2'-巖藻糖基乳糖的酶法合成研究進(jìn)展和展望

史然，江正強(qiáng)

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

人乳寡糖（human milk oligosaccharides，HMOs）是人乳中一系列結(jié)構(gòu)復(fù)雜、不可消化的碳水化合物，對嬰幼兒的健康及生長發(fā)育起到關(guān)鍵作用。HMOs 在初乳中含量為22～24 g/L，在正常乳中含量為5～12 g/L，是人乳中僅次于脂肪和乳糖的第三大固體成分。HMOs在牛乳及其他哺乳動物乳中含量極低［1-2］。目前，母乳中已發(fā)現(xiàn)200 多種HMOs，已完全解析將近100 種HMOs 的結(jié)構(gòu)［3］。根據(jù)單糖組成及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)［圖1（a）］，HMOs 又分為中性巖藻糖基（neutral fucosylated）、中性非巖藻糖基（neutral non-fucosylated）、唾液酸（sialylated）和其他HMOs（表1）［4］。2'-巖藻糖基乳糖（2'-fucosyllactose，2'-FL）在HMOs 中含量最為豐富，具有調(diào)節(jié)腸道菌群、抵抗病原菌的黏附、免疫調(diào)節(jié)及促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和修復(fù)等多種功能活性［5］。FDA和歐盟均已批準(zhǔn)2'-FL和乳酰-N-新四糖（lacto-N-neotetraose，LNnT）可添加到嬰幼兒奶粉、膳食補(bǔ)充劑以及醫(yī)療食品中。目前，工業(yè)上已成功生產(chǎn)出包括2'-FL 在內(nèi)的幾種HMOs，Glycom A/S、 Jennewein Glycosyn/Friesland Campina Domo、Inbiose/DuPont等幾家公司是HMOs的主要生產(chǎn)商。2'-FL的主要獲取途徑為從母乳中提取、化學(xué)合成、全細(xì)胞合成以及酶法合成［6］。

圖1 HMOs組成單元及連接方式（a）和幾種FL的結(jié)構(gòu)（b）［4］Fig.1 General structure and linkage types of HMOs(a)and structures of fucosyllactoses(b)［4］

1 巖藻糖基乳糖（FL）

人乳中主要寡糖的結(jié)構(gòu)及含量見表1。2'-FL在HMOs 中約占31%（摩爾分?jǐn)?shù)），含量為0.06～3.93 g/L，是人乳中相對豐度最高的寡糖；3-巖藻糖基乳糖（3-fucosyllactose，3-FL）在HMOs 中約占5%，含量為0.03～1.34 g/L，2'，3-二巖藻糖基乳糖（2'，3-difucosyllactose， 2'，3-FL 或DFL） 在HMOs中約占4%，含量為0.28～0.43 g/L［4，6］。

FL 由巖藻糖和乳糖連接而成［圖1（b）］，巖藻糖殘基可通過α-1，2-糖苷鍵連接到乳糖的半乳糖殘基上構(gòu)成2'-FL；或通過α-1，3-糖苷鍵連接到乳糖還原端的葡萄糖構(gòu)成3-FL；或同時(shí)通過這兩種糖苷鍵連接到乳糖上構(gòu)成2'，3-FL 或DFL［6］。另外，巖藻糖還可以通過α-1，3-糖苷鍵連接到乳糖的半乳糖殘基上構(gòu)成3'-巖藻糖基乳糖（3'-fucosyllactose，3'-FL）［7］。上述幾種FL中，2'-FL、3-FL 和DFL 均存在于人乳中，3'-FL尚未在人乳中發(fā)現(xiàn)，有研究顯示α-L-Fuc1，3Gal糖苷鍵存在于一種人乳低聚九糖的側(cè)鏈上［8］。

2 2'-FL的功能活性

2'-FL具有多種功能活性，包括調(diào)節(jié)腸道菌群、抵抗病原菌的黏附、免疫調(diào)節(jié)及促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和修復(fù)等［6］。

2.1 調(diào)節(jié)腸道菌群

研究表明，2'-FL對嬰兒早期腸道菌群的建立有重要影響［9］。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2'-FL可促進(jìn)長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum，即B.longum）、兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum， 即B. bifidum）ATCC 15696、嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacterium infantis，即B.infantis）M-63等雙歧桿菌的增殖［10-13］。這些雙歧桿菌利用2'-FL的機(jī)制基于自身表達(dá)的2'-FL轉(zhuǎn)運(yùn)體（ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體）和/或相關(guān)的巖藻糖苷水解酶發(fā)揮相應(yīng)功能。有研究發(fā)現(xiàn)B.bifidum可將α-1，2-巖藻糖苷酶分泌至胞外或細(xì)胞表面對2'-FL 進(jìn)行水解，而B.longum和B.infantis則依靠細(xì)胞表面的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體先將2'-FL轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)，再利用胞內(nèi)的α-1，2-巖藻糖苷酶對2'-FL進(jìn)行水解［14-15］。研究表明，一些腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的菌株不能利用2'-FL［16］。

表1 主要HMOs的分類、結(jié)構(gòu)及含量［4，6］Tab.1 Structures and contents of major HMOs［4，6］

2.2 抵抗病原菌的黏附

2'-FL可在腸上皮細(xì)胞表面形成一層糖萼或作為腸上皮細(xì)胞表面的糖蛋白或糖脂的類似物，競爭性地與一些病原菌結(jié)合，從而阻斷病原菌與腸上皮細(xì)胞表面的糖蛋白或糖脂結(jié)合，降低新生兒的感染風(fēng)險(xiǎn)［17］。空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni，C.jejuni）是導(dǎo)致嬰兒細(xì)菌性腹瀉的主要原因之一。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2'-FL 可降低C. jejuni的對腸上皮細(xì)胞的侵染（80%），降低腸上皮細(xì)胞促炎信號的釋放。動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2'-FL 也可以降低C. jejuni對小鼠腸道的侵染（80%），并降低腸道炎癥反應(yīng)［18］。墨西哥一項(xiàng)關(guān)于嬰兒腸道健康調(diào)查報(bào)告顯示，當(dāng)母乳中2'-FL含量較高時(shí)，所喂養(yǎng)嬰兒的腹瀉發(fā)生率降低。且2'-FL與各種原因引起的腹瀉均呈劑量依賴關(guān)系［19］。

2.3 免疫調(diào)節(jié)

2'-FL 可直接作用于腸道上皮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其基因表達(dá)，改變細(xì)胞表面多糖及細(xì)胞應(yīng)答，具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用［20］。2'-FL 對壞死性小腸結(jié)腸炎（NEC）具有較好的預(yù)防效果。體外研究表明，2'-FL可以降低致病性E. coli對Caco-2 細(xì)胞的黏附（18%）［21］。動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，2'-FL 通過增強(qiáng)NEC 模型鼠的腸系膜血管灌注來降低小腸的損傷程度［22］。研究還表明，2'-FL 可通過誘導(dǎo)白細(xì)胞介素10+（IL-10+）和穩(wěn)定肥大細(xì)胞來緩解小鼠的過敏癥狀［23］。此外，補(bǔ)充2'-FL 可顯著增加小鼠脾細(xì)胞中CD4+輔助性T 細(xì)胞、CD8+細(xì)胞毒性T 細(xì)胞和干擾素γ的產(chǎn)生，從而改善接種疫苗小鼠體液和細(xì)胞水平上的免疫應(yīng)答［24］。

2.4 促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和修復(fù)

2'-FL 可緩解中風(fēng)腦神經(jīng)變性，通過抑制胞漿游離鈣濃度（［Ca++］i）、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡起到神經(jīng)保護(hù)的作用［25］。日常攝入2'-FL 還影響嚙齒動物的認(rèn)知領(lǐng)域并改善其學(xué)習(xí)和記憶能力［26］。

3 2'-FL的合成

2'-FL的諸多功能活性使其成為嬰幼兒配方奶粉的理想配料。將2'-FL作為食品配料的前提是2'-FL能穩(wěn)定、大規(guī)模地生產(chǎn)，且達(dá)到食品級的安全要求。在早期科學(xué)研究中，HMOs是從母乳中分離出來的，由于人乳寡糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，從中獲得一定量單一結(jié)構(gòu)的寡糖比較困難。目前，2'-FL的合成方法包括化學(xué)合成［27］、全細(xì)胞合成［28］和酶法合成［29］，三種方法的工藝流程如圖2所示。經(jīng)過一系列的改進(jìn)后，這些方法有望大規(guī)模、高效地合成2'-FL。

3.1 化學(xué)合成

近期，丹麥Glycom A/S公司報(bào)道了公斤級2'-FL的化學(xué)合成方法（圖3）。2'-FL的化學(xué)合成過程主要包括三步，首先，以L-巖藻糖為起始底物經(jīng)過3次反應(yīng)合成巖藻糖基供體，得率為67%～72%；隨后，以乳糖為起始原料經(jīng)過兩步反應(yīng)合成乳糖受體，得率為52%；最后，巖藻糖基供體和乳糖受體經(jīng)三步反應(yīng)合成巖藻糖基乳糖。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過一步柱色譜分離，可獲得純度較高的2'-FL，得率為19.8%～27.3%［27］?；瘜W(xué)方法存在大量有機(jī)試劑的使用、步驟繁雜、反應(yīng)條件苛刻且產(chǎn)物得率低等問題，因此以L-巖藻糖為起始底物化學(xué)合成2'-FL 成本較高。2015 年9 月，由Glycom A/S 公司化學(xué)合成的2'-FL在美國獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）審批。目前化學(xué)合成的2'-FL主要用于臨床前和臨床研究。

圖2 2'-FL的生產(chǎn)工藝流程Fig.2 Process flow charts of 2'-FL production by chemical synthesis strategy(a)cell factory approach(b)and enzymatic synthesis method(c)

圖3 2'-FL的化學(xué)合成［27］Fig.3 Chemical synthesis strategy for 2'-FL

3.2 全細(xì)胞合成

全細(xì)胞合成2'-FL 基于微生物自身（或模擬）的代謝機(jī)制合成GDP-巖藻糖和外源表達(dá)的α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（圖4），是目前工業(yè)上生產(chǎn)2'-FL的主要方法。α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶在細(xì)胞內(nèi)的功能性表達(dá)、GDP-巖藻糖在胞內(nèi)的積累、可轉(zhuǎn)移到胞內(nèi)并且可積累的乳糖（糖基受體）以及降低副產(chǎn)物對相關(guān)酶的抑制作用，都是全細(xì)胞合成2'-FL的關(guān)鍵因素［6，30］。

圖4 2'-FL的兩種生物合成途徑Fig.4 Two biosynthetic approaches of 2'-FL

α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是全細(xì)胞合成2'-FL 的關(guān)鍵酶。有研究對不同來源的α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶合成2'-FL 的能力進(jìn)行篩選，包括幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori，H. pylori）、雪貂螺桿菌（Helicobacter mustelae，H. mustelae）、膽型螺旋桿菌（Helicobacter bilis，H. bilis）、E. coliO128：Bl2、E.coliO86、E.coliO127、C.jejuni、脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis，B. fragilis）和普通擬桿菌（Bacteroides vulgatus，B. vulgatus） ATCC 8482 來源的α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，發(fā)現(xiàn)H.pylori α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（futC）合成2'-FL 的得率最高［31］。目前，多數(shù)報(bào)道以及工業(yè)上生產(chǎn)2'-FL 使用的α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶均為futC。因此，挖掘穩(wěn)定、易獲得且活性較高的α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是全細(xì)胞合成2'-FL要素之一。

全細(xì)胞合成2'-FL 的另一關(guān)鍵因素是提高胞內(nèi)GDP-巖藻糖的濃度。GDP-巖藻糖的生物合成途徑有兩種：從頭合成途徑（de novopathway）和補(bǔ)救合成途徑（salvage pathway）（圖4）。提高從頭合成途徑中GDP-巖藻糖水平的方法有：過表達(dá)將甘露糖1-磷酸轉(zhuǎn)化為果糖6-磷酸和GDP-巖藻糖的各種酶的相關(guān)基因（ManB、ManC、Gmd和WcaG），過表達(dá)rcsA（或rcsB）基因（E.coli中可樂酸操縱子的正向調(diào)控基因），敲除wcaJ基因（可樂酸合成相關(guān)基因）［32］，以及上調(diào)與還原型輔酶Ⅱ（NADPH）和NADP+之間比例相關(guān)的基因表達(dá)［33］。提高補(bǔ)救合成途徑中GDP-巖藻糖濃度的方法有：過表達(dá)E. coli中L-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)體基因（FucP）和B.fragilis巖藻糖激酶/巖藻糖-1-磷酸鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶基因［31］，敲除巖藻糖-1-磷酸醛縮酶（FucA）［34］、巖藻糖異構(gòu)酶（FucI）和巖藻糖激酶（FucK）等參與L-巖藻糖代謝的相關(guān)酶基因，以及過表達(dá)gsk、gpt、gmk和ndk等參與鳥苷三磷酸（GTP）生物合成的相關(guān)基因［33］。提高胞內(nèi)乳糖（受體）濃度的方法有敲除胞內(nèi)乳糖酶基因（lacZ-）以及對乳糖乙?；富颍╨acA）和lon基因進(jìn)行突變。

目前補(bǔ)救合成途徑是量產(chǎn)2'-FL 的最優(yōu)途徑，以L-巖藻糖為起始底物對菌體的代謝影響較低，但成本較高［35］。而從頭合成途徑中某些基因的過量表達(dá)會打破宿主的代謝平衡，影響菌體生長，限制GDP-巖 藻 糖 和2'-FL 產(chǎn)量的進(jìn)一步提高［36］。Drouillard 等［37］在E. coliJM107（lacZ-、lacY+、wcaJ-）中過表達(dá)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因（futC）和可樂酸操縱子正向調(diào)控基因（rcsA），以葡萄糖和乳糖為底物，分批補(bǔ)料發(fā)酵后2'-FL的產(chǎn)量達(dá)15 g/L（胞內(nèi)3 g/L，胞外11 g/L）。Merighi 等［38］在E.coliW3110（lacZ-、lacY+、lacA-、wcaJ-、lon-、thyA）中過表達(dá)futC、rcsA和胸苷酸合成酶基因（thyA），以甘油和乳糖為底物，以色氨酸為誘導(dǎo)劑，2'-FL的產(chǎn)量可達(dá)25 g/L。Baumg?rtner 等［34］在E. coliJM109（lacZ-、manB+、manC+、gmd+、wcaG+、futC+、fkp+、fucI-、fucK-）中過表達(dá)futC，以甘油、乳糖和巖藻糖為底物，通過分批補(bǔ)料發(fā)酵，2'-FL的產(chǎn)量可達(dá)20.3 g/L。Chin等［39］在E.coliBL21 star（DE3）（lacZ-、manB+、manC+、gmd+、wcaG+）中過表達(dá)futC，以甘油和乳糖為底物，通過分批補(bǔ)料發(fā)酵2'-FL 的產(chǎn)量可達(dá)6.4 g/L。該團(tuán)隊(duì)［33］在E.coliBL21 star（DE3）（lacZ-、fucI-、fucK-、lacY+、lacA+）中過表達(dá)futC和fkp，以甘油、巖藻糖和乳糖為底物，通過分批補(bǔ)料發(fā)酵，2'-FL 的產(chǎn)量可達(dá)23.1 g/L。在以上研究的基礎(chǔ)上，該團(tuán)隊(duì)［28］進(jìn)一步敲除阿拉伯糖異構(gòu)酶基因（AraA）和鼠李糖異構(gòu)酶基因（RhaA）來提高補(bǔ)救合成途徑中GDP-巖藻糖的含量，2'-FL的產(chǎn)量可達(dá)47 g/L。近年來，在更為安全的宿主菌中構(gòu)建2'-FL 的生物合成途徑成為研究熱點(diǎn)，如無抗生素E. coli，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，B. subtilis）、 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，S.cerevisiae）和耶氏解脂酵母（Yarrowia lipolytica，Y. lipolytica） 等。Deng 等［40］在B. subtilis（fucP+、yesZ-）中構(gòu)建了GDP-巖藻糖的補(bǔ)救合成途徑，進(jìn)一步表達(dá)了futC來合成2'-FL，以乳糖和巖藻糖為底物，2'-FL 的產(chǎn)量可達(dá)5.01 g/L。Hollands等［41］分別在S.cerevisiae和Y.lipolytica中構(gòu)建了GDP-巖藻糖的從頭合成途徑，進(jìn)一步表達(dá)了futC，以葡萄糖和乳糖為底物，2'-FL的產(chǎn)量分別為15 g/L和24 g/L。全細(xì)胞合成2'-FL的最高產(chǎn)量是Jennewein Glycosyn公司報(bào)道的180 g/L［4］。

全細(xì)胞合成2'-FL 發(fā)酵周期一般為數(shù)天，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)一系列處理來純化2'-FL，包括對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行離心、過濾（微濾、超濾、納濾）除去細(xì)胞和生物大分子，經(jīng)電滲析和離子交換柱除鹽和生物小分子，經(jīng)活性炭柱和合成吸附劑脫色，再經(jīng)柱色譜或結(jié)晶法純化2'-FL（除單糖、二糖及其他非HMOs成分），最后對2'-FL進(jìn)行噴霧干燥并對其成品進(jìn)行分析［4］。目前，F(xiàn)DA 和歐盟批準(zhǔn)了多家公司生物合成的2'-FL 可添加到嬰幼兒奶粉、膳食補(bǔ)充劑以及醫(yī)療食品中。

圖5 2'-FL的酶法合成策略Fig.5 Enzymatic synthesis strategies for 2'-FL using α-1,2-fucosyltransferase(a)α-L-fucosidase(b)or α-1,2-fucosynthase(c)

3.3 酶法合成

酶法合成寡糖的優(yōu)點(diǎn)是具有一定的立體選擇性（stereo-selectivity） 和 區(qū) 域 選 擇 性（regioselectivity）。寡糖合成中常用的兩類酶包括糖基轉(zhuǎn)移酶（Glycosyltransferases，EC 2.4）和糖苷水解酶（Glycosidases，EC 3.2.1）。糖基轉(zhuǎn)移酶（GTs）將一個(gè)單糖分子從核苷酸糖基供體轉(zhuǎn)移到受體上［42］。這類酶的主要缺點(diǎn)是穩(wěn)定性低、不易獲得，且需要使用昂貴的核苷酸糖基為供體。糖苷水解酶（GHs）一般用于催化糖苷鍵的水解反應(yīng)，在特定條件下也可以催化活化糖基供體的轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)來合成糖苷鍵。由于合成的產(chǎn)物會被進(jìn)一步水解，轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)產(chǎn)物的得率一般低于40%～50%［43］。

3.3.1α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶在2'-FL合成中的應(yīng)用

不同的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（fucosyltransferases，F(xiàn)UT）可專一性合成α-1，2、α-1，3、α-1，4 和α-1，6等糖苷鍵。α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶可催化GDP-巖藻糖和乳糖發(fā)生基團(tuán)置換，生成2'-FL 和鳥苷二磷酸（GDP）［圖5（a）］。由于價(jià)格昂貴，以GDP-巖藻糖為原料生產(chǎn)2'-FL受到限制。有研究以成本較低的GDP-D-甘露糖為起始底物經(jīng)三步酶法合成2'-FL。首先，利用Gmd酶（GDP-甘露糖4，6-脫水酶，Escherichia coliK-12）催化GDP-D-甘露糖合成GDP-4-酮-6-脫氧甘露糖；第二步，利用WcaG 酶（GDP-巖藻糖合成酶，Escherichia coliK-12）催化GDP-4-酮-6-脫氧甘露糖和NADPH 合成GDP-巖藻糖（得率為78%）；第三步，α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（FucT2，H.pylori）催化GDP-巖藻糖和乳糖合成2'-FL（得率為65%）［29］。提高巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的可溶性表達(dá)、提高巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶以乳糖為受體時(shí)的催化活性，有助于提高FL的得率。有研究通過密碼子優(yōu)化和對C 端進(jìn)行系統(tǒng)截短來提高H.pylori α-1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的可溶性表達(dá)，進(jìn)一步通過定向進(jìn)化技術(shù)來提高H.pylori α-1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶對乳糖的催化活性，獲得一個(gè)可高效合成3-FL的突變酶（提高15倍）［44］。Tan等［45］同樣使用定向進(jìn)化技術(shù)來提高H.pylori α-1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶對乳糖的催化效率，經(jīng)過3輪篩選，獲得一個(gè)可高效合成3-FL的突變酶（提高14倍）。這些對α-1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的改造方法，都可以為提高α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的可溶性表達(dá)和催化效率提供借鑒。另外，有研究篩選到一個(gè)新型Thermosynechococcus elongatusBP-1α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，該酶在以含β-1，3-半乳糖苷的人類血型H抗原為受體時(shí)表現(xiàn)出較高的催化活性，產(chǎn)物得率≥94%［46］。因此，挖掘新型、可催化乳糖巖藻糖基化的α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶也是提高巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的方法之一。

3.3.2α-L-巖藻糖苷酶在2'-FL合成中的應(yīng)用

α-L-巖藻糖苷酶（EC 3.2.1.51）是一類外切糖苷水解酶，能特異性水解巖藻糖基寡糖或其他巖藻糖基化合物上連接的巖藻糖［47］。α-L-巖藻糖苷酶廣泛存在于動物、植物和微生物中，其中報(bào)道最多的是微生物來源的α-L-巖藻糖苷酶，如來源于擬桿菌（Bacteroidessp.）、芽孢桿菌（Paenibacillussp.）、坦納菌（Tannerellasp.）、黃單胞菌（Xanthomonassp.）、熱袍菌（Thermotoga sp.）、雙歧桿菌（Bifidobacteriumsp.）和乳酸菌（Lactobacillussp.）等的巖藻糖苷酶［47-48］。目前，巖藻糖苷酶主要分為4 個(gè)家族，分別是糖苷水解酶（GH）29、95、141和151 家族。根據(jù)反應(yīng)機(jī)制，α-L-巖藻糖苷酶可分為保留型和反轉(zhuǎn)型，僅保留型GH29和GH151家族的巖藻糖苷酶具有潛在的轉(zhuǎn)糖苷活性［47］。當(dāng)前，許多研究利用GH29 家族的α-L-巖藻糖苷酶的轉(zhuǎn)糖苷活性來合成FL［圖5（b）］。研究表明，產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenessp.）α-L-巖藻糖苷酶可催化4-對硝基苯-α-L-巖藻糖苷（pNP-FUC）和乳糖合成3'-FL，得率為34%［7］；海棲熱袍菌（Thermotoga maritima，T.maritima）α-L-巖藻糖苷酶可催化pNP-FUC和乳糖合成FL，得率為32.5%［49］；禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum，F(xiàn).graminearum）α-L-巖藻糖苷酶能以木葡聚糖（XyG）和乳糖為底物，合成2'-FL，得率為14%［50］。另外，土壤宏基因組來源的α-L-巖藻糖苷酶能以pNP-FUC 和乳糖為底物獲得FL，得率為6%［51］。然而這些酶的轉(zhuǎn)糖苷效率較低，無法應(yīng)用于FL 的大規(guī)模合成。因此，發(fā)掘具有高轉(zhuǎn)糖苷活性、有較好立體選擇性及區(qū)域選擇性的α-L-巖藻糖苷酶具有重要意義。

目前，隨著酶工程技術(shù)的發(fā)展，一些沒有轉(zhuǎn)糖苷活性的酶可被改造成高效的轉(zhuǎn)糖苷酶，如糖苷合成酶（glycosynthase）［52］。巖藻糖苷合成酶（fucosynthase）是對反轉(zhuǎn)型巖藻糖苷酶進(jìn)行突變后獲得的缺失了催化親核殘基的突變酶，這類酶可將巖藻糖殘基從一個(gè)有相反異頭構(gòu)型的活化供體上（如氟代巖藻糖，F(xiàn)ucF）轉(zhuǎn)移到受體上，由于合成產(chǎn)物不被水解，產(chǎn)物得率較高［圖5（c）］。B. bifidum α-1，2-L-巖藻糖苷酶（AfcA）是一個(gè)GH95 家族的反轉(zhuǎn)型巖藻糖苷酶，該酶可特異性水解α-1，2-L-巖藻糖苷鍵。Wada 等［53］對AfcA 的某些氨基酸進(jìn)行突變后獲得一個(gè)具有轉(zhuǎn)糖苷活性的突變酶（D766G），該酶可催化FucF（10 mmol/L）和乳糖（30 mmol/L）合成2'-FL，得率為6%。該團(tuán)隊(duì)［54］繼續(xù)對該酶進(jìn)行組合突變，獲得一個(gè)具有更高轉(zhuǎn)糖苷活性的突變酶D766G，該酶可以催化FucF（10 mmol/L）和乳糖（30 mmol/L）合成2'-FL，得率為88%。

另一種提高轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物得率的方法是打破保留型糖苷水解酶轉(zhuǎn)糖苷和水解反應(yīng)之間的平衡（轉(zhuǎn)糖苷/水解比例），使反應(yīng)朝著產(chǎn)物累積的方向進(jìn)行。該方法基于酶的定向進(jìn)化或理性設(shè)計(jì)，目的是得到一個(gè)對產(chǎn)物的水解能力降低、但與受體結(jié)合能力增強(qiáng)的突變酶。有研究通過定向進(jìn)化技術(shù)對T.maritima α-L-巖藻糖苷酶（TmRfuc）進(jìn)行隨機(jī)突變和篩選，獲得一個(gè)轉(zhuǎn)糖苷活性從7%提高至60%的突變酶［55］。該團(tuán)隊(duì)［56］進(jìn)一步對B.longum α-1，3/4-L-巖藻糖苷酶（BiAfcB）進(jìn)行半理性設(shè)計(jì)，得到轉(zhuǎn)糖苷活性提高的突變酶，該酶能夠以3-FL 為糖基供體，以LNT 為受體，合成LNFP Ⅱ，得率由12%升高到32%。

酶法合成2'-FL 反應(yīng)條件溫和可控，產(chǎn)物達(dá)到最高濃度時(shí)間短（≤24 h），反應(yīng)體系中成分相對簡單、易于純化，如Albermann 等酶法合成2'-FL 的反應(yīng)產(chǎn)物先經(jīng)陰陽離子交換柱除鹽，再經(jīng)Sephadex G-10 凝膠柱一步純化可得到純度較高的2'-FL。由于缺乏成本較低、天然安全、可大量供應(yīng)的糖基供體，目前酶法合成2'-FL 僅限于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模（毫克級）［29］。使用α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶合成2'-FL 需要昂貴的核苷酸糖基為供體。使用α-L-巖藻糖苷酶合成2'-FL 多數(shù)采用pNP-FUC 作為糖基供體，該底物的缺點(diǎn)是反應(yīng)產(chǎn)物中含有對硝基苯酚（pNP），不適用于食品領(lǐng)域，且成本也較高。因此，開發(fā)天然、經(jīng)濟(jì)的巖藻糖基供體是酶法用于2'-FL大規(guī)模合成的關(guān)鍵。目前潛在可用的天然巖藻糖基供體有兩種，第一種是木葡聚糖（xyloglucan，XyG），另外一種是巖藻多糖。木葡聚糖廣泛存在于雙子葉植物的細(xì)胞壁中，一部分木葡聚糖的側(cè)鏈上含有L-Fuc-α-1，2-Gal糖苷鍵［圖6（a）］，可作為一些α-L-巖藻糖苷酶的底物［57］。一些研究報(bào)道了可利用XyG 作為糖基供體來合成FL 的α-L-巖藻糖苷酶，如來源于F. graminearum、福賽斯坦納菌（Tannerella forsythia，T. forsythia）和土壤宏基因組的α-L-巖藻糖苷酶，然而這些酶的轉(zhuǎn)糖苷活性普遍較低。因此，繼續(xù)挖掘能夠以XyG 作為底物且轉(zhuǎn)糖苷活性較高的α-L-巖藻糖苷酶是關(guān)鍵。另外，L-巖藻糖還大量存在于海藻和棘皮動物的巖藻多糖中，巖藻多糖主要由L-巖藻糖和硫酸酯基團(tuán)組成，還含有少量半乳糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖和蛋白質(zhì)。海藻中水云目（Ectocarpales）和昆布目（Laminariales）產(chǎn)生的巖藻多糖主鏈由L-巖藻糖以α-1，3-糖苷鍵連接而成［圖6（b）］，而墨角藻目產(chǎn)生的巖藻多糖主鏈由L-巖藻糖以α-1，3-糖苷鍵和α-1，4-糖苷鍵交替連接而成［圖6（b）］［58］。Berteau 等［59］報(bào)道了來源于歐洲扇貝（Pecten maximus） 的α-L-巖藻糖苷酶可水解泡葉藻（Ascophyllum nodosum）巖藻多糖和2'-FL，后來又證實(shí)該巖藻糖苷酶具有轉(zhuǎn)糖苷活性［60］。這類可同時(shí)水解巖藻多糖和2'-FL 的α-L-巖藻糖苷酶即為可利用巖藻多糖為底物合成2'-FL 的潛在酶。另外，將巖藻多糖作為合成2'-FL 或3-FL 的天然底物還要逐步解決以下問題：第一，所選巖藻多糖硫酸基團(tuán)含量盡量低，或使用硫酸酯酶（Sulfatase）先將巖藻多糖側(cè)鏈的硫酸基團(tuán)水解；第二，使用巖藻聚糖硫酸酯酶（Fucoidanase）將巖藻多糖水解成低分子量的巖藻寡糖，以增加巖藻寡糖的溶解性和酶與巖藻寡糖的接觸；第三，利用生物信息學(xué)分析工具根據(jù)目前報(bào)道的有類似性質(zhì)的巖藻糖苷酶的基因序列，在基因庫中篩選能夠以巖藻寡糖為底物來合成2'-FL 的新型α-L-巖藻糖苷酶。

圖6 巖藻糖基木葡聚糖和兩種典型巖藻多糖的結(jié)構(gòu)Fig.6 Structures of fucogalactoxyloglucan and two types of fucoidans

4 結(jié)語與展望

目前，2'-FL 可通過化學(xué)合成、全細(xì)胞合成和酶法合成來進(jìn)行生產(chǎn)。化學(xué)法合成2'-FL 過程煩瑣、耗時(shí)長、得率低且成本較高，在工業(yè)生產(chǎn)中受到限制?；瘜W(xué)合成的2'-FL 在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用也受到質(zhì)疑。全細(xì)胞合成2'-FL 面臨的問題也是成本相對較高。降低L-巖藻糖的成本、維持宿主胞內(nèi)GDP-巖藻糖水平與菌體代謝之間的平衡以及發(fā)掘新型高活性α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是關(guān)鍵。在更為安全的宿主中構(gòu)建2'-FL 合成途徑并提高產(chǎn)量是全細(xì)胞合成2'-FL 的發(fā)展方向。

酶法合成2'-FL 反應(yīng)條件溫和可控、反應(yīng)時(shí)間短、產(chǎn)物易于純化，具有較好的發(fā)展前景。降低GDP-巖藻糖的成本是將α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶應(yīng)用于2'-FL 生產(chǎn)的關(guān)鍵。近年來，一部分具有轉(zhuǎn)糖苷活性的α-L-巖藻糖苷酶成功應(yīng)用于2'-FL 的合成。發(fā)掘新型、天然、經(jīng)濟(jì)的巖藻糖基底物（如木葡聚糖和巖藻多糖）以及高效轉(zhuǎn)糖苷酶有助于α-L-巖藻糖苷酶在2'-FL 合成中的應(yīng)用。在不久的將來，酶法合成有望成為工業(yè)上生產(chǎn)2'-FL 的方法。

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