白頭翁湯有效成分提取工藝和含量測(cè)定

吳柯楠 唐志書(shū) 梁艷妮 吉帆 于金高 張珍 張東博 王征

摘要 [目的]優(yōu)選白頭翁湯提取工藝。[方法]以浸膏得率、秦皮甲素、秦皮乙素、黃柏堿、秦皮素、鹽酸小檗堿和白頭翁皂苷B4含量為考察指標(biāo)，以提取溶劑、料液比、提取時(shí)間為考察因素，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝，運(yùn)用HPLC法對(duì)白頭翁湯中提取成分（秦皮甲素、秦皮乙素、黃柏堿、秦皮素、鹽酸小檗堿和白頭翁皂苷B4）進(jìn)行含量測(cè)定，并進(jìn)行綜合評(píng)分。[結(jié)果]最佳提取工藝為8倍60%乙醇為溶劑，提取3 h。[結(jié)論]優(yōu)選的提取工藝合理、可行。

關(guān)鍵詞 白頭翁湯;正交試驗(yàn);有效成分;提取工藝;含量測(cè)定

中圖分類(lèi)號(hào) R284? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2020）20-0184-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.20.049

Extraction Process and Content Determination of Active Components in Pulsatilla Decoction

WU Ke-nan 1，2，TANG Zhi-shu 1，2，LIANG Yan-ni 1，2 et al （1.Shaanxi Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization，Xianyang，Shaanxi 712083;2.State Key Laboratory of Research and Development on Characteristic Resources of Qin Medicine Jointly Built by the Ministry and the Province （Cultivation），Xianyang，Shaanxi 712083）

Abstract [Objective]To optimize the extraction technology of pulsatilla.[Method]The extraction technology of pulsatilla decoction was optimized by single factor experiment and orthogonal design with the concentration of alcohol，the amount of solvent， the extraction time as factors，taking extractum yield， the contents of aesculin， aesculetin， phellodendron， quercetin， berberine hydrochloride and pulchinenoside B4 as indicators.The content of extracts from pulsatilla chinensis （aesculin， aesculetin， phellodendron， fraxetin， berberine hydrochloride and pulchinenoside B4） was determined by HPLC. The quality of the pulsatilla soup was evaluated.[Result]The optimal extraction process was as follows：adding 8 times amount of 60% alcohol and extracting for 3 hours.[Conclusion]The optimal extraction technology is reasonable and practical.

Key words Pulsatillae decoction;Orthogonal test;Active ingredient;Extraction process;Content determination

白頭翁湯始載于《傷寒論·厥陰篇》，是中醫(yī)臨床常用的經(jīng)典方劑，主要用于治療熱痢下重者。由白頭翁、黃柏、黃連和秦皮4味中藥組成 [1]。方中白頭翁為君藥，歸大腸與肝經(jīng)，味苦性寒 [2]，具有清熱解毒、涼血止痢的功效。臣以黃連之苦寒，清熱解毒，燥濕厚腸;黃柏瀉下焦?jié)駸?，與黃連共助君藥清熱解毒之效，尤能燥濕止痢。秦皮歸大腸經(jīng)，苦寒性澀，主熱痢下重。以上四藥合用，共奏清熱解毒、涼血止痢之功效 [3]。

在中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)脾胃病分會(huì)發(fā)布的“潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)診療專(zhuān)家共識(shí)意見(jiàn)（2017）”中，明確將潰瘍性結(jié)腸炎歸屬于中醫(yī)“久痢”的范疇 [4]。同時(shí)，在辨證論治中明確白頭翁湯是熱毒熾盛證的主要方劑。由此可見(jiàn)白頭翁湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎具有顯著的治療作用 [5]。現(xiàn)代藥理作用研究表明，白頭翁湯具有顯著的抗炎作用，且與抑制cAMP-PDE的活性、升高cAMP含量密切相關(guān) [6]。同時(shí)研究表明，白頭翁湯對(duì)陰道念珠菌 [7]、白色念珠菌、傷寒沙門(mén)氏菌 [8]、金黃色葡萄球菌等均有一定的抑制作用 [9]。白頭翁湯中含有多種化學(xué)成分，包括生物堿類(lèi)、檸檬苦素類(lèi)、香豆素類(lèi)、皂苷類(lèi)、木脂素類(lèi)等化學(xué)成分 [10]。筆者將進(jìn)一步對(duì)白頭翁湯有效成分最優(yōu)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并建立HPLC同時(shí)檢測(cè)其中不同化學(xué)成分含量的方法，為白頭翁湯進(jìn)一步的研究提供支撐 [11]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材。白頭翁（生產(chǎn)批號(hào)20180801）、黃連（生產(chǎn)批號(hào)20170401）、黃柏（生產(chǎn)批號(hào)20181001）、秦皮（生產(chǎn)批號(hào)20181201），以上藥材均購(gòu)自陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心李鉑老師鑒定為正品藥材。秦皮甲素（生產(chǎn)批號(hào)17072801）、秦皮素（生產(chǎn)批號(hào)17041703）、黃柏堿（生產(chǎn)批號(hào)18110801），以上3種對(duì)照品均購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司;秦皮乙素（生產(chǎn)批號(hào)wkq18050209）、白頭翁皂苷B4（生產(chǎn)批號(hào)wkq19013009）、鹽酸小檗堿（生產(chǎn)批號(hào)wkq19013111），以上3種對(duì)照品均購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器。超高效液相色譜儀（島津LC-20ADXR），F(xiàn)W-1000AD型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，F(xiàn)A2004B型電子天平，101型電熱鼓風(fēng)干燥箱，MH-1000型可調(diào)式電熱套，KQ-300DE型超聲波清洗器，超純水儀。

1.1.3 主要試劑。色譜甲醇、色譜乙腈，均購(gòu)自賽默飛世爾科技公司;色譜磷酸，購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 方法

1.2.1 單因素試驗(yàn)。每組試驗(yàn)稱(chēng)取處方量的1/10，放置電熱套上回流提取。分別選取提取溶劑、提取時(shí)間、料液比3個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn) [12-13]，以浸膏得率為初步評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，確定各因素范圍。

1.2.2 正交試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別選取提取溶劑60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇和純水，溶劑用量7倍、8倍、9倍和10倍，提取時(shí)間1、2、3、4 h，以浸膏得率和活性成分秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、鹽酸小檗堿、黃柏堿和白頭翁皂苷B4含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行3因素4水平L 16（43）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) [14-15]，考察提取時(shí)間、提取溶劑和料液比對(duì)上述指標(biāo)的影響。

1.2.3 對(duì)照品溶液的制備。精密稱(chēng)取秦皮甲素、秦皮乙素、黃柏堿、秦皮素、鹽酸小檗堿2 mg，精確量取10 mL甲醇-水溶液（1∶1），配制成濃度為0.2 mg/mL的溶液;精密稱(chēng)取白頭翁皂苷B4 2 mg，精確量取2 mL甲醇-水溶液（1∶1），配制成濃度為1 mg/mL的溶液。將以上配制溶液超聲10 min，分別用0.22 μm微孔膜過(guò)濾，備用。

1.2.4 供試品溶液的制備。精密稱(chēng)取正交試驗(yàn)所得16組樣品各10 mg，精確量取10 mL甲醇-水溶液（1∶1），分別配制成濃度為1 mg/mL的溶液，超聲10 min，用0.22 μm微孔膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，備用。

1.2.5 色譜分析條件。采用Accucore C 18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）色譜柱，在柱溫30 ℃下以乙腈-0.5%磷酸為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，每次進(jìn)樣量3 μL，流速0.4 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。梯度洗脫（0～5 min，4%乙腈;6～15 min，10%乙腈;16～28 min，30%乙腈;29～32 min，95%乙腈;33 min，5%乙腈） [3，16]。

1.2.6 方法學(xué)考察。

1.2.6.1 線(xiàn)性關(guān)系的考察。將秦皮甲素、秦皮乙素、黃柏堿、秦皮素、鹽酸小檗堿和白頭翁皂苷B4分別配制成2.67、5.30、11.00、13.30、26.70、40.00、53.00、66.70、80.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。分別吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以進(jìn)樣濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算線(xiàn)性回歸方程。

1.2.6.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一供試樣品溶液，按“1.2.5”色譜分析條件分別于1、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL，測(cè)定峰面積積分值，計(jì)算RSD。

1.2.6.3 精密度試驗(yàn)。取按“1.2.3”方法制備的對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積的RSD值。

1.2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn)。取樣品按“1.2.4”方法制備供試品溶液6份，按“1.2.5”色譜分析條件，進(jìn)樣量為10 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算平均含量和RSD。

1.2.7 樣品含量測(cè)定。按“1.2.4”方法精密稱(chēng)取白頭翁湯藥材粉末配制成供試品溶液各2份，按“1.2.6.1”方法對(duì)樣品進(jìn)行含量測(cè)定，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算白頭翁湯中各成分的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

在提取時(shí)間1 h、料液比1∶6的條件下，考察不同提取溶劑（純水、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇和100%乙醇）對(duì)浸膏得率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖1a），浸膏得率分別為16.28%、16.32%、16.77%、7.97%、6.43%，可見(jiàn)隨著提取溶劑中乙醇含量的增加，浸膏得率不斷降低。

在提取時(shí)間1 h、純水作為提取溶劑條件下，考察不同料液比（1∶6、1∶7、1∶8、1∶9和1∶10）對(duì)浸膏得率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖1b），浸膏得率分別為15.50%、13.52%、16.48%、16.74%和18.24%，可見(jiàn)隨著料液比的不斷增加，浸膏得率不斷升高。

在純水作為提取溶劑、料液比1∶6的條件下，考察不同提取時(shí)間（1、2、3、4和5 h）對(duì)浸膏得率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖1c），浸膏得率分別為17.26%、18.24%、18.37%、16.48%和 18.24%，可見(jiàn)隨著提取時(shí)間的增加，浸膏得率基本趨于穩(wěn)定。

2.2 正交試驗(yàn) 按照L 16（43）正交設(shè)計(jì)表?xiàng)l件進(jìn)行試驗(yàn)，分別測(cè)得秦皮甲素、秦皮乙素、黃柏堿、秦皮素、鹽酸小檗堿、白頭翁皂苷B4含量以及得膏率，并進(jìn)行多指標(biāo)綜合評(píng)分 [17]。評(píng)分時(shí)以各指標(biāo)最大值為參照將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，根據(jù)原方中各藥劑量再給出不同的權(quán)重。白頭翁為一方之君，權(quán)重系數(shù)為0.4;黃連和黃柏中均有鹽酸小檗堿，鹽酸小檗堿含量表明了兩味藥的提取效果，權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.2;黃柏堿為黃柏有效成分，權(quán)重系數(shù)0.1;秦皮素、秦皮甲素和秦皮乙素代表秦皮活性成分，其權(quán)重系數(shù)分別設(shè)為0.05、0.05和0.10;浸出物

代表提取效果，浸出物越多說(shuō)明提取效率越高，因此設(shè)浸出物得膏率的權(quán)重系數(shù)為0.1。

綜合評(píng)分：M=0.4a×100/4.63+0.2b×100/2.36+0.2c×100/3.53+0.05d×100/11.58+0.05e×100/2.31+ 0.1f×100/17.31+ 0.1q×100/17.84，式中，a為白頭翁皂苷B4含量，b為鹽酸小檗堿含量，c為黃柏堿含量，d為秦皮甲素含量，e為秦皮素含量，f為秦皮乙素含量，q為得膏率。以綜合值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

皂苷B4、鹽酸小檗堿、黃柏堿、秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素的含量，并根據(jù)原方中各藥用量進(jìn)行加權(quán)計(jì)算。通過(guò)正交試驗(yàn)得出，提取溶劑對(duì)綜合評(píng)分影響最為顯著，料液比和提取時(shí)間影響較小，通過(guò)方差分析得出影響次序是提取溶劑>料液比>提取時(shí)間。綜合考慮最佳工藝為A1B2C3，即以8倍60%乙醇為溶劑，提取3 h效果最佳。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線(xiàn)性關(guān)系的考察。按照“1.2.6.1”方法操作，以進(jìn)樣濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算得線(xiàn)性回歸方程、決定系數(shù)（R2）和線(xiàn)性范圍如表2所示。

從表2可以看出，各標(biāo)品在所選濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。所測(cè)定對(duì)照品保留時(shí)間分別為秦皮甲素4.36 min、鹽酸小檗堿6.33 min、秦皮素11.20 min、黃柏堿11.68 min、秦皮乙素23.74 min、白頭翁皂苷B4 27.04 min且分離度都大于1.5，分離良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)。按照“1.2.6.2”方法操作，計(jì)算得出秦皮甲素、鹽酸小檗堿、秦皮素、黃柏堿、秦皮乙素、白頭翁皂苷B4峰面積積分值的RSD分別為0.29%、1.58%、0.63%、 0.10%、0.65%、0.10%，表明上述藥材在12 h內(nèi)比較穩(wěn)定。

2.3.3 精密度試驗(yàn)。按照“1.2.6.3”方法操作，計(jì)算得出秦皮甲素、鹽酸小檗堿、秦皮素、黃柏堿、秦皮乙素、白頭翁皂苷B4峰面積的RSD分別為0.12%、0.77%、0.43%、0.20%、 0.66%、0.20%，表明在此試驗(yàn)條件下精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)。按照“1.2.6.4”方法操作，計(jì)算得出秦皮甲素、鹽酸小檗堿、秦皮素、黃柏堿、秦皮乙素、白頭翁皂苷B4峰面積的RSD分別為6.54%、4.40%、5.92%、5.70%、 4.31%、8.75%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 樣品含量測(cè)定 取樣品按“1.2.4”方法制備供試品溶液6份，根據(jù)“1.2.5”色譜條件每份測(cè)定3次，計(jì)算得出白頭翁湯各成分秦皮甲素、秦皮乙素、鹽酸小檗堿、秦皮素、黃柏堿、白頭翁皂苷B4的含量分別為0.68%、0.31%、7.95%、0.49%、0.15%、4.15%。

3 結(jié)論與討論

白頭翁湯組方藥物：白頭翁、黃連、黃柏、秦皮，以上四藥合用，共奏清熱解毒、涼血止痢之功效，均有含量測(cè)定的指標(biāo)性物質(zhì)。在中藥復(fù)方研究過(guò)程中，用一個(gè)指標(biāo)不能全面概括其總體的效用。故此次試驗(yàn)選用白頭翁皂苷B4含量、鹽酸小檗堿含量、秦皮甲素含量、秦皮素含量、秦皮乙素含量、黃柏堿含量和得膏率為指標(biāo)，概括了白頭翁湯主要活性成分的指標(biāo)，這與中藥復(fù)方的多組分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)相吻合。該研究在處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)時(shí)，使用了綜合評(píng)分的方法，排除了以單一指標(biāo)作為質(zhì)量控制的局限性。以綜合指標(biāo)控制和評(píng)價(jià)中藥制劑質(zhì)量，是保證制劑和藥效統(tǒng)一的更合理方法。采用RP-HPLC法測(cè)定含量，簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確。

此次試驗(yàn)考察了提取溶劑、提取時(shí)間、料液比等湯劑提取的3個(gè)關(guān)鍵因素。 考慮指標(biāo)間關(guān)系，結(jié)合了該方的君、臣、佐、使配伍和指標(biāo)物質(zhì)代表的藥物等關(guān)系，給出不同的權(quán)重。綜合分析得到最佳提取工藝組合為A1B2C3，即以8倍60%乙醇為溶劑，提取3 h效果最佳。該研究采用高效液相色譜法測(cè)定了白頭翁湯有效成分的含量，試驗(yàn)結(jié)果表明，該含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、靈敏、重現(xiàn)性好，可推廣使用。

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