動(dòng)態(tài)調(diào)控策略在代謝工程中的應(yīng)用研究進(jìn)展

于政，申曉林，孫新曉，王佳，袁其朋

（北京化工大學(xué)化工資源有效利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100029）

代謝工程是通過定向修改或重構(gòu)細(xì)胞代謝途徑，賦予細(xì)胞新的特性和生產(chǎn)能力，從而生產(chǎn)特定化合物的學(xué)科，作為一種新興技術(shù)常被用于生產(chǎn)能源、化學(xué)品、藥物和天然產(chǎn)物，如異丁醇、焦性沒食子酸、青蒿酸和熊果苷等［1-4］。代謝工程的目的是使細(xì)胞工廠利用最少量的碳源和能量，最大化地生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物［5］。因此，為了使細(xì)胞工廠的產(chǎn)量、產(chǎn)率和生產(chǎn)能力達(dá)到最大，需要對(duì)底盤細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模改造。目前常用的改造手段包括敲除副產(chǎn)物或敲除競(jìng)爭(zhēng)途徑及過表達(dá)目標(biāo)途徑相關(guān)基因，和以試錯(cuò)為主的模塊優(yōu)化等［6-8］。盡管這些方法有效提高了目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，但是帶來了細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯、細(xì)胞氧化還原失衡、中間代謝物積累和碳源浪費(fèi)等問題［6］。在自然界中，微生物通過監(jiān)測(cè)外界環(huán)境信號(hào)的變化，對(duì)自身基因表達(dá)進(jìn)行精密調(diào)控，從而完成從遲緩期到衰亡期的完整生命活動(dòng)。受這種天然動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制的啟發(fā)，早在2000年，F(xiàn)armer和Liao［9］利用乙酰磷酸響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子及其結(jié)合的啟動(dòng)子（轉(zhuǎn)錄因子-啟動(dòng)子）構(gòu)建了感知細(xì)胞代謝狀態(tài)并調(diào)節(jié)番茄紅素通路表達(dá)的動(dòng)態(tài)控制器，成功將番茄紅素的產(chǎn)率提高了50%。該研究證實(shí)了利用代謝物傳感器對(duì)代謝流進(jìn)行動(dòng)態(tài)控制可以提高異源途徑的產(chǎn)量和生產(chǎn)能力。近年來，隨著動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制研究的深入以及核糖開關(guān)、生物傳感器和蛋白降解標(biāo)簽等一系列調(diào)控元件的出現(xiàn)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)品合成代謝流進(jìn)行精確分配的代謝物響應(yīng)、群體感應(yīng)響應(yīng)、環(huán)境響應(yīng)和蛋白水平調(diào)控的動(dòng)態(tài)調(diào)控策略已經(jīng)成功應(yīng)用于生物合成途徑的優(yōu)化。動(dòng)態(tài)調(diào)控策略緩解了靜態(tài)調(diào)控所造成的生長(zhǎng)阻滯和代謝流失衡，為提高目標(biāo)產(chǎn)品產(chǎn)量提供了一種新的有效手段［7，10-11］。基于此，本文作者將總結(jié)近年來動(dòng)態(tài)調(diào)控在代謝工程領(lǐng)域的發(fā)展及應(yīng)用情況，討論動(dòng)態(tài)調(diào)控的優(yōu)點(diǎn)及存在的問題，展望該技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)和未來的發(fā)展方向。

1 依賴于特定中間代謝物或產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)調(diào)控

以途徑中間代謝物、副產(chǎn)物或產(chǎn)物濃度變化作為輸入信號(hào)而設(shè)計(jì)的調(diào)控系統(tǒng)常用于調(diào)節(jié)特定代謝通路的基因表達(dá)。這類調(diào)控系統(tǒng)通過感應(yīng)模塊接收輸入信號(hào)并傳遞至調(diào)控模塊，隨后調(diào)控模塊動(dòng)態(tài)控制基因表達(dá)水平，實(shí)現(xiàn)代謝流的動(dòng)態(tài)分配。當(dāng)前，響應(yīng)特定中間代謝物和產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)調(diào)控元件和線路的構(gòu)建主要依賴于兩種方式：一種是利用代謝物響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子-啟動(dòng)子作為響應(yīng)元件；另一種是利用代謝物響應(yīng)的核糖開關(guān)作為響應(yīng)元件。

1.1 代謝物響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子-啟動(dòng)子在動(dòng)態(tài)調(diào)控中的應(yīng)用

目前研究最多的是利用自然界中已發(fā)現(xiàn)的代謝物響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子-啟動(dòng)子來構(gòu)建調(diào)控系統(tǒng)。轉(zhuǎn)錄因子具有與啟動(dòng)子DNA 序列結(jié)合及與胞內(nèi)特定代謝物結(jié)合的兩個(gè)結(jié)合區(qū)域。轉(zhuǎn)錄因子通過與啟動(dòng)子區(qū)域特定的DNA 序列結(jié)合，來激活或抑制下游基因的表達(dá)，而胞內(nèi)代謝物與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合會(huì)影響其與啟動(dòng)子DNA 結(jié)合的活性，從而影響對(duì)下游基因的表達(dá)調(diào)控［12-13］。利用天然存在的轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建的調(diào)控系統(tǒng)對(duì)代謝物具有較高的特異性，通過中間代謝物或目標(biāo)產(chǎn)品與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后的別構(gòu)調(diào)節(jié)，在轉(zhuǎn)錄水平上實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)調(diào)控，進(jìn)而引發(fā)有利于目標(biāo)化合物合成的代謝流分配，但調(diào)控發(fā)生到信號(hào)輸出的變化需要經(jīng)歷較長(zhǎng)的時(shí)間且引入外源轉(zhuǎn)錄因子會(huì)增加細(xì)胞的代謝負(fù)擔(dān)［14］。

丙二酰輔酶A 是細(xì)胞生長(zhǎng)中脂肪酸合成的重要前體，同時(shí)是生產(chǎn)3-羥基丙酸、4-羥基香豆素和柚皮素等多種化合物的前體物質(zhì)［15-17］，因此常被用作信號(hào)分子調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物生產(chǎn)。例如，Xu 等［18］利用丙二酰輔酶A 響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子-啟動(dòng)子構(gòu)建了一個(gè)雙向動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)來提高脂肪酸產(chǎn)量。在這一調(diào)控系統(tǒng)中，低濃度丙二酰輔酶A 可激活乙酰輔酶A 羧化酶的表達(dá)同時(shí)降低脂肪酸合成酶的活性，在加強(qiáng)丙二酰輔酶A生產(chǎn)的同時(shí)降低了丙二酰輔酶A 的消耗，由此實(shí)現(xiàn)了丙二酰輔酶A 在生長(zhǎng)和生產(chǎn)中的平衡調(diào)控。與沒有調(diào)控的菌株相比，該策略成功使脂肪酸的產(chǎn)量提高了2.1 倍。類似地，Liu 等［19］設(shè)計(jì)了一個(gè)基于丙二酰輔酶A 的負(fù)反饋調(diào)控系統(tǒng)。當(dāng)丙二酰輔酶A 積累時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子FapR 與啟動(dòng)子PFR1的結(jié)合被抑制，因此激活啟動(dòng)子PFR1控制的基因lacI表達(dá)，大量表達(dá)的LacI 蛋白抑制了啟動(dòng)子T7，從而抑制該啟動(dòng)子開啟表達(dá)乙酰輔酶A 羧化酶；相反，當(dāng)丙二酰輔酶A 濃度下降時(shí)，則會(huì)激活乙酰輔酶A 羧化酶表達(dá)系統(tǒng)來適當(dāng)補(bǔ)充丙二酰輔酶A。通過這種調(diào)控機(jī)制，該系統(tǒng)可以根據(jù)細(xì)胞自身需求調(diào)節(jié)丙二酰輔酶A 的合成，減少細(xì)胞能量浪費(fèi)、平衡其碳流量分配，最終使脂肪酸產(chǎn)量提高了34%。此外，以產(chǎn)物作為調(diào)控因子也可有效提高細(xì)胞工廠的產(chǎn)量和產(chǎn)率，還可以耦合信號(hào)輸出系統(tǒng)構(gòu)建高通量篩選平臺(tái)，Hanko 等［20］利用產(chǎn)物衣康酸敏感的ItcR/PccI對(duì)順烏頭酸脫羧酶的表達(dá)進(jìn)行微調(diào)并構(gòu)建了產(chǎn)物的高通量篩選平臺(tái)，優(yōu)化了大腸桿菌中衣康酸的合成并篩選得到了衣康酸高產(chǎn)工程菌，衣康酸最高產(chǎn)量達(dá)到0.78 mmol/L。

由于天然轉(zhuǎn)錄因子-啟動(dòng)子的調(diào)控閾值和響應(yīng)底物譜有限，需要對(duì)轉(zhuǎn)錄因子、RBS 和結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行修飾來提高調(diào)控系統(tǒng)的選擇性、表達(dá)強(qiáng)度和響應(yīng)范圍，以滿足實(shí)際應(yīng)用的需求［21］。例如，Liang 等［22］通過定點(diǎn)飽和突變對(duì)天然尿酸響應(yīng)蛋白HucR 進(jìn)行改造，得到一個(gè)低響應(yīng)底物阿魏酸同時(shí)高響應(yīng)產(chǎn)物香草醛的HucR 突變體，并將其用于調(diào)控阿魏酸合成香草醛途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)。在發(fā)酵初期，HucR 突變體與高濃度的阿魏酸結(jié)合，合成途徑處于低水平表達(dá)，減小了抗菌化合物香草醛對(duì)生物量積累的影響；隨著底物的消耗和產(chǎn)物的合成，HucR 突變體主要與香草醛結(jié)合，激活合成途徑的高效快速表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)足夠生物量積累之后的香草醛高效合成。該研究還通過改造啟動(dòng)子-10 區(qū)，調(diào)整了啟動(dòng)子的啟動(dòng)強(qiáng)度，進(jìn)一步提高了香草醛的產(chǎn)量，在提供13.3 mmol/L 阿魏酸的條件下，產(chǎn)生了11 mmol/L 的香草醛。Dabirian等［23］以fapO/FapR 系統(tǒng)為例，證明了改變轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)在啟動(dòng)子核心區(qū)域中的插入位置，可以提高動(dòng)態(tài)調(diào)控范圍但同時(shí)伴隨著啟動(dòng)子基礎(chǔ)表達(dá)水平的損失。為了在不影響啟動(dòng)子基礎(chǔ)表達(dá)水平的條件下進(jìn)行調(diào)控，該課題組將轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)定位到上游啟動(dòng)子區(qū)域并將酵母天然阻遏蛋白與轉(zhuǎn)錄因子FapR 偶聯(lián)，在啟動(dòng)子基礎(chǔ)表達(dá)水平幾乎不變的條件下使得抑制強(qiáng)度提高了5 倍。此外，以不同啟動(dòng)子序列的結(jié)合能為基礎(chǔ)建立的熱力學(xué)模型［24］，以轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生率、結(jié)合親和力等參數(shù)為基礎(chǔ)建立的現(xiàn)象學(xué)理論［25］也被用于調(diào)節(jié)代謝物傳感器動(dòng)態(tài)范圍的研究中。

為進(jìn)一步擴(kuò)大已有代謝物響應(yīng)元件的應(yīng)用范圍、改善其調(diào)控效果，將天然轉(zhuǎn)錄因子-啟動(dòng)子與其他調(diào)控元件偶聯(lián)也受到了廣泛關(guān)注，這些偶聯(lián)有效地實(shí)現(xiàn)了合成途徑以及競(jìng)爭(zhēng)途徑的動(dòng)態(tài)調(diào)控。例如，以葡萄糖為底物合成關(guān)節(jié)炎治療藥物N-乙酰葡糖胺的過程會(huì)與糖酵解途徑（EMP）、戊糖磷酸途徑（HMP）和肽聚糖合成途徑（PSP）等細(xì)胞生長(zhǎng)必需途徑競(jìng)爭(zhēng)代謝流［圖1（a）］。為了解決敲除競(jìng)爭(zhēng)途徑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，提高N-乙酰葡糖胺的產(chǎn)量，研究人員將葡糖胺-6-磷酸響應(yīng)的GamR/PgamA與CRISPRi調(diào)控系統(tǒng)［26-27］偶聯(lián)，用于N-乙酰葡糖胺合成的動(dòng)態(tài)調(diào)控［圖1（b）］。當(dāng)胞內(nèi)葡糖胺-6-磷酸處于低濃度狀態(tài)時(shí)，GamR會(huì)與DNA結(jié)合覆蓋RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制編碼葡糖胺-6-磷酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶的GNA1基因和dCas9基因的轉(zhuǎn)錄，使代謝流進(jìn)入HMP、EMP和PSP途徑用于積累生物量。當(dāng)胞內(nèi)葡糖胺-6-磷酸處于高濃度狀態(tài)時(shí)，GamR的DNA 結(jié)合活性被葡糖胺-6-磷酸的變構(gòu)調(diào)節(jié)作用消除，使RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合從而激活GNA1和dCas9的轉(zhuǎn)錄，隨后表達(dá)產(chǎn)生的葡糖胺-6-磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶催化N-乙酰葡糖胺合成，而dCas9與組成性表達(dá)產(chǎn)生的sgRNAs 結(jié)合后下調(diào)了競(jìng)爭(zhēng)途徑的表達(dá)水平。通過該基因線路對(duì)N-乙酰葡糖胺合成途徑和競(jìng)爭(zhēng)途徑的動(dòng)態(tài)調(diào)控，最終N-乙酰葡糖胺在15L發(fā)酵反應(yīng)器中的產(chǎn)量達(dá)到131.6 g/L［28］。另外，Yang等設(shè)計(jì)了黏糠酸傳感器與反義RNA耦合的雙功能動(dòng)態(tài)調(diào)控元件，以黏糠酸為信號(hào)，可在增強(qiáng)下游黏糠酸生產(chǎn)途徑表達(dá)的同時(shí)開啟抑制EMP 途徑的反義RNA系統(tǒng)，從而降低細(xì)胞生長(zhǎng)的碳源消耗，將碳流引入生產(chǎn)途徑。與靜態(tài)誘導(dǎo)相比，雙功能動(dòng)態(tài)調(diào)控元件的應(yīng)用使黏糠酸產(chǎn)量增加了16.3倍［29］。

圖1 枯草芽孢桿菌中N-乙酰葡糖胺的合成調(diào)控Fig.1 Regulation of N-acetylglucosamine synthesis in Bacillus subtilis

1.2 代謝物響應(yīng)核糖開關(guān)在動(dòng)態(tài)調(diào)控中的應(yīng)用

代謝物響應(yīng)的核糖開關(guān)因其反應(yīng)時(shí)間快、對(duì)細(xì)胞造成負(fù)擔(dān)小及可以靈活地與下游基因組合等特點(diǎn)逐漸成為另一種有發(fā)展?jié)摿Φ奶囟ùx途徑調(diào)控方法［30］，同樣不可忽視的是有限的化學(xué)多樣性限制了其感知代謝物的能力以及存在延遲輸出的問題［31］。核糖開關(guān)是一種主要存在于細(xì)菌信使RNA 5'端非翻譯區(qū)的順式作用元件，由適配體與表達(dá)結(jié)構(gòu)域組成［32］。適配體與代謝物配體結(jié)合，引起表達(dá)結(jié)構(gòu)域構(gòu)象改變，進(jìn)而通過轉(zhuǎn)錄終止、翻譯起始和內(nèi)含子剪接等機(jī)制對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控［33-34］。

目前，核糖開關(guān)已經(jīng)成功應(yīng)用于動(dòng)態(tài)調(diào)控與細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的競(jìng)爭(zhēng)途徑，使細(xì)胞在滿足生長(zhǎng)的條件下增加產(chǎn)品合成所需的代謝通量。通過終止子結(jié)構(gòu)和抗終止結(jié)構(gòu)的形成，核糖開關(guān)以控制轉(zhuǎn)錄起始的方式調(diào)控基因表達(dá)。例如，Wachsmuth等［35］設(shè)計(jì)了一個(gè)茶堿響應(yīng)的核糖開關(guān)，在茶堿存在的條件下抑制終止子結(jié)構(gòu)的形成，使基因表達(dá)水平提高了3倍。通過調(diào)控內(nèi)含子正常和錯(cuò)誤剪接，核糖開關(guān)以控制mRNA加工的方式調(diào)控基因表達(dá)。例如，研究人員研究了通過錯(cuò)誤剪接內(nèi)含子來下調(diào)基因表達(dá)水平的硫胺素焦磷酸響應(yīng)核糖開關(guān)，并將其改造成與硫胺素焦磷酸結(jié)合后可以正常剪接的激活型核糖開關(guān)，使得配體結(jié)合后的基因表達(dá)水平提高了4.7 倍［36］。通過RBS序列的暴露和掩蓋，核糖開關(guān)以控制翻譯起始的方式調(diào)控基因表達(dá)。例如，研究人員利用來自大腸桿菌的天然賴氨酸核糖開關(guān)在谷氨酸棒狀桿菌中構(gòu)建了賴氨酸合成途徑的調(diào)控系統(tǒng)，通過賴氨酸響應(yīng)的方式調(diào)控競(jìng)爭(zhēng)途徑TCA循環(huán)中檸檬酸合成酶的表達(dá)水平，使賴氨酸產(chǎn)量提高了63%［37］。通過改造巴氏梭菌中的甘氨酸激活核糖開關(guān)，Zhou等開發(fā)了一種甘氨酸抑制核糖開關(guān)，并將其應(yīng)用于5-氨基酮戊酸合成途徑的動(dòng)態(tài)調(diào)控。5-氨基酮戊酸不僅是目標(biāo)產(chǎn)物，也是細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的血紅素合成途徑的前體，因此對(duì)血紅素合成途徑表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控可有效提高5-氨基酮戊酸產(chǎn)量［圖2（a）］。不同于敲除5-氨基酮戊酸脫氫酶基因（hemB）的靜態(tài)調(diào)控策略，研究人員利用甘氨酸響應(yīng)的抑制性核糖開關(guān)對(duì)hemB表達(dá)進(jìn)行了動(dòng)態(tài)調(diào)控。當(dāng)甘氨酸積累到一定濃度時(shí)，抑制性核糖開關(guān)通過適配體與甘氨酸結(jié)合，引發(fā)表達(dá)結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象改變，阻止核糖體與mRNA結(jié)合，從而抑制hemB的翻譯起始，實(shí)現(xiàn)了5-氨基酮戊酸合成的動(dòng)態(tài)調(diào)控［圖2（b）］。在搖瓶發(fā)酵中，甘氨酸抑制核糖開關(guān)的應(yīng)用使大腸桿菌中5-氨基酮戊酸的產(chǎn)量達(dá)到242 mg/L，相較于對(duì)照組提高了11%［38］。為了進(jìn)一步提高核糖開關(guān)的閾值或擴(kuò)大其調(diào)控范圍，Pang 等［39］對(duì)唾液酸核糖開關(guān)的結(jié)合環(huán)進(jìn)行堿基突變，并以一種生長(zhǎng)偶聯(lián)的雙向篩選方法進(jìn)行篩選，得到了具有高閾值、更廣調(diào)控范圍的核糖開關(guān)，將唾液酸產(chǎn)量提高了42%。同時(shí)，利用SELEX與高通量篩選相結(jié)合進(jìn)行人工構(gòu)建核糖開關(guān)也獲得了廣泛的關(guān)注［31］。

綜上所述，現(xiàn)有的代謝物響應(yīng)調(diào)控元件已經(jīng)成功應(yīng)用于提高微生物細(xì)胞工廠的產(chǎn)量、產(chǎn)率和生產(chǎn)能力。為了進(jìn)一步提高對(duì)調(diào)控元件的調(diào)控效果，一方面誘變和計(jì)算機(jī)輔助蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)等方法被用于改造現(xiàn)有元件，提高響應(yīng)開關(guān)的特異性、拓寬其響應(yīng)底物譜、擴(kuò)大其調(diào)控范圍；另一方面轉(zhuǎn)錄微陣列、高通量篩選代謝物響應(yīng)啟動(dòng)子［40-41］等方向的研究也有助于更多調(diào)控元件的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。

圖2 大腸桿菌中5-氨基酮戊酸的合成調(diào)控Fig.2 Regulation of 5-aminoketovaleric acid synthesis in Escherichia coli

2 依賴于群體感應(yīng)系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)調(diào)控

以途徑中間代謝物或產(chǎn)物作為輸入信號(hào)實(shí)現(xiàn)特定通路動(dòng)態(tài)調(diào)控的策略，在一定程度上可以有效提高特定目標(biāo)化合物的產(chǎn)量。但是代謝通路特異性的特點(diǎn)限制了其在不同代謝途徑中的應(yīng)用。因此，獲得一種普遍適用的動(dòng)態(tài)調(diào)控工具成為了研究熱點(diǎn)。群體感應(yīng)是一種依賴于細(xì)胞密度的天然動(dòng)態(tài)調(diào)控體系，細(xì)菌可通過信號(hào)分子的產(chǎn)生、釋放、監(jiān)測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)周圍環(huán)境的感知，進(jìn)而根據(jù)細(xì)胞密度的變化在整個(gè)種群范圍內(nèi)同步特定的行為［42-43］。隨著對(duì)群體感應(yīng)作用機(jī)制的研究深入，這一生物學(xué)特性可用于開發(fā)一種細(xì)胞密度依賴的自誘導(dǎo)動(dòng)態(tài)調(diào)控工具，另外不可忽視的是額外信號(hào)物質(zhì)的合成增加了細(xì)胞代謝負(fù)擔(dān)。目前研究最多、應(yīng)用最廣的群體感應(yīng)系統(tǒng)主要是來自于費(fèi)氏弧菌的luxI/luxR系統(tǒng)和來自于玉米細(xì)菌性枯萎病菌中的esaI/esaR系統(tǒng)，這兩種系統(tǒng)由于響應(yīng)機(jī)制不同而被用于構(gòu)建不同的基因線路，調(diào)節(jié)和分配細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物生產(chǎn)之間的碳流及能量流。

2.1 luxI/luxR 群體感應(yīng)系統(tǒng)在動(dòng)態(tài)調(diào)控中的應(yīng)用

最早發(fā)現(xiàn)于費(fèi)氏弧菌中的luxI/luxR群體感應(yīng)系統(tǒng)，因其調(diào)控機(jī)制簡(jiǎn)單明確而被廣泛研究與應(yīng)用。在luxI/luxR群體感應(yīng)系統(tǒng)中，信號(hào)分子AHLs（Acyl homoserine lactones）合成酶LuxI 由luxI基因編碼，合成的AHLs 以自由擴(kuò)散的方式進(jìn)入到周圍環(huán)境中，當(dāng)信號(hào)分子濃度達(dá)到閾值之后，AHLs 會(huì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與luxR組成性表達(dá)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄因子LuxR 結(jié)合形成AHLs-LuxR 復(fù)合物，該復(fù)合物可與轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)結(jié)合激活下游基因的表達(dá)［44］，實(shí)現(xiàn)基因線路的開啟或增強(qiáng)?；谶@種群體感應(yīng)系統(tǒng)，Kim 等［45］設(shè)計(jì)了一條基因線路來平衡細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物生產(chǎn)之間的碳流分配，帶有該基因線路的工程菌生產(chǎn)了1.1 g/L 紅沒藥烯，與前人研究相比，產(chǎn)量提高了44%。以此為基礎(chǔ)，Bao 等［46］將轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控元件sRNA（small RNA）與luxI/luxR型群體感應(yīng)系統(tǒng)偶聯(lián)，開發(fā)了一種高細(xì)胞密度時(shí)動(dòng)態(tài)抑制目標(biāo)基因表達(dá)的工具（圖3）。當(dāng)AHLs 達(dá)到閾值之后，AHLs-LuxR 復(fù)合物激活啟動(dòng)子Plux控制的sRNA 和分子伴侶Hfq 的表達(dá)，產(chǎn)生的sRNA-Hfq與目標(biāo)mRNA 結(jié)合后可抑制目標(biāo)基因的翻譯，且抑制程度可在6%～76%調(diào)節(jié)。值得注意的是，在構(gòu)建該調(diào)控系統(tǒng)的過程中，研究人員利用群體感應(yīng)啟動(dòng)子Plux啟動(dòng)luxI表達(dá)，解決了目標(biāo)基因過早被抑制的問題，同時(shí)通過luxI表達(dá)的正反饋調(diào)控提高了抑制強(qiáng)度，得到了一種可在高細(xì)胞密度時(shí)動(dòng)態(tài)自主抑制基因表達(dá)的工具［46］。雖然luxI/luxR群體感應(yīng)系統(tǒng)研究廣泛且已被成熟應(yīng)用于構(gòu)建很多基因調(diào)控線路，但是該類系統(tǒng)只能正向響應(yīng)AHLs 濃度；雖然通過與負(fù)調(diào)控元件耦合可以對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行雙向調(diào)節(jié)，但是會(huì)造成基因線路復(fù)雜、調(diào)控靈敏度降低等問題。因此，具有雙向調(diào)節(jié)功能的esaI/esaR群體感應(yīng)器成為新的研究熱點(diǎn)。

圖3 luxI/luxR群體感應(yīng)系統(tǒng)與sRNA偶聯(lián)動(dòng)態(tài)調(diào)控基因線路Fig.3 luxI/luxR quorum sensing system coupled with sRNA for dynamic regulation of gene circuits

2.2 esaI/esaR 群體感應(yīng)系統(tǒng)在動(dòng)態(tài)調(diào)控中的應(yīng)用

存在于玉米細(xì)菌性枯萎病菌中的esaI/esaR是一種luxI/luxR同源的群體感應(yīng)系統(tǒng)［47］。與luxI/luxR不同的是，其信號(hào)分子受體EsaR 可以產(chǎn)生激活與抑制的雙重作用。在低細(xì)胞密度時(shí)，EsaR 可與啟動(dòng)子PesaR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)結(jié)合來抑制其下游基因表達(dá)，也可與啟動(dòng)子PesaS的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)結(jié)合來激活其下游基因表達(dá)；而在高細(xì)胞密度和AHLs 濃度達(dá)到閾值之后，AHLs 與轉(zhuǎn)錄因子EsaR 作用使其無法再結(jié)合到轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，由此啟動(dòng)PesaR下游基因的表達(dá)和抑制PesaS下游基因的表達(dá)［48］。利用esaI/esaR型群體感應(yīng)的這一特性，在對(duì)4-羥基苯乙酸合成途徑中ARO10基因編碼的苯丙酮酸脫羧酶及feaB基因編碼的苯乙醛脫氫酶改造的基礎(chǔ)上，Shen 等［49］引入EsaR/PesaR調(diào)控組件來動(dòng)態(tài)調(diào)控這兩個(gè)基因的表達(dá)，從而在提高4-羥基苯乙酸產(chǎn)量的同時(shí)避免了大規(guī)模發(fā)酵過程中高成本的誘導(dǎo)劑添加。最終，4-羥基苯乙酸的產(chǎn)量被進(jìn)一步提高至17.39 g/L，與靜態(tài)調(diào)控的菌株相比提高了46.4%。Gu 等［50］以EsaR/PesaR-C和EsaR/PesaS調(diào)控組件為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)了一個(gè)可以在高細(xì)胞密度條件下同時(shí)上調(diào)和下調(diào)基因表達(dá)水平的雙向開關(guān)。這一雙向開關(guān)被成功應(yīng)用于大腸桿菌中聚-β-羥丁酸合成的動(dòng)態(tài)調(diào)控（圖4）。在大腸桿菌中，聚-β-羥丁酸的合成是以乙酰輔酶A 為前體，而乙酰輔酶A 同時(shí)是細(xì)胞生長(zhǎng)必需的重要中間代謝物，因而造成了細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成間的沖突。該基因線路通過啟動(dòng)子PesaR-C控制乙酰輔酶A 合成聚-β-羥丁酸的phbCAB基因、以啟動(dòng)子PesaS控制乙酰輔酶A 進(jìn)入TCA 循環(huán)的gltA基因，利用esaI/esaR系統(tǒng)的雙向調(diào)節(jié)功能實(shí)現(xiàn)了低細(xì)胞密度時(shí)乙酰輔酶A 進(jìn)入TCA 循環(huán)、高細(xì)胞密度時(shí)乙酰輔酶A 進(jìn)入聚-β-羥丁酸合成途徑的動(dòng)態(tài)自主切換，最終生產(chǎn)了6.73 g/L 的聚-β-羥丁酸，產(chǎn)量相較于無雙功能開關(guān)的對(duì)照組提高了6 倍［50］。同樣是基于esaI/esaR群體感應(yīng)系統(tǒng)，Prather 課題組［51］設(shè)計(jì)了精細(xì)調(diào)控的基因線路來微調(diào)EsaI 的表達(dá)水平從而控制1-磷酸果糖激酶和莽草酸激酶的表達(dá)，成功實(shí)現(xiàn)了中心代謝途徑與目標(biāo)產(chǎn)物合成途徑的碳流平衡，該策略的應(yīng)用顯著提高了肌醇、葡萄糖二酸和莽草酸的產(chǎn)量。在此基礎(chǔ)上，該課題組通過構(gòu)建新的分層動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)元件進(jìn)一步優(yōu)化了該調(diào)節(jié)系統(tǒng)，提高了調(diào)節(jié)效果。一方面，使用群體感應(yīng)系統(tǒng)降低糖酵解途徑中的基因表達(dá)水平；另一方面，結(jié)合肌醇敏感的代謝物類型傳感器上調(diào)葡萄糖二酸的生物合成途徑，通過這種“推拉”結(jié)合的策略，使葡萄糖二酸的產(chǎn)量提高到2 g/L［52］。Dinh 等［53］設(shè)計(jì)了另外一種復(fù)合調(diào)控元件也實(shí)現(xiàn)了同時(shí)上調(diào)和下調(diào)基因表達(dá)的雙向調(diào)控，他們將lux型和esa型群體感應(yīng)器與CRISPRi 結(jié)合開發(fā)出了一種在細(xì)胞生長(zhǎng)后期自誘導(dǎo)的雙功能動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)，并在水楊酸和柚皮素的生物合成途徑中驗(yàn)證了調(diào)控效果，與靜態(tài)菌株相比，水楊酸和柚皮素的產(chǎn)率分別提高了1.8 倍和6 倍。這些研究為我們提供了新的應(yīng)用方向，不僅可以構(gòu)建雙功能調(diào)控元件，還可以將不同類型的動(dòng)態(tài)調(diào)控方式組合，構(gòu)建更有效的基因線路，實(shí)現(xiàn)對(duì)菌體代謝網(wǎng)絡(luò)基因表達(dá)水平的精確調(diào)控。

為了進(jìn)一步擴(kuò)大群體感應(yīng)策略的應(yīng)用范圍，一方面，表征新的天然群體感應(yīng)系統(tǒng)有利于開發(fā)更多的群體感應(yīng)調(diào)控工具；另一方面，通過啟動(dòng)子改造對(duì)信號(hào)分子產(chǎn)生率及信號(hào)分子-轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物與轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的結(jié)合效率進(jìn)行修飾，可以調(diào)節(jié)開關(guān)切換時(shí)間和作用強(qiáng)度［54］。例如，Daer等［55］在大腸桿菌中表征了天然信號(hào)分子合成酶庫(kù)的信號(hào)分子產(chǎn)生能力，這為群體感應(yīng)調(diào)控回路的構(gòu)建提供了更多可選擇的元件。通過采用不同強(qiáng)度啟動(dòng)子以及RBS序列來調(diào)節(jié)AHLs合成率，研究人員得到了可在不同菌體濃度下響應(yīng)的群體感應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)［53］。另外，正交群體感應(yīng)系統(tǒng)的表征為實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因間互不干擾的調(diào)控提供了理論基礎(chǔ)。Tekel等［56］通過表征5個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄因子（LuxR，LasR，TraR，BjaR，AubR）對(duì)一組AHLs合成酶的反應(yīng)，篩選出了兩組正交且互不干擾的AHLs 合成酶與轉(zhuǎn)錄因子組合（BjaI/BjaR+EsaI/TraR和LasI/LasR+EsaI/TraR）。Scott等［57］發(fā)現(xiàn)了既沒有信號(hào)串?dāng)_，也沒有啟動(dòng)子串?dāng)_的Tra和Rpa群體感應(yīng)系統(tǒng)。這些研究為利用群體感應(yīng)開發(fā)正交的、精確的動(dòng)態(tài)調(diào)控工具奠定了理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。

圖4 esaI/esaR群體感應(yīng)系統(tǒng)用于聚-β-羥丁酸合成的動(dòng)態(tài)調(diào)控Fig.4 esaI/esaR quorum sensing system for dynamic regulation of poly-β-hydroxybutyrate synthesis

3 基于發(fā)酵過程條件控制的動(dòng)態(tài)調(diào)控策略

雖然對(duì)群體感應(yīng)和代謝物調(diào)控系統(tǒng)核心元件的改造可在一定程度內(nèi)調(diào)控元件的響應(yīng)閾值和響應(yīng)范圍，但是在目前的研究中，這兩種動(dòng)態(tài)調(diào)控都受到啟動(dòng)子響應(yīng)閾值和響應(yīng)物譜的限制。而溫度、溶氧、pH、光照、培養(yǎng)基成分等發(fā)酵條件作為輸入信號(hào)，具有可逆性、普適性、振蕩性和可控性等優(yōu)點(diǎn)，還可以通過人工干預(yù)進(jìn)行合理的調(diào)節(jié)，因此，響應(yīng)發(fā)酵環(huán)境信號(hào)的動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)可在更廣闊的范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的適時(shí)調(diào)控。

3.1 溫度、溶氧及pH 響應(yīng)開關(guān)在動(dòng)態(tài)調(diào)控中的應(yīng)用

作為發(fā)酵過程中的重要影響因素，溫度調(diào)控具有操作簡(jiǎn)單、調(diào)控均一等優(yōu)點(diǎn)，在代謝工程中已經(jīng)取得了廣泛的應(yīng)用。溫度敏感型蛋白的發(fā)現(xiàn)與改造，為以溫度作為輸入信號(hào)的代謝途徑調(diào)控提供了基礎(chǔ)元件。溫度改變可以調(diào)節(jié)參與基因表達(dá)過程的溫敏性蛋白與啟動(dòng)子的結(jié)合能力，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)代謝過程的動(dòng)態(tài)調(diào)控。通過改變溫度條件，Harder等［58］將溫度敏感的CI857阻遏蛋白用于動(dòng)態(tài)調(diào)控大腸桿菌中衣康酸的生物合成。在37 ℃時(shí)，CI857不與調(diào)控序列結(jié)合，此時(shí)PR啟動(dòng)的異檸檬酸脫氫酶基因正常表達(dá)，代謝流被用于TCA循環(huán)實(shí)現(xiàn)生物量積累；而在28 ℃時(shí)，CI857 與調(diào)控序列結(jié)合，抑制PR啟動(dòng)的異檸檬酸脫氫酶基因的表達(dá)從而抑制TCA 循環(huán)，將代謝流引入衣康酸合成途徑（圖5）。這種以溫度作為輸入信號(hào)的調(diào)控系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了37 ℃時(shí)生物量積累到28 ℃時(shí)衣康酸合成的動(dòng)態(tài)切換，與直接敲除競(jìng)爭(zhēng)途徑TCA循環(huán)相比，在1 L反應(yīng)器中將衣康酸產(chǎn)量從32 g/L提高至47 g/L［58］。此外，研究人員利用定向進(jìn)化改造的溫度敏感型蛋白Gal4M9調(diào)控釀酒酵母中番茄紅素的合成。通過發(fā)酵溫度切換，引發(fā)Gal4M9蛋白介導(dǎo)的基因表達(dá)水平改變，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞生長(zhǎng)和番茄紅素生產(chǎn)的解耦聯(lián)。這種調(diào)控策略在生長(zhǎng)階段為番茄紅素生產(chǎn)提供了足夠的生物量積累，最終在5 L發(fā)酵反應(yīng)器中將番茄紅素的產(chǎn)量提高至1.12 g/L［59］。與溫度調(diào)控類似，溶解氧響應(yīng)的啟動(dòng)子Pnar，也可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成的分段進(jìn)行。通過將發(fā)酵過程分為高氧誘導(dǎo)生長(zhǎng)階段和低氧誘導(dǎo)生產(chǎn)階段，啟動(dòng)子Pnar已經(jīng)成功應(yīng)用于大腸桿菌中D-乳酸、2，3-丁二醇和1，3-丙二醇合成的動(dòng)態(tài)調(diào)控，產(chǎn)量分別為113.12 g/L、48.0 g/L、15.8 g/L［60］。類似地，培養(yǎng)基pH值也可作為輸入信號(hào)應(yīng)用于代謝途徑動(dòng)態(tài)調(diào)控。研究人員將低pH條件下高效啟動(dòng)下游基因表達(dá)的啟動(dòng)子Pgas用于黑曲霉中衣康酸合成途徑的動(dòng)態(tài)調(diào)控，通過低pH條件下激活cad編碼的順烏頭酸脫羧酶表達(dá)，將衣康酸產(chǎn)量提高至4.92 g/L［61］。另外，響應(yīng)胞外pH擾動(dòng)的跨膜單組分調(diào)節(jié)器CadCΔ被應(yīng)用于解決D-木糖氧化途徑中D-木糖酸瞬時(shí)積累所造成的培養(yǎng)基酸化問題。D-木糖酸的積累造成了胞外pH降低，隨后激活了CadCΔ介導(dǎo)的D-木糖到D-木糖酸合成途徑的動(dòng)態(tài)抑制，此時(shí)積累的D-木糖酸進(jìn)入下游途徑進(jìn)行消耗，由此最大程度地減少了過多D-木糖酸積累對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。與不含調(diào)節(jié)器的對(duì)照組相比，乙二醇產(chǎn)量提高了170%［62］。

圖5 Cl857/PR溫度調(diào)控回路的作用機(jī)制Fig.5 Mechanism of Cl857/PR temperature control circuit

3.2 光響應(yīng)開關(guān)在動(dòng)態(tài)調(diào)控中的應(yīng)用

相較于溫度、溶氧和pH控制的動(dòng)態(tài)響應(yīng)開關(guān)，光誘導(dǎo)開關(guān)具有高分辨率、傳送快速、可逆性好、強(qiáng)度可控、對(duì)系統(tǒng)干擾少等優(yōu)點(diǎn)［63］。通過改變光強(qiáng)以及曝光時(shí)間，可以調(diào)控光控開關(guān)的輸出水平，由此實(shí)現(xiàn)代謝途徑中酶表達(dá)水平和表達(dá)時(shí)間的精確調(diào)控［64］。以藍(lán)細(xì)菌中光誘導(dǎo)的UirS/UirR系統(tǒng)為例，該雙組分系統(tǒng)由膜結(jié)合傳感器UirS、胞質(zhì)反應(yīng)調(diào)節(jié)器UirR和輸出啟動(dòng)子組成。在綠光條件下，UirS處于穩(wěn)定的基態(tài)，不啟動(dòng)UirR對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控；而在紫外光條件下，UirS發(fā)生自磷酸化激活，隨后磷酸化集團(tuán)轉(zhuǎn)移至UirR完成反應(yīng)調(diào)節(jié)器的激活，從而啟動(dòng)UirR對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控（圖6），因此，通過紫外光與綠光的切換，UirS/UirR雙組分系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)水平的可逆動(dòng)態(tài)調(diào)控［65］。原理更簡(jiǎn)單的光誘導(dǎo)單組分系統(tǒng)也被應(yīng)用于代謝途徑的動(dòng)態(tài)調(diào)控。例如，由粗糙脈孢菌光感受器VVD改造而來的Magnets是一種藍(lán)光誘導(dǎo)的單組分系統(tǒng)。在Magnets中，nMag和pMag兩個(gè)單體被設(shè)計(jì)成基于靜電相互作用識(shí)別彼此以消除同質(zhì)二聚并增強(qiáng)光誘導(dǎo)的異質(zhì)二聚。通過光誘導(dǎo)的兩個(gè)單體分離或二聚化來形成蛋白質(zhì)分裂或激活狀態(tài)的切換，Magnets以直接控制蛋白質(zhì)活性的方式實(shí)現(xiàn)代謝過程的動(dòng)態(tài)調(diào)控。研究人員將nMag 和pMag分別與T7 RNA聚合酶分裂的兩部分相連，實(shí)現(xiàn)了藍(lán)光誘導(dǎo)下單體光聚化引發(fā)的T7 RNA聚合酶激活和黑暗狀態(tài)下單體分離引發(fā)的T7 RNA 聚合酶分裂，進(jìn)而動(dòng)態(tài)調(diào)控了下游基因的表達(dá)水平［66］。基于這一原理，Zhao 等［67］在酵母中構(gòu)建了一個(gè)名為OptoEXP的光控制開關(guān)。在該調(diào)控體系中，啟動(dòng)子Pc120由融合蛋白（VP16-EL222）調(diào)控，黑暗狀態(tài)下VP16-EL222失活，啟動(dòng)子Pc120無法開啟轉(zhuǎn)錄；藍(lán)光照射下VP16-EL222激活并與啟動(dòng)子Pc120結(jié)合，啟動(dòng)下游基因的表達(dá)。由此實(shí)現(xiàn)了藍(lán)光誘導(dǎo)的生長(zhǎng)模式和黑暗誘導(dǎo)的生產(chǎn)模式之間的細(xì)胞代謝狀態(tài)切換，該工程菌株在搖瓶中生產(chǎn)了3.37 g/L的異丁醇，與沒有光動(dòng)態(tài)控制的菌株相比，產(chǎn)量提高了4倍。光誘導(dǎo)開關(guān)的切換具有瞬時(shí)性，而且光的產(chǎn)生以及光的強(qiáng)度具有可編程性，這些特點(diǎn)為光誘導(dǎo)調(diào)控開關(guān)與計(jì)算機(jī)智能化控制和反饋的結(jié)合提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)［68］，但是想要應(yīng)用于大規(guī)模發(fā)酵反應(yīng)，還需要解決受光不均勻所造成的細(xì)胞低效率誘導(dǎo)問題，另外還需要設(shè)計(jì)透光性好、攪拌均勻的生物反應(yīng)器來解決高密度培養(yǎng)過程中的光透性問題。

圖6 光誘導(dǎo)的雙組分系統(tǒng)Fig.6 A two-component system induced by light

3.3 培養(yǎng)基成分響應(yīng)開關(guān)在動(dòng)態(tài)調(diào)控中的應(yīng)用

除了利用人為控制的發(fā)酵條件調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分也可作為動(dòng)態(tài)調(diào)控的開關(guān)對(duì)細(xì)胞工廠進(jìn)行調(diào)控。應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)成分響應(yīng)的調(diào)控元件，通過調(diào)控發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)成分的濃度變化來調(diào)控基因表達(dá)水平，這種調(diào)控使得細(xì)胞可依據(jù)環(huán)境的營(yíng)養(yǎng)狀況自主調(diào)節(jié)生產(chǎn)與生長(zhǎng)模式的切換。例如，Bothfeld等［69］構(gòu)建了基于葡萄糖濃度的響應(yīng)開關(guān)，可在葡萄糖濃度降低時(shí)激活聚羥基丁酸酯合成途徑中的基因表達(dá)。該系統(tǒng)在重新引入葡萄糖的情況下依然可以穩(wěn)定表達(dá)，與靜態(tài)誘導(dǎo)相比，其生長(zhǎng)狀況良好且產(chǎn)量相當(dāng)。在此基礎(chǔ)上，David等［70］將響應(yīng)葡萄糖濃度的PHXT1啟動(dòng)子與響應(yīng)3-羥基丙酸合成途徑前體丙二酰輔酶A 的FapR/PTEF1巧妙結(jié)合，構(gòu)建了一個(gè)串聯(lián)基因線路，實(shí)現(xiàn)了3-羥基丙酸合成過程中生長(zhǎng)階段與生產(chǎn)階段的解耦聯(lián)。在發(fā)酵初期，高濃度葡萄糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子PHXT1控制的脂肪酸合成酶表達(dá)，將丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化成脂肪酸；同時(shí)阻遏蛋白FapR抑制啟動(dòng)子PTEF1控制的丙二酰輔酶A還原酶表達(dá)，此時(shí)細(xì)胞處于生長(zhǎng)階段。隨著葡萄糖濃度降低，PHXT1控制的脂肪酸合成酶表達(dá)水平受限，實(shí)現(xiàn)丙二酰輔酶A的積累，從而激活啟動(dòng)子PTEF1控制的丙二酰輔酶A還原酶表達(dá)使細(xì)胞進(jìn)入3-羥基丙酸合成階段。這種調(diào)控策略通過對(duì)生長(zhǎng)階段和生產(chǎn)階段進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)控，使3-羥基丙酸的生產(chǎn)能力提高了10倍［70］。

不同于完全自主的群體感應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)，基于發(fā)酵過程條件控制的動(dòng)態(tài)調(diào)控需要人工操作來改變信號(hào)輸入，因此減少了信號(hào)閾值和響應(yīng)物種類的限制，為更加精細(xì)化的動(dòng)態(tài)調(diào)控線路構(gòu)建與應(yīng)用提供了可操作的空間。通過計(jì)算機(jī)程序化調(diào)控信號(hào)的輸入，可以賦予發(fā)酵條件控制系統(tǒng)智能化、自主調(diào)控的特性。另外，滿足發(fā)酵條件調(diào)控要求的大型發(fā)酵設(shè)備的開發(fā)也是不可忽視的，這同樣是發(fā)酵條件調(diào)控應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)的關(guān)鍵因素。

4 蛋白水平動(dòng)態(tài)調(diào)控策略的研究與應(yīng)用

微生物中廣泛存在的別構(gòu)調(diào)節(jié)可用于開發(fā)蛋白水平的調(diào)控策略。別構(gòu)調(diào)節(jié)是指別構(gòu)蛋白將效應(yīng)物與別構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合效應(yīng)傳遞到活性位點(diǎn)，從而對(duì)蛋白質(zhì)的活性進(jìn)行調(diào)控的過程［71］。通過結(jié)合效應(yīng)物后的構(gòu)象改變，可以直接調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性來動(dòng)態(tài)調(diào)控代謝通量而不引入過多的代謝負(fù)擔(dān)［72］，具有較大的應(yīng)用潛力。例如，在自然界中，細(xì)胞通過終產(chǎn)物對(duì)分支途徑中的酶進(jìn)行別構(gòu)調(diào)控來防止通路的溢流。在賴氨酸生物合成過程中，蘇氨酸的生產(chǎn)途徑會(huì)與其競(jìng)爭(zhēng)代謝流。為了調(diào)控兩條途徑之間的代謝流分配、提高賴氨酸的產(chǎn)量，研究人員改造了蘇氨酸合成途徑中的高絲氨酸脫氫酶，使其受賴氨酸的別構(gòu)抑制調(diào)節(jié)而不再受蘇氨酸的調(diào)節(jié)。通過這種人工設(shè)計(jì)的別構(gòu)調(diào)節(jié)，可以根據(jù)細(xì)胞內(nèi)賴氨酸的濃度動(dòng)態(tài)調(diào)控進(jìn)入蘇氨酸途徑中的通量，降低競(jìng)爭(zhēng)途徑的碳流，達(dá)到提高賴氨酸產(chǎn)量的目的。但是，改造后的高絲氨酸脫氫酶與野生型相比活性相對(duì)較低［73］。這種蛋白水平的別構(gòu)調(diào)控具有較快的反應(yīng)時(shí)間，大量官能團(tuán)和蛋白折疊賦予了蛋白調(diào)控元件更廣闊的設(shè)計(jì)和改造空間，但抗代謝物和拮抗劑的存在容易干擾其對(duì)代謝物的特異性，這是該調(diào)控方法目前亟待解決的問題［14］。此外，一些蛋白水平的調(diào)控工具也可以實(shí)現(xiàn)代謝通路普遍適用的動(dòng)態(tài)調(diào)控。例如，Gao等［74］利用三種病毒蛋白酶和蛋白降解標(biāo)簽構(gòu)建了可以調(diào)控蛋白表達(dá)水平的振蕩器，用于振蕩表達(dá)D-木糖酸合成途徑中的木糖內(nèi)酯酶，以解決D-木糖酸積累造成細(xì)胞質(zhì)酸化進(jìn)而影響細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的問題。蛋白水平振蕩器的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了前6 h 內(nèi)木糖內(nèi)酯酶的有效振蕩表達(dá)，維持了胞內(nèi)pH 穩(wěn)定，在5L 的發(fā)酵設(shè)備中生產(chǎn)了199.44 g/L 的D-木糖酸。Brockman等［75］將SsrA降解標(biāo)簽用于肌醇合成途徑中1-磷酸果糖激酶降解速度的動(dòng)態(tài)調(diào)控，從而對(duì)葡萄糖-6-磷酸進(jìn)入糖酵解途徑和肌醇合成途徑的通量進(jìn)行調(diào)控，通過生長(zhǎng)階段與生產(chǎn)階段切換的方式將肌醇的積累量提高了2倍。

表1 動(dòng)態(tài)調(diào)控元件在代謝工程中的應(yīng)用Tab.1 Applications of dynamic regulation elements in metabolic engineering

5 展 望

動(dòng)態(tài)調(diào)控策略實(shí)現(xiàn)了物質(zhì)流與能量流在代謝網(wǎng)絡(luò)中的動(dòng)態(tài)分配，減小了外源途徑引入對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝流平衡的影響，進(jìn)一步提高了目標(biāo)產(chǎn)品的產(chǎn)量、產(chǎn)率和生產(chǎn)能力，以更有效的方式調(diào)控了多種高附加值產(chǎn)品的高效生物合成。在表1中，我們對(duì)本文引用的動(dòng)態(tài)調(diào)控元件進(jìn)行了總結(jié)。但是，動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)傳感器種類少、響應(yīng)閾值窄、調(diào)控范圍有限和調(diào)節(jié)時(shí)間不定等問題仍然制約著這些策略在代謝工程中的高效應(yīng)用。我們認(rèn)為以下策略的研究和發(fā)展有助于解決上述問題，首先，基于高通量篩選和底物相似性的篩選策略可拓寬啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)的底物譜和閾值，進(jìn)一步拓寬傳感器的種類；基于計(jì)算模擬和理性設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)工程方法開發(fā)可在不同濃度和強(qiáng)度范圍內(nèi)自由響應(yīng)的感應(yīng)器，有利于探索更多精確調(diào)節(jié)的時(shí)間和節(jié)點(diǎn)，調(diào)節(jié)感應(yīng)器響應(yīng)閾值的范圍，為動(dòng)態(tài)調(diào)控提供新的研究思路和調(diào)控工具。其次，引入調(diào)控回路和代謝途徑動(dòng)態(tài)分析的數(shù)學(xué)模型（例如非參數(shù)高斯過程回歸GPR［76］、動(dòng)態(tài)酶消耗通量分析deFBA［77］）分析調(diào)節(jié)時(shí)間和對(duì)應(yīng)的代謝流節(jié)點(diǎn)，結(jié)合不同時(shí)間響應(yīng)的感應(yīng)器文庫(kù)，可為精確分配代謝流和選擇動(dòng)態(tài)調(diào)控元件提供科學(xué)準(zhǔn)確的指導(dǎo)。此外，利用工程設(shè)計(jì)思想將不同的動(dòng)態(tài)調(diào)控元件與基因控制元件耦合，開發(fā)出多層次多功能的調(diào)控元件，有望逐級(jí)放大式調(diào)控胞內(nèi)反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)點(diǎn)-線-面的輻射式調(diào)控，擴(kuò)大代謝通路響應(yīng)速度和程度。最后，基于“與非門”和“邏輯門”等合成生物學(xué)思想設(shè)計(jì)的精細(xì)基因線路與動(dòng)態(tài)調(diào)控元件耦合可拓寬動(dòng)態(tài)調(diào)控工具的應(yīng)用范圍，有望實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行不同表達(dá)時(shí)間和不同表達(dá)程度的精確調(diào)控，為構(gòu)建動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)提供科學(xué)有效的指導(dǎo)。這些策略都有助于動(dòng)態(tài)調(diào)控體系在代謝工程領(lǐng)域進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用。除此之外，設(shè)計(jì)具有更快響應(yīng)時(shí)間的調(diào)控工具來彌補(bǔ)實(shí)際生產(chǎn)中信號(hào)輸出與表型改變之間的差距將有利于實(shí)現(xiàn)更有效的動(dòng)態(tài)調(diào)控；同時(shí)維持發(fā)酵過程中調(diào)控系統(tǒng)的穩(wěn)定性，消除代謝異質(zhì)性對(duì)實(shí)際生產(chǎn)的影響等問題也有待于深入研究以進(jìn)一步優(yōu)化動(dòng)態(tài)調(diào)控的響應(yīng)穩(wěn)定性和實(shí)時(shí)性。相信隨著合成生物學(xué)、計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)和蛋白質(zhì)工程等學(xué)科的進(jìn)一步發(fā)展，一定會(huì)推動(dòng)動(dòng)態(tài)調(diào)控策略在代謝工程領(lǐng)域的應(yīng)用。