導(dǎo)的分子機(jī)制，有針對性地設(shè)計(jì)并集成多重抗逆防御系統(tǒng)，提高細(xì)胞工廠在多重壓力環(huán)境中的抗逆能力，將極大提高生物制造過程的生產(chǎn)效率，降低發(fā)酵能耗和生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)人工生物反應(yīng)體系的高效性。未來，研究人員建立新方法、獲得新菌株的同時(shí)，積極推動成果應(yīng)用，將有效帶動全國生物制造行業(yè)技術(shù)提升，加快實(shí)現(xiàn)生物產(chǎn)業(yè)“十四五”規(guī)劃目標(biāo)。