典型模式微生物基因表達(dá)精細(xì)調(diào)控工具的研究進(jìn)展

田榮臻，劉延峰，李江華，劉龍，堵國成

（1 江南大學(xué)糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122； 2 江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

隨著基因編輯、高通量基因測序技術(shù)的飛速發(fā)展，典型模型微生物大腸桿菌（革蘭氏陰性細(xì)菌）、枯草芽孢桿菌（革蘭氏陽性細(xì)菌）和釀酒酵母（真核微生物）中新型基因表達(dá)調(diào)控工具的研究取得了顯著進(jìn)展，進(jìn)一步推動了合成生物學(xué)和代謝工程的發(fā)展。為了滿足合成生物學(xué)研究中對基因表達(dá)調(diào)控工具動態(tài)范圍和動態(tài)模式的需求，研究人員已經(jīng)設(shè)計、構(gòu)建和測試了一系列用于合成生物學(xué)研究中精確和動態(tài)控制基因表達(dá)的新型工具［1-2］。本文作者首先簡要總結(jié)了經(jīng)典的基因表達(dá)調(diào)控元件，包括啟動子、核糖體結(jié)合位點（RBS）和終止子等。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步總結(jié)了近年來發(fā)展起來的具有更大的動態(tài)范圍和更廣闊的應(yīng)用領(lǐng)域的新一代基因表達(dá)元件，例如基于大數(shù)據(jù)的合成啟動子、N 端編碼序列和小轉(zhuǎn)錄激活RNA。接下來，總結(jié)了可以實現(xiàn)全局基因調(diào)控的工具，例如基于CRISPR-dCas9 系統(tǒng)的基因表達(dá)調(diào)控工具、基于全局轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)調(diào)控工具、基于σ因子的基因表達(dá)調(diào)控工具和基于表觀遺傳修飾的基因表達(dá)調(diào)控工具。此外，還討論了近年來可以響應(yīng)特定信號的基因表達(dá)調(diào)控工具的開發(fā)，例如光遺傳調(diào)節(jié)系統(tǒng)、群體感應(yīng)系統(tǒng)、生物傳感器系統(tǒng)和蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)等。最后，提出了目前基因表達(dá)調(diào)控工具發(fā)展中仍然需要解決的問題，如響應(yīng)元件的特異性、不同基因表達(dá)調(diào)控工具的標(biāo)準(zhǔn)化以及新型基因表達(dá)調(diào)控元件在工業(yè)規(guī)模上的應(yīng)用，并針對新型基因調(diào)控工具設(shè)計、構(gòu)建和應(yīng)用的發(fā)展趨勢進(jìn)行了展望。

1 經(jīng)典基因表達(dá)調(diào)控元件

細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)水平的調(diào)控是多層次、復(fù)雜的過程，涉及基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及蛋白降解等，通過相應(yīng)基因表達(dá)元件強(qiáng)度而改變基因表達(dá)水平是經(jīng)典基因表達(dá)調(diào)控元件探索與應(yīng)用的基本思路，也是實現(xiàn)胞內(nèi)基因表達(dá)最簡便有效的方式之一。經(jīng)典的合成生物學(xué)基因表達(dá)調(diào)控元件，如啟動子、RBS、終止子等可以有效調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平與翻譯水平，在調(diào)控蛋白表達(dá)水平、改變胞內(nèi)代謝流等過程中發(fā)揮了重要作用。目前針對典型的模式微生物，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母等均已構(gòu)建了相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫，以提供不同強(qiáng)度和不同類型的基因表達(dá)元件。隨著系統(tǒng)生物學(xué)，特別是轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)測定技術(shù)的發(fā)展，不同強(qiáng)度、不同類型的經(jīng)典基因表達(dá)調(diào)控元件庫的構(gòu)建變得更簡便和高效，這進(jìn)一步增強(qiáng)了對基因表達(dá)水平的精確調(diào)控能力。

1.1 啟動子

啟動子是合成生物學(xué)和代謝工程領(lǐng)域中使用最廣泛、最基本的表達(dá)元件，也是最簡便有效的基因表達(dá)調(diào)控方法之一。它是一段能夠被RNA 聚合酶識別并結(jié)合，從而對特定基因?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)錄的DNA 序列。目前，對經(jīng)典模式微生物均構(gòu)建了包含不同類型和強(qiáng)度啟動子的文庫。這些啟動子大部分是微生物基因組上固有的啟動子序列，通過使用易于檢測的報告蛋白（如綠色熒光蛋白GFP、半乳糖苷酶等），在特定培養(yǎng)條件下進(jìn)行定量表征后得到的。例如在枯草芽孢桿菌中，分別以GFP、脂肪酶、角蛋白酶和堿性果膠酶為報告基因，表征了基因組上原始的114 個啟動子，構(gòu)建了包含3種不同類型、適用于不同pH 和溫度、表達(dá)強(qiáng)度覆蓋約70 倍的啟動子文庫［3］。但是，由于文庫構(gòu)建通常以報告基因表達(dá)量間接表征啟動子的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度，當(dāng)使用相同的啟動子表達(dá)其他基因時，可能存在難以預(yù)測的差距［4］。同時，傳統(tǒng)的啟動子文庫構(gòu)建方式存在的耗時耗力、成本高等問題亟待解決。隨著系統(tǒng)生物學(xué)，特別是轉(zhuǎn)錄組學(xué)的發(fā)展，胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄得到的mRNA 序列及豐度等數(shù)據(jù)可以被精確測量，這為啟動子文庫的豐富提供了理性的參考數(shù)據(jù)。

在所有表征的啟動子中，大部分啟動子為組成型啟動子，其不需額外的誘導(dǎo)即可使基因在胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)。除此之外，經(jīng)典的啟動子中也包括少數(shù)在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的誘導(dǎo)型啟動子，其在胞內(nèi)的表達(dá)受到特定條件，如特定化合物的誘導(dǎo)。由于微生物的生存必須適應(yīng)不斷改變的生活環(huán)境，細(xì)胞內(nèi)對于特定基因表達(dá)的開啟或關(guān)閉十分重要。其中，研究最透徹且最早開始使用的基因表達(dá)調(diào)控元件之一便是基于乳糖操縱子的乳糖誘導(dǎo)型啟動子［5］。乳糖操縱子有4 個基本的組成部分：調(diào)節(jié)基因、啟動子、操縱基因和結(jié)構(gòu)基因。當(dāng)細(xì)胞處于無乳糖的培養(yǎng)基時，調(diào)節(jié)基因表達(dá)得到的調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合于啟動子和結(jié)構(gòu)基因間的操縱基因上，使得啟動子難以轉(zhuǎn)錄其后乳糖代謝相關(guān)結(jié)構(gòu)基因。當(dāng)環(huán)境中存在乳糖時，操縱基因上的調(diào)節(jié)蛋白脫落，使得啟動子正常轉(zhuǎn)錄其后的結(jié)構(gòu)基因。根據(jù)這一原理，設(shè)計了乳糖誘導(dǎo)型啟動子用于合成生物學(xué)領(lǐng)域中對基因表達(dá)強(qiáng)度的調(diào)控。在實際應(yīng)用中，由于異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）同樣可使調(diào)節(jié)蛋白脫落，且由于其更加穩(wěn)定、不易被細(xì)胞降解的特性，常被用于乳糖誘導(dǎo)型啟動子的誘導(dǎo)劑以激活啟動子功能。這些啟動子的開發(fā)可以人為對基因表達(dá)時機(jī)和強(qiáng)度進(jìn)行干預(yù)，因此在合成生物學(xué)中具有重要的意義。

1.2 RBS與終止子

在原核生物中，轉(zhuǎn)錄得到的mRNA 通過5′端RBS 序列實現(xiàn)核糖體的招募與結(jié)合，進(jìn)一步實現(xiàn)基因的翻譯過程。因此，RBS 的強(qiáng)度直接影響了核糖體的結(jié)合效率并在一定程度上決定了翻譯強(qiáng)度。相比于啟動子，RBS 由于序列較短、操作便捷且調(diào)控范圍較大，同樣是經(jīng)典的微生物基因表達(dá)調(diào)控元件之一。目前，通過對大量RBS 序列與強(qiáng)度的統(tǒng)計與分析，認(rèn)為核糖體與RBS 的結(jié)合取決于核糖體結(jié)合速率、折疊動力學(xué)和折疊能量學(xué)?；诖?，已經(jīng)有可以在一定程度上輔助設(shè)計RBS 與預(yù)測RBS 相對強(qiáng)度的計算工具，如RBS Calculator［6-7］。

基因轉(zhuǎn)錄過程的終止，需要一段特殊的DNA序列為RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄提供終止信號，這段序列通常位于原核生物基因簇最后一個編碼基因之后或真核生物所有編碼基因之后，稱為終止子。終止子的釋放效率對于提高轉(zhuǎn)錄效率與提高mRNA穩(wěn)定性十分重要，因此，目前也開發(fā)了一系列典型模式微生物的終止子文庫。例如，對于枯草芽孢桿菌，基于λ 噬菌體進(jìn)行了終止子突變文庫的構(gòu)建，得到了具有更高轉(zhuǎn)錄終止效率的終止子突變體和利于mRNA 穩(wěn)定性的終止子突變體，并且這些方法同樣適用于其他典型模式微生物［8］。

2 新型基因表達(dá)調(diào)控元件

隨著合成生物學(xué)的快速發(fā)展，經(jīng)典的基因表達(dá)調(diào)控元件在普遍應(yīng)用的同時，亟待其性能上的提升以滿足研究中日益增長的需要。首先，理想的基因表達(dá)調(diào)控元件應(yīng)具有調(diào)控范圍大的特征，而從基因組上鑒定的天然調(diào)控元件強(qiáng)度由于受到進(jìn)化的限制而不足以為合成生物學(xué)提供所需要的強(qiáng)度。其次，理想的基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)應(yīng)具有穩(wěn)定的特征，誘導(dǎo)型啟動子應(yīng)具有基礎(chǔ)表達(dá)嚴(yán)密的特征，而經(jīng)典的天然基因表達(dá)調(diào)控元件在細(xì)胞內(nèi)潛在的調(diào)控機(jī)制可能干擾基因的穩(wěn)定表達(dá)［9］。此外，由于對中心法則認(rèn)識的有限，經(jīng)典基因表達(dá)調(diào)控元件在基因表達(dá)的不同層次上往往存在缺失。因此，為了進(jìn)一步實現(xiàn)基因表達(dá)的精確調(diào)控并擴(kuò)大調(diào)控強(qiáng)度的范圍，逐漸開發(fā)應(yīng)用了一些新型的基因表達(dá)調(diào)控元件。

2.1 新型啟動子

2.1.1 合成啟動子

經(jīng)典的啟動子往往來源于篩選表征得到的天然啟動子，而胞內(nèi)單基因的過量表達(dá)往往會損害細(xì)胞的生長，不利于宿主在自然選擇中的生存，因此經(jīng)典啟動子的強(qiáng)度往往受到很大的限制。在合成生物學(xué)研究與代謝工程改造中，天然啟動子無法滿足對于超高強(qiáng)度啟動子的需求。因此，新一代合成啟動子文庫逐漸被構(gòu)建和應(yīng)用。新型啟動子文庫根據(jù)構(gòu)建方式一般分為3種，即易錯PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）啟動子文庫、啟動子間隔區(qū)域飽和突變文庫和混合啟動子文庫［4］。易錯PCR 文庫中的啟動子是在天然啟動子的基礎(chǔ)上，通過易錯PCR 將隨機(jī)突變引入啟動子的關(guān)鍵序列而得到的。其優(yōu)點是可以將隨機(jī)突變引入整個啟動子區(qū)域，從而覆蓋盡量多的突變可能性，但是這個過程往往引入大量使啟動子失效的突變，使得文庫正向率較低。啟動子間隔區(qū)域的飽和突變方法將隨機(jī)突變靶向引入到啟動子保守序列-35 區(qū)與-10 區(qū)之間，可以在不影響啟動子功能的前提下，獲得正向率較高的啟動子文庫?；旌蠁幼庸こ淌悄壳皬膶嶒灲Y(jié)果來看獲得超強(qiáng)啟動子最高效的方法。其在已知的天然高強(qiáng)度啟動子的基礎(chǔ)上，將啟動子從兩個保守區(qū)域-35 區(qū)、-10 區(qū)截斷為3 個序列模塊，然后將模塊自由組裝搭配，得到最終的混合啟動子文庫，通過使用流式細(xì)胞儀篩選出強(qiáng)度最高的啟動子。通過這種策略，已經(jīng)在枯草芽孢桿菌中構(gòu)建得到了強(qiáng)于通用啟動子P43約500 倍的超高強(qiáng)度合成啟動子［10］。

2.1.2 廣譜啟動子

在不同的典型模式微生物，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌與釀酒酵母中表達(dá)相同的基因以進(jìn)行合成生物學(xué)研究或代謝工程改造和在不同典型模式微生物中對未知DNA 片段或基因簇的鑒定和功能表征是有效的技術(shù)手段。但是，目前天然表征的啟動子在不同物種中往往是不相容的，特別是在原核微生物和真核微生物之間，這導(dǎo)致在不同宿主中進(jìn)行相同基因表達(dá)時需要重構(gòu)具有物種特異性啟動子的表達(dá)框。為了解決此類問題，目前已經(jīng)開發(fā)了具有不同強(qiáng)度并且典型模式微生物間通用的廣譜啟動子［11］。這些廣譜啟動子可用于優(yōu)化不同宿主中的遺傳回路或生物合成途徑，從而簡化或縮短操作過程。

2.2 基于功能RNA 或DNA 的新型基因表達(dá)調(diào)控元件

2.2.1 核糖開關(guān)

核糖開關(guān)是某些mRNA 非編碼部分內(nèi)的結(jié)構(gòu)域，其可以響應(yīng)特定代謝物的結(jié)合而改變自身結(jié)構(gòu)來控制基因表達(dá)［12-13］。在細(xì)菌中，核糖開關(guān)由執(zhí)行配體識別的適體域和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄終止或翻譯起始的表達(dá)平臺組成。適體域在不同生物中高度保守，其作為目標(biāo)代謝物的精確傳感器，具有高度的選擇性和特異性。而表達(dá)平臺在序列和結(jié)構(gòu)上具有較大的可變性，其可以將代謝物與適體域的結(jié)合或脫離事件，轉(zhuǎn)化為其后基因表達(dá)的開啟或關(guān)閉。同時，核糖開關(guān)可以控制ρ因子依賴的轉(zhuǎn)錄終止以調(diào)控基因的表達(dá)。除了可以實現(xiàn)調(diào)控基因表達(dá)的功能，核糖開關(guān)還可以參與mRNA降解的調(diào)控［14］。例如，在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的賴氨酸核糖開關(guān)，在賴氨酸結(jié)合的情況下，表達(dá)平臺中RBS 序列形成二級結(jié)構(gòu)，阻止其后的基因進(jìn)行翻譯，同時，賴氨酸的結(jié)合暴露了表達(dá)平臺中RNA降解酶RNase E的切割位點，加速了相應(yīng)mRNA 的降解過程。而在賴氨酸未結(jié)合的情況下，RBS 序列暴露，而表達(dá)平臺中的RNase E結(jié)合位點被隱藏，使得其后的基因得以實現(xiàn)翻譯［15］（圖1）。

由于大部分核糖開關(guān)發(fā)現(xiàn)于原核生物，因此，天然和合成的核糖開關(guān)在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中得到了廣泛的應(yīng)用。如在大腸桿菌中，將上述賴氨酸核糖開關(guān)與細(xì)胞的生長相偶聯(lián)，即高產(chǎn)賴氨酸可以同時使細(xì)胞獲得快速生長的特性，經(jīng)過定向進(jìn)化，可獲得高產(chǎn)賴氨酸的工程大腸桿菌。同時，核糖開關(guān)也廣泛應(yīng)用于大腸桿菌中其他氨基酸類和高附加值化合物的高效生物合成，如色氨酸、維生素B12、N-乙酰神經(jīng)氨酸（NeuAc）和柚皮素等［16-19］。在枯草芽孢桿菌中，通過將glmS核糖開關(guān)整合至NeuAc 生物合成途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)框中，NeuAc 合成的分支途徑和中心代謝途徑強(qiáng)度得以調(diào)控，提高了NeuAc 的產(chǎn)量。在真核典型模式微生物釀酒酵母中，由于其翻譯元器件與原核生物的明顯差別，導(dǎo)致核糖開關(guān)在胞內(nèi)直接應(yīng)用較為困難。但是，在酵母中開發(fā)了一種間接利用核糖開關(guān)的策略，即通過利用核糖開關(guān)在配體結(jié)合時的自切割活性以控制翻譯水平，如在釀酒酵母中開發(fā)的新霉素開關(guān)［20］。

圖1 大腸桿菌賴氨酸核糖開關(guān)基因表達(dá)調(diào)控方式Fig.1 Regulation of gene expression based on E.coli lysine riboswitch

2.2.2 sRNA

細(xì)菌功能RNA 調(diào)控元件的另一類是一種較短的RNA，稱為小RNA（small RNA，sRNA）。大部分sRNA通過與特定mRNA直接堿基配對而影響基因的表達(dá)，但也有少部分通過直接與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用從而調(diào)控蛋白活性［12］。sRNA是胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子中最豐富的一類，并參與細(xì)胞中眾多的代謝和應(yīng)激反應(yīng)過程。根據(jù)與mRNA 配對方式的不同，將sRNA 分為順式作用與反式作用。此外，RNA 伴侶Hfq 可以通過促進(jìn)sRNA 堿基與其目標(biāo)mRNA 的配對，從而充當(dāng)sRNA 依賴性基因表達(dá)的關(guān)鍵介體。在所有的sRNA中，大腸桿菌rpoS基因的5′非翻譯區(qū)是研究最透徹的序列之一。RpoS蛋白是RNA聚合酶（RNAP）的σS亞基，而σS亞基是細(xì)胞響應(yīng)壓力時最普遍的σ因子之一，其調(diào)控細(xì)胞處于饑餓和不利生存環(huán)境時基因的表達(dá)［21］。rpoS的表達(dá)受到DsrA、RprA和ArcZ這3種sRNA的正調(diào)控。在對數(shù)生長期間，這些sRNA 的表達(dá)水平較低，并且rpoS的翻譯受到其mRNA 5′非翻譯區(qū)中莖環(huán)結(jié)構(gòu)的抑制，從而阻止了核糖體RBS結(jié)合以抑制基因的翻譯過程。在細(xì)胞處于穩(wěn)定期或應(yīng)激狀態(tài)時，積累的DsrA、RprA和ArcZ通過與mRNA 5′非翻譯區(qū)中堿基配對以實現(xiàn)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的破壞，使RBS序列暴露從而減輕對翻譯的抑制。同時，sRNA 可以通過抑制控制ρ因子對基因的提前終止以調(diào)控基因的表達(dá)，實現(xiàn)細(xì)胞對不斷變化的生長條件的響應(yīng)。

在多種sRNA 中，asRNA（antisense RNA，反義RNA）廣泛應(yīng)用于代謝工程中的基因表達(dá)調(diào)控［22］。其在基因組上的啟動子方向與調(diào)控目的基因相反，但轉(zhuǎn)錄重合的一段DNA 序列，因此，asRNA 與目的mRNA 完全互補(bǔ)。asRNA 通過兩種方式進(jìn)行對基因的調(diào)控，一種是通過在基因組上實現(xiàn)反義轉(zhuǎn)錄時，可以與正向轉(zhuǎn)錄的RNA 聚合酶發(fā)生碰撞脫落，從而對正向的基因轉(zhuǎn)錄起到一定的抑制作用；另一種是asRNA 與轉(zhuǎn)錄得到的目的mRNA 的互補(bǔ)結(jié)合對目的基因翻譯起到抑制作用。目前，asRNA 調(diào)控已經(jīng)應(yīng)用于模式微生物中葡萄糖酸、白藜蘆醇、柚皮素和4-羥基香豆素等高附加值化合物的生物合成［23-24］。

2.2.3 核酸適配體

核酸適配體是近年來開發(fā)的一種由單鏈DNA或RNA 適配體和蛋白配體組成的新型基因表達(dá)調(diào)控元件。核酸適配體與核糖開關(guān)不同，核糖開關(guān)是與mRNA 共轉(zhuǎn)錄的RNA 元件，通過自身結(jié)構(gòu)改變來調(diào)節(jié)基因表達(dá)；而核酸適配體可以是單鏈DNA 或RNA，其通過識別和結(jié)合配體（包括蛋白質(zhì)和小分子）發(fā)揮功能［25］。適配體可以通過特異性結(jié)合相應(yīng)的配體來改變其空間構(gòu)型以進(jìn)一步調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯。迄今為止，研究人員已經(jīng)針對各種靶標(biāo)（包括蛋白質(zhì)和小分子）鑒定了數(shù)千種DNA 或RNA 適配體［26］。其中，DNA 適配體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活依賴于兩個配體分子與兩個單鏈DNA適配體的結(jié)合，這種結(jié)合使得DNA雙鏈被解旋，從而有利于啟動子轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行［27-28］。

基于適配體動態(tài)增強(qiáng)基因表達(dá)水平的原理，已經(jīng)構(gòu)建了多種基于核酸適配體-配體的新型基因表達(dá)元件。例如，在枯草芽孢桿菌中，基于DNA 適配體與凝血酶配體構(gòu)建并優(yōu)化了用于上調(diào)基因表達(dá)水平的基因表達(dá)元件，基于RNA 適配體與凝血酶配體構(gòu)建并優(yōu)化了用于下調(diào)基因表達(dá)水平的基因表達(dá)元件。在合成2′-巖藻糖基乳糖的工程枯草芽孢桿菌構(gòu)建過程中，通過使用該上調(diào)和下調(diào)元件分別調(diào)節(jié)了外源途徑基因的表達(dá)和內(nèi)源乳糖運輸抑制基因的表達(dá)，使2′-FL 的產(chǎn)量提高27.3 倍，充分表明了該元件的有效性［29］。

2.3 N 端編碼序列

精確控制基因表達(dá)強(qiáng)度和動態(tài)模式對于代謝工程和合成生物學(xué)非常重要，特別是對于精細(xì)調(diào)控代謝途徑和優(yōu)化基因回路。經(jīng)典的調(diào)控基因表達(dá)的基因調(diào)控元件，包括啟動子、終止子、RBS等，雖然針對中心法則的每一環(huán)節(jié)均提出了相應(yīng)的調(diào)控方式，但是在每個環(huán)節(jié)仍然存在對基因表達(dá)量影響巨大的其他因素。其中目的基因本身的序列，特別是基因N 端編碼序列（N-terminal coding sequence，NCS）便是其中重要的影響因素之一，其通過影響核糖體在翻譯起始階段與mRNA 結(jié)合和延伸的效率，在翻譯水平上強(qiáng)烈影響基因表達(dá)，是細(xì)菌中的基因表達(dá)水平調(diào)控的重要機(jī)制［30-33］。在近年來的研究中，通過在典型模式微生物中的表征，越來越多的研究證實了N 端編碼序列對于基因表達(dá)的重要影響，并且提出了潛在的6 種N 端編碼序列影響mRNA 翻譯水平的機(jī)制，包括N 端規(guī)則、mRNA 二級結(jié)構(gòu)、熱力學(xué)和動力學(xué)、AT 含量、帶電荷數(shù)、氨基酸殘基數(shù)以及特殊氨基酸的豐度［34-39］。

目前，使用工程化的NCS 工具在代謝工程改造中精細(xì)調(diào)控代謝途徑仍然十分具有挑戰(zhàn)性。盡管如此，在合成生物學(xué)研究和代謝工程的實際應(yīng)用中，N 端編碼序列的重要性正被逐漸重視。例如，在大腸桿菌中，通過對于超過24.4萬個合成N端編碼序列文庫的構(gòu)建、高通量測序、表征和分析，為N端編碼序列的進(jìn)一步機(jī)理研究和代謝工程應(yīng)用提供了基礎(chǔ)［40］。在枯草芽孢桿菌中，目前開發(fā)了天然的和合成的N端編碼序列文庫及N端編碼序列的改造方法以精細(xì)調(diào)控基因的表達(dá)。在這個過程中，首先構(gòu)建和表征了基于系統(tǒng)生物學(xué)的N端編碼序列文庫作為基因表達(dá)調(diào)控元件并將其分為了4 個類型，即生長偶聯(lián)型、持續(xù)表達(dá)型、遲滯表達(dá)型和強(qiáng)烈抑制型。然后，根據(jù)對于文庫序列的統(tǒng)計分析，設(shè)計了適用于枯草芽孢桿菌的工程N(yùn)端編碼序列設(shè)計規(guī)則。最后，天然和合成的N端編碼序列作為基因表達(dá)調(diào)控元件成功應(yīng)用于NeuAc的生物合成途徑中［41］。這些研究表明N 端編碼序列可用作典型模式微生物的新型的基因表達(dá)調(diào)控元件。

3 基因表達(dá)的全局調(diào)控工具箱

經(jīng)典的基因表達(dá)調(diào)控工具雖然可以實現(xiàn)對單基因表達(dá)水平的調(diào)控，但在合成生物學(xué)和代謝工程中的實際應(yīng)用往往需要對多基因表達(dá)調(diào)控的配合。這限制了對宿主進(jìn)行改造的通量，限制了同時探索多個基因的可能，使細(xì)胞難以實現(xiàn)全局的最佳表型［2］。同時，細(xì)胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)往往存在復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，在胞內(nèi)進(jìn)行單基因或多基因表達(dá)強(qiáng)度的改變或引入異源代謝途徑往往造成細(xì)胞內(nèi)代謝的失衡，代謝負(fù)荷加劇，進(jìn)一步損害細(xì)胞生長，不利于代謝工程菌株在工業(yè)上的大規(guī)模應(yīng)用［42-43］。胞內(nèi)天然代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控機(jī)制為解決這些限制提供了方法。當(dāng)環(huán)境條件發(fā)生變化或細(xì)胞處于不利環(huán)境時，胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)可以迅速響應(yīng)環(huán)境的變化，開啟或增強(qiáng)當(dāng)前環(huán)境條件下利于細(xì)胞生存的一系列基因的表達(dá)，并抑制對細(xì)胞不利基因的表達(dá)。這種全局性的基因表達(dá)調(diào)控使細(xì)胞能夠適應(yīng)不同生長環(huán)境中的各種營養(yǎng)條件，誘導(dǎo)相應(yīng)環(huán)境條件下合適的細(xì)胞過程，如細(xì)胞發(fā)育、氮代謝和碳代謝等，提高細(xì)胞在不同環(huán)境下的抗逆性。而這些全局性的基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)往往受調(diào)控于某些特定的蛋白或RNA，如全局轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、σ 因子、6S RNA 和DNA 修飾酶等。因此，通過改變相應(yīng)基因的表達(dá)水平，即可實現(xiàn)胞內(nèi)全局性的基因表達(dá)精確調(diào)控。此外，近年來由于合成生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，也產(chǎn)生了人工的高通量基因表達(dá)調(diào)控工具——基于CRISPR-dCas9 系統(tǒng)的基因表達(dá)調(diào)控工具，其可以在不改變目的基因啟動子的情況下實現(xiàn)對多基因進(jìn)行全局調(diào)控。同時，使用σ因子進(jìn)行胞內(nèi)全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控的策略被稱為全局轉(zhuǎn)錄機(jī)器工程（gTME）［44］。目前，此概念已經(jīng)拓展至對所有的全局基因表達(dá)調(diào)控工具的應(yīng)用策略。

3.1 基于全局轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的全局基因表達(dá)調(diào)控工具

全局轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子是一類特定的功能蛋白，其通過與目標(biāo)基因啟動子區(qū)域或附近的序列特異性結(jié)合，充當(dāng)基因表達(dá)的阻遏物或激活物。其存在使細(xì)菌能夠整合各種信號，以響應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)、活性氧、滲透壓等其他環(huán)境因素的變化而改變其基因表達(dá)程序［45-46］。在原核與真核微生物中，可以通過對全局轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平調(diào)控或特異性位點突變，實現(xiàn)對某一類功能基因的全局性調(diào)控。

目前在3種典型模式微生物中均已實現(xiàn)了全局轉(zhuǎn)錄因子對于全局基因表達(dá)調(diào)控的應(yīng)用。在大腸桿菌中，通過定向進(jìn)化，得到了耐受并高產(chǎn)3-羥基丙酸的工程菌株。通過全基因組測序、基因回復(fù)突變等表征手段，發(fā)現(xiàn)YieP 全球轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的突變增強(qiáng)了大腸桿菌對3-羥基丙酸的耐受性［47］。在枯草芽孢桿菌中，開發(fā)了基于全局轉(zhuǎn)錄因子CodY 和CcpA 的碳氮代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控方法，通過對兩種全局轉(zhuǎn)錄因子突變文庫的構(gòu)建與表征，成功實現(xiàn)了對于碳源和氮源吸收和利用的全局性調(diào)節(jié)，大大提高了β-半乳糖苷酶、木聚糖酶和肽酶的產(chǎn)量［48-49］。在釀酒酵母中，通過對轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子SPT3 的隨機(jī)突變，成功提高了其鉛耐受性［50］；通過對轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Pdrlp 的突變，可以實現(xiàn)其對有機(jī)溶劑的耐受性［51］；通過對轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子SPT15的突變，可以實現(xiàn)其對乙醇和葡萄糖的耐受性［52］。同時，在酵母中構(gòu)建了含鋅指的人工轉(zhuǎn)錄因子的隨機(jī)文庫，并鑒定了其中與酵母耐熱性、耐藥性和滲透性等表型相關(guān)的突變子。

3.2 基于σ因子的全局基因表達(dá)調(diào)控工具

σ因子是DNA依賴型RNA聚合酶全酶的一個亞基，只有RNA聚合酶核心酶與σ因子結(jié)合組成全酶時，σ因子才有DNA結(jié)合功能［53］。在宿主內(nèi)存在多種不同的σ因子，每一種σ因子均存在啟動子偏好，可以通過引導(dǎo)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄不同的基因來實現(xiàn)基因表達(dá)水平的調(diào)控。例如，在大腸桿菌中，一種特殊的σ因子——σ32可以引導(dǎo)核心酶在熱休克基因的啟動子處轉(zhuǎn)錄，從而使細(xì)胞耐受于環(huán)境溫度的改變。在研究中發(fā)現(xiàn)，通過對σ因子的突變，可以改變其啟動子偏好性，從而影響胞內(nèi)一系列基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而在全局水平上調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄組。這被視為一種全局性的基因表達(dá)調(diào)控工具。

目前，在典型原核模式微生物中，基于σ因子的全局基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控工具均已被構(gòu)建和應(yīng)用。最早的研究集中于大腸桿菌中。通過對大腸桿菌內(nèi)必需的持家σ 因子——σ70的編碼基因rpoD進(jìn)行隨機(jī)突變文庫的構(gòu)建，鑒定并表征得到了3種目標(biāo)突變子：乙醇耐受性菌株、高產(chǎn)目的化學(xué)品菌株（高產(chǎn)番茄紅素）以及多種所需的表型結(jié)合菌株（同時耐受乙醇和十二烷基硫酸鈉）［54］。在枯草芽孢桿菌中，調(diào)控應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子σB編碼基因sigB的表達(dá)可以阻止發(fā)酵過程生物膜的有害過度生長并加速細(xì)胞在饑餓狀態(tài)下的擴(kuò)散；通過敲除σB編碼基因sigZ，可以防止芽孢的形成，從而使其更適合于大規(guī)模的氨基酸發(fā)酵。

3.3 基于表觀遺傳修飾的全局基因表達(dá)調(diào)控工具

基于表觀遺傳修飾的基因表達(dá)調(diào)控工具通過在宿主基因組中引入DNA 修飾以實現(xiàn)全局基因表達(dá)水平的調(diào)控。表觀遺傳機(jī)制涉及DNA 甲基化、組蛋白修飾和RNA 沉默等過程，所有這些過程均可以控制基因表達(dá)［55-56］。表觀遺傳機(jī)制主要作用于真菌、植物等真核生物，尤其在人類胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、基因組印記以及癌癥等疾病的發(fā)展中起作用［57］。在細(xì)菌中，研究最多的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制為DNA甲基化，其通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶對基因組進(jìn)行修飾［58］。目前，在細(xì)菌和真核生物中均發(fā)現(xiàn)了腺嘌呤和胞嘧啶甲基化，但已證明胞嘧啶甲基化對真核生物的基因調(diào)控影響更大，而腺嘌呤甲基化在細(xì)菌中具有更大的調(diào)控作用。DNA 甲基化在胞內(nèi)主要實現(xiàn)兩種功能：一種是細(xì)胞限制-修飾系統(tǒng)的重要組成部分，用以抵御噬菌體的入侵，胞內(nèi)限制性核酸內(nèi)切酶切割來源于入侵噬菌體的或其他外源的未被甲基化的DNA，而宿主本身基因組由于存在甲基化而避免了切割；另一種功能是通過與限制-修飾系統(tǒng)無關(guān)的孤兒甲基轉(zhuǎn)移酶發(fā)揮全局基因表達(dá)調(diào)控的功能。目前，在典型模式微生物中，已經(jīng)有研究表明通過調(diào)控基因組修飾相關(guān)蛋白（如大腸桿菌DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶，Dam）可以調(diào)控宿主多種生理過程，如DNA復(fù)制、DNA 修復(fù)、有氧呼吸、氨基酸代謝、核苷酸代謝、鞭毛生物合成和環(huán)境抗逆性［55］。

3.4 基于sRNA的全局基因表達(dá)調(diào)控工具

此外，一種非編碼功能的sRNA——6S RNA也可作為全局基因調(diào)控工具［59-60］。6S RNA 是廣泛存在于細(xì)菌中的轉(zhuǎn)錄下調(diào)全局調(diào)控因子，對于調(diào)節(jié)環(huán)境壓力和優(yōu)化營養(yǎng)匱乏期間細(xì)胞的存活至關(guān)重要［61］。在細(xì)胞生長過程中，6S RNA 逐漸積累，通過與持家σ 因子σ70和應(yīng)激σ 因子σ38相互作用影響RNA 聚合酶全酶對基因轉(zhuǎn)錄的啟動子偏好性，調(diào)控胞內(nèi)全局性的基因表達(dá)［62］。6S RNA 作為一種全局基因表達(dá)調(diào)控工具，在大腸桿菌中的表達(dá)量可以顯著影響細(xì)胞的環(huán)境抗逆性［59］。

3.5 基于CRISPR的基因表達(dá)調(diào)控工具

CRISPR（規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列）系統(tǒng)是存在于約40%細(xì)菌和90%古細(xì)菌的外源DNA抵抗系統(tǒng)，其通常由三部分組成：Cas 蛋白，成熟的CRISPR RNA（crRNA）和與crRNA 部分互補(bǔ)的反式RNA（tracrRNA）［63］。當(dāng)外源DNA 如噬菌體DNA 侵入細(xì)胞時，兩種RNA 結(jié)合后可以引導(dǎo)Cas 蛋白實現(xiàn)對外源基因的切割。在不同的生物體中發(fā)現(xiàn)了多種CRISPR 系統(tǒng)，其中最簡單，也是目前應(yīng)用最廣泛的一種是化膿鏈球菌的Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)［64-65］。其Cas蛋白——Cas9可以通過突變沉默其DNA 切割功能，保留其DNA 結(jié)合功能，得到dCas9 蛋白。在此基礎(chǔ)上，利用CRISPR/dCas9 系統(tǒng)的序列結(jié)合特異性可以實現(xiàn)多種基因表達(dá)調(diào)控功能，將dCas9融合強(qiáng)激活域，可以實現(xiàn)目的基因轉(zhuǎn)錄水平的提高，稱為CRISPRa；將dCas9 靶向于基因的啟動子處，或?qū)Cas9 融合強(qiáng)抑制域，如MXI1， 可以干擾目的基因轉(zhuǎn)錄， 稱為CRISPRi［66-67］。這些基因表達(dá)調(diào)控工具可以在不改變目的基因表達(dá)框的情況下，實現(xiàn)胞內(nèi)多基因全局表達(dá)水平的改變，提高了代謝工程改造效率。目前，在3種典型模式微生物中，均發(fā)展出了廣泛應(yīng)用的基于CRISPR 的基因表達(dá)調(diào)控工具。隨著工具的進(jìn)一步發(fā)展，也已經(jīng)開發(fā)出了基于多種dCas蛋白的基因表達(dá)調(diào)控工具，如dCpf1，其相較于dCas9 增加了對于RNA 的編輯功能，提高了能夠同時調(diào)控的基因數(shù)量［68］。

4 響應(yīng)特定信號的基因表達(dá)調(diào)控工具箱

靜態(tài)基因表達(dá)調(diào)控工具可以實現(xiàn)合成生物學(xué)對于基因表達(dá)的基本要求，并在代謝工程中通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)量平衡胞內(nèi)各代謝途徑的通量。但是，當(dāng)靜態(tài)基因表達(dá)調(diào)控工具存在局限時，如目的基因的表達(dá)或中間代謝產(chǎn)物對細(xì)胞生長造成損害或加劇細(xì)胞代謝負(fù)荷時，實現(xiàn)精確的基因表達(dá)動態(tài)調(diào)控顯得越來越重要。經(jīng)典的基因表達(dá)調(diào)控元件中，僅有很少的工具，例如誘導(dǎo)型啟動子可以實現(xiàn)對于基因的動態(tài)表達(dá)調(diào)控，但啟動子數(shù)量的有限、誘導(dǎo)劑的額外添加、較小的動態(tài)范圍以及基礎(chǔ)表達(dá)的泄露使其越來越不能滿足合成生物學(xué)研究與代謝工程應(yīng)用的需要，亟待發(fā)展出新型的可響應(yīng)多種特定信號的基因表達(dá)動態(tài)調(diào)控工具［2，43］。

在胞內(nèi)，動態(tài)的基因表達(dá)調(diào)控是天然代謝產(chǎn)物的普遍調(diào)控方式。基于此，目前新發(fā)展出了一系列新型的天然基因表達(dá)調(diào)控工具。例如，通過天然代謝產(chǎn)物對基因表達(dá)的反饋調(diào)節(jié)開發(fā)了生物傳感器（biosensor），通過宿主間基于化學(xué)信號交流導(dǎo)致特定基因表達(dá)的現(xiàn)象開發(fā)了群體響應(yīng)分子開關(guān)。此外通過組合天然發(fā)現(xiàn)的分子工具或通過人工改造已有分子工具的生物學(xué)特性，開發(fā)出了一系列天然不存在的人工基因表達(dá)調(diào)控工具。這些工具及其組合的使用可以實現(xiàn)類似于天然的基因表達(dá)調(diào)控功能，在緩解細(xì)胞代謝負(fù)荷、胞內(nèi)中間代謝產(chǎn)物自動控制、解偶聯(lián)細(xì)胞生長與生產(chǎn)過程等方面具有廣闊的應(yīng)用前景，成為未來研究和開發(fā)的重要方向之一。

4.1 基于光遺傳學(xué)的基因表達(dá)調(diào)控工具

經(jīng)典的動態(tài)基因表達(dá)調(diào)控元件——誘導(dǎo)型啟動子通過誘導(dǎo)劑的添加可以實現(xiàn)基因表達(dá)的激活，但是當(dāng)需要停止基因表達(dá)時，很難立即移除細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中的誘導(dǎo)劑。因此，需要開發(fā)一些能夠?qū)崿F(xiàn)輸入信號瞬間開啟或移除的基因表達(dá)調(diào)控工具。在所有的輸入信號中，光是一種理想的基因表達(dá)調(diào)控信號，其可以被瞬間開啟或關(guān)閉［69］。因此，有必要開發(fā)基于光遺傳學(xué)的基因表達(dá)調(diào)控工具。在自然界中，天然存在多種光調(diào)控的基因表達(dá)元件，通過光信號的輸入，可以實現(xiàn)胞內(nèi)蛋白的相互作用或基因轉(zhuǎn)錄的開啟［70-72］。光誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄一般基于感光蛋白結(jié)構(gòu)的變化，在有特定波長光照射的情況下，其可以將光信號轉(zhuǎn)化為基因表達(dá)信號，當(dāng)移除光源時，感光器會發(fā)生暗還原，恢復(fù)原始狀態(tài)?；谶@一原理，最初在神經(jīng)元的控制領(lǐng)域構(gòu)建了光遺傳學(xué)工具，用以在完整的哺乳動物神經(jīng)組織內(nèi)實現(xiàn)神經(jīng)元刺激或抑制的精確時空調(diào)控［73-76］。

目前光遺傳學(xué)工具箱已廣泛擴(kuò)展應(yīng)用至所有的典型模式微生物，并在離子選擇性、光譜靈敏度和時間分辨率等方面進(jìn)行了優(yōu)化，以用于合成生物學(xué)研究和代謝工程改造。在大腸桿菌中，基于藍(lán)細(xì)菌植物色素8（Cph8）構(gòu)建了紅光依賴的基因表達(dá)調(diào)控工具，基于藍(lán)細(xì)菌膜相關(guān)組氨酸激酶CcaS 及其調(diào)節(jié)蛋白CcaR 構(gòu)建了紅光依賴的基因表達(dá)調(diào)控工具，使工程大腸桿菌能夠獨立感應(yīng)紅光和綠光，實現(xiàn)多基因表達(dá)的精確時空調(diào)控［77-78］。這套光遺傳調(diào)控系統(tǒng)進(jìn)一步被引入至枯草芽孢桿菌，通過優(yōu)化途徑基因表達(dá)，在枯草芽孢桿菌內(nèi)成功實現(xiàn)了超過70 倍的基因表達(dá)激活［79］。在釀酒酵母中，基于一種藍(lán)光激活的光、氧、電壓結(jié)構(gòu)域（lightoxygen-voltage sensing domain，LOV）光敏蛋白，EL222 和相應(yīng)光敏轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合啟動子PC120，成功構(gòu)建了兩個酵母光遺傳基因表達(dá)工具OptoEXP 和OptoINVRT，分別用于藍(lán)光依賴的基因表達(dá)激活與基因表達(dá)抑制，并成功應(yīng)用于代謝工程中提高釀酒酵母異丁醇和2-甲基-1-丁醇的產(chǎn)量［73］（圖2）。

圖2 基于光遺傳學(xué)的基因表達(dá)調(diào)控工具Fig.2 Optogenetic-based regulation tools for gene expression

4.2 基于蛋白降解標(biāo)簽的基因表達(dá)調(diào)控工具

在目前的基因表達(dá)精確調(diào)控工具中，大部分工具都集中在對轉(zhuǎn)錄和翻譯過程的調(diào)控，這些工具適用于大多數(shù)情況。但是當(dāng)構(gòu)建的遺傳回路需要更短的響應(yīng)時間時，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的調(diào)控可能造成遺傳回路的失效，而在蛋白水平上對蛋白豐度的調(diào)控理論上更加迅速［80］。在自然界中天然存在一些蛋白豐度調(diào)控信號，其中蛋白降解標(biāo)簽由于組成和操作的簡便性，已經(jīng)應(yīng)用于基因表達(dá)調(diào)控工具的開發(fā)［81-83］。目前，相關(guān)工具的應(yīng)用大多在大腸桿菌中進(jìn)行。例如，在大腸桿菌中通過將蛋白降解的端與CRISPRi 結(jié)合，開發(fā)了能夠應(yīng)用于必需基因鑒定和抗生素發(fā)現(xiàn)的基因表達(dá)調(diào)控工具［84］；將蛋白降解標(biāo)簽用于構(gòu)建大腸桿菌中具有正交性的遺傳回路，實現(xiàn)了基因表達(dá)200倍的抑制與8～190 倍的激活［85］；在大腸桿菌中構(gòu)建了基于病毒蛋白酶與蛋白水解信號的代謝開關(guān)，進(jìn)一步開發(fā)了包括3種動態(tài)調(diào)節(jié)回路的合成生物學(xué)工具箱，實現(xiàn)了代謝通量的快速響應(yīng)［80］。

4.3 基于群體響應(yīng)的基因表達(dá)調(diào)控工具

當(dāng)工程細(xì)胞外源基因的表達(dá)不利于細(xì)胞的生長或中間代謝產(chǎn)物具有細(xì)胞毒性時，將細(xì)胞的生長過程與生產(chǎn)過程解偶聯(lián)是最佳的解決方法之一，即先使細(xì)胞生長至合適狀態(tài)，再開啟生產(chǎn)過程［86］。在之前介紹的動態(tài)基因表達(dá)精確調(diào)控工具中，基因表達(dá)狀態(tài)的改變均依賴于人為輸入信號，如誘導(dǎo)物的添加、光照條件的改變等。這就需要對細(xì)胞狀態(tài)具有良好的判斷，增加了發(fā)酵生產(chǎn)的不確定性與復(fù)雜性［42］。解決方法是構(gòu)建能夠自動判斷細(xì)胞所在群體狀態(tài)和細(xì)胞密度的基因表達(dá)調(diào)控工具以自動開啟生產(chǎn)過程［87］。天然存在的理想的細(xì)菌交流系統(tǒng)，即細(xì)菌群體響應(yīng)系統(tǒng)，其通過細(xì)胞外化學(xué)信號的釋放與接收，響應(yīng)細(xì)胞密度的變化。例如，當(dāng)環(huán)境中的細(xì)胞密度超過某一閾值時，胞內(nèi)特定基因的表達(dá)狀態(tài)會發(fā)生，如特定基因表達(dá)的激活或抑制。

基于這一原理，已經(jīng)在兩種典型模式原核生物中建立并優(yōu)化了基于群體響應(yīng)的基因表達(dá)調(diào)控工具。例如，在大腸桿菌中，基于LuxR 群體響應(yīng)系統(tǒng)的基因表達(dá)調(diào)控工具可在細(xì)胞生長中后期將TCA 循環(huán)的通量轉(zhuǎn)向異丙醇生產(chǎn)，基于EsaR 群體響應(yīng)系統(tǒng)的基因表達(dá)調(diào)控工具可在細(xì)胞生長中后期將糖酵解通量轉(zhuǎn)向葡萄糖二酸生產(chǎn)［88-89］。在枯草芽孢桿菌中，使用基于Phr60-Rap60-Spo0A 的雙功能QS 系統(tǒng)構(gòu)建遺傳基因回路可將維生素K2產(chǎn)量提高40 倍［90］。由于真核微生物與原核微生物在胞內(nèi)環(huán)境、轉(zhuǎn)錄元件結(jié)構(gòu)等方面存在巨大差異，因此將細(xì)菌中的群體響應(yīng)基因表達(dá)調(diào)控元件應(yīng)用到釀酒酵母中仍然具有挑戰(zhàn)性。但是，目前也已經(jīng)設(shè)計出了基于酵母細(xì)胞間信息素通訊的群體感應(yīng)系統(tǒng)，并成功應(yīng)用于提高釀酒酵母對羥基苯甲酸等化學(xué)品的產(chǎn)量［91］。

4.4 基于生物傳感器的基因表達(dá)調(diào)控工具

在發(fā)酵過程中，對于工程菌株的理想要求是其能夠像野生型菌株一樣，自動監(jiān)測環(huán)境和胞內(nèi)代謝物平衡狀態(tài)，并自動進(jìn)行不同代謝途徑之間代謝流量的調(diào)節(jié)。但在工程菌株生產(chǎn)高附加值化合物的過程中，目的途徑往往被過表達(dá)或引入的異源代謝途徑會合成原有代謝網(wǎng)絡(luò)動態(tài)調(diào)控范圍以外的代謝產(chǎn)物。這使得細(xì)胞不能對這些途徑進(jìn)行自動、合理的動態(tài)調(diào)控以減輕細(xì)胞代謝負(fù)荷。為了最大限度地減少與這種生物合成過程相關(guān)的負(fù)擔(dān)，最近的一些研究通過模仿天然基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，開發(fā)出了可以響應(yīng)特定代謝產(chǎn)物并實現(xiàn)細(xì)胞自主調(diào)節(jié)的基因表達(dá)調(diào)控工具，稱為基于生物傳感器的基因表達(dá)調(diào)控工具［1］。生物傳感器可以將特定代謝物濃度信號作為輸入并將其轉(zhuǎn)換為對特定基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在典型模式微生物中均開發(fā)出了這種基因表達(dá)工具，并且其在合成生物學(xué)研究和代謝工程領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛。

基于生物傳感器的基因表達(dá)調(diào)控工具首先可以應(yīng)用于對胞內(nèi)代謝途徑的自動調(diào)控。例如，在大腸桿菌中，開發(fā)了基于丙二酰-CoA 生物傳感器的基因表達(dá)調(diào)控元件，通過自動調(diào)控脂肪酸合成關(guān)鍵基因的表達(dá)實現(xiàn)了細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成間的平衡［92］；在枯草芽孢桿菌中，構(gòu)建了基于GlcN6P生物傳感器的基因表達(dá)調(diào)控元件，可以在檢測到細(xì)胞內(nèi)GlcN6P 積累后激活下游基因表達(dá)同時抑制上游基因表達(dá)［68］?；谏飩鞲衅鞯幕虮磉_(dá)調(diào)控工具還可以用于實現(xiàn)細(xì)胞合成“成癮”策略。例如，在大腸桿菌中通過使用甲羥戊酸生物傳感器調(diào)控細(xì)胞必需基因的表達(dá)，可以實現(xiàn)對培養(yǎng)體系內(nèi)產(chǎn)物合成亞群生長的激勵與產(chǎn)物非合成亞群生長的抑制［93］。此外，基于生物傳感器的基因表達(dá)調(diào)控工具可以將細(xì)胞表型與產(chǎn)物合成偶聯(lián)，從而獲取高產(chǎn)菌株［94-95］。例如，在大腸桿菌和釀酒酵母中，使用酪氨酸和類異戊二烯生物傳感器增加菌株突變率并根據(jù)熒光蛋白表達(dá)強(qiáng)度篩選高產(chǎn)菌株［96］；在釀酒酵母中，將芳香族氨基酸生物傳感器與細(xì)胞抗生素抗性相偶聯(lián)，通過定向進(jìn)化得到黏康酸高產(chǎn)菌株［97］。

5 結(jié)論與展望

目前，典型模式微生物基因表達(dá)精細(xì)調(diào)控工具已經(jīng)圍繞中心代謝各個層面進(jìn)行了補(bǔ)充、增強(qiáng)與發(fā)展，包括基因水平、轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平和蛋白水平，實現(xiàn)了工具的多樣化和創(chuàng)新性（表1）。同時，新型的基因表達(dá)調(diào)控工具已經(jīng)在一定程度上實現(xiàn)了理想基因表達(dá)調(diào)控元件的特征，如嚴(yán)格控制的泄露率、便于調(diào)節(jié)的動態(tài)模式、寬泛的響應(yīng)區(qū)間、良好的正交性和穩(wěn)定的信號響應(yīng)性等。此外，隨著系統(tǒng)生物學(xué)和計算分析技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，研究人員發(fā)現(xiàn)了越來越多性能強(qiáng)大的天然細(xì)胞基因表達(dá)精細(xì)調(diào)控工具，并且已經(jīng)用于動態(tài)基因表達(dá)精細(xì)調(diào)控。同時，根據(jù)日益豐富的生物學(xué)信息開發(fā)功能更強(qiáng)大的基因表達(dá)精細(xì)調(diào)控元件也是未來發(fā)展的方向之一。性能更強(qiáng)大的基因表達(dá)調(diào)控工具可以進(jìn)一步促進(jìn)合成生物學(xué)和代謝工程的發(fā)展，如使工程菌株工程菌能夠響應(yīng)監(jiān)測到代謝壓力而自動精確調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在實現(xiàn)胞內(nèi)資源平衡、防止代謝毒性和抑制低產(chǎn)亞群等方面具有廣闊的前景。此外值得注意的是，在3種典型模式微生物中，由于釀酒酵母基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，如轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件結(jié)構(gòu)、群體響應(yīng)機(jī)制等相較于原核生物更加復(fù)雜，且其基因改造效率遠(yuǎn)低于大腸桿菌與枯草芽孢桿菌，使得在釀酒酵母中基因表達(dá)調(diào)控元件的發(fā)展相對于典型模式原核微生物來說仍然相對緩慢。隨著系統(tǒng)生物學(xué)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展和對真核生物基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的了解更加深入，可以實現(xiàn)釀酒酵母基因表達(dá)調(diào)控元件的進(jìn)一步拓展與完善。

表1 模式微生物新型基因表達(dá)調(diào)控工具Tab.1 Regulatory tools of gene expression for model microorganisms

續(xù)表

同時，目前的基因表達(dá)調(diào)控工具仍然存在一些亟待解決的問題。首先是響應(yīng)元件的特異性，如在自然界中得到的天然生物傳感器，其往往可以同時響應(yīng)一類化合物且極難改造和優(yōu)化，這使得復(fù)雜的胞內(nèi)環(huán)境對其存在極大的干擾。其次，當(dāng)前的基因表達(dá)調(diào)控工具的開發(fā)存在不同的標(biāo)準(zhǔn)，如何通過大數(shù)據(jù)的分析或構(gòu)建統(tǒng)一的參考標(biāo)準(zhǔn)將不同基因表達(dá)調(diào)控進(jìn)行強(qiáng)度或動態(tài)模式的標(biāo)準(zhǔn)化是一項巨大的挑戰(zhàn)。最后，當(dāng)前的新型基因表達(dá)調(diào)控工具大多停留在實驗室層面，特別是響應(yīng)多種信號的動態(tài)調(diào)控元件，如何實現(xiàn)其從概念驗證到工業(yè)化大規(guī)模應(yīng)用的成功過渡是未來發(fā)展所注重的問題。通過機(jī)器學(xué)習(xí)算法對目前已有數(shù)據(jù)的整合分析，為基因表達(dá)調(diào)控工具的應(yīng)用提供預(yù)測與參考是有望解決上述問題的重要途徑。