日糧中添加沙棘果渣對(duì)肉羊肌內(nèi)脂肪沉積及其關(guān)鍵基因和酶活力的影響

鄧步皓，秦旭澤，張 婷，張建新，趙俊星

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，太谷 030801）

沙棘（Hippophae rhamnoidesL.）是廣泛分布于大西洋沿岸、蒙古以及我國(guó)西北部的落葉灌木，擁有較好的藥用價(jià)值和相關(guān)疾病的治療潛力［1］。由于含有酚類、黃酮類、維生素、礦物質(zhì)、氨基酸、脂肪酸和植物甾醇等生物活性物質(zhì)，沙棘汁、沙棘果醬和沙棘油等均擁有很好的消炎、抗癌、抗氧化和抗動(dòng)脈粥樣硬化等生物學(xué)功能［2］。沙棘果渣（sea buckthorn pomace，SBP）是沙棘汁飲料生產(chǎn)中產(chǎn)生的副產(chǎn)品，含有濃度較大的多種天然生物活性化合物［3］。Kaushal等［4］的研究結(jié)果證實(shí)，沙棘果實(shí)和種子等均被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中。育肥豬日糧中添加SBP有效提高了動(dòng)物的生長(zhǎng)性能、肉品質(zhì)，影響了肌肉中脂肪酸的分布［5］。肉雞日糧中添加沙棘黃酮可影響脂質(zhì)代謝，提高生長(zhǎng)性能和改善脂肪沉積［6］。蛋雞攝入SBP后提高了產(chǎn)蛋量，改善了蛋黃顏色［7］。這些研究表明了SBP具有改善家畜的生理功能及生產(chǎn)性能的作用。

肌內(nèi)脂肪（intramuscular fat，IMF）是影響肉品質(zhì)和風(fēng)味兒的關(guān)鍵因素之一，其含量受到了遺傳、營(yíng)養(yǎng)與飼養(yǎng)管理等諸多因素的影響［8］?，F(xiàn)已證實(shí)，肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的分化能力主要受過(guò)氧化物酶增殖激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋α（CCAAT-enhancer-binding protein alpha，C/EBPα）、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β（CCAAT-enhancer-binding protein beta，C/EBPβ）、脂肪酸結(jié)合蛋白4（fatty acid binding protein 4，F(xiàn)ABP4）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（sterol regulatory element-binding protein 1，SREBP1）、鋅指蛋白423（zinc finger protein 423，ZNF423）等關(guān)鍵相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控［9］。同時(shí)，脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，F(xiàn)AS）、乙酰輔酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）、蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）、激素敏感脂肪酶（hormone-sensitive triglayceride lipase，HSL）和脂蛋白脂酶（lipoprteinlipase，LPL）等脂肪酸合成與降解相關(guān)酶的活性也與 IMF含量相關(guān)［10］。

集約化肉羊生產(chǎn)方式下提高瘦肉率和飼料轉(zhuǎn)化率的措施可能導(dǎo)致肉羊肌內(nèi)脂肪沉積能力下降，肉品質(zhì)降低［11］。因此，在不影響肉羊生長(zhǎng)速度的前提下，適當(dāng)提高IMF含量是當(dāng)前肉羊生產(chǎn)過(guò)程中亟待解決的問(wèn)題之一。鑒于沙棘活性物質(zhì)與脂質(zhì)代謝的關(guān)系［12］，日糧中添加SBP可能影響肉羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化及脂質(zhì)代謝。本試驗(yàn)旨在研究日糧中添加不同比例的SBP對(duì)肉羊IMF沉積的影響及其作用機(jī)制，為合理利用SBP提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及動(dòng)物飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)。隨機(jī)選取4月齡、體重相近（22.2±0.9）kg的杜泊（♂）×小尾寒羊（♀）雜交公羊30只，平均分為3組，單欄飼養(yǎng)。試驗(yàn)開(kāi)始前，受試動(dòng)物按體重0.2 mg/kg的劑量注射伊維菌素，消除寄生蟲(chóng)。試驗(yàn)各組肉羊分別飼喂含不同水平SBP的飼料：0%SBP（對(duì)照組）、7.8%SBP（7.8SBP組）和16.0%SBP（16SBP組）。預(yù)試期10 d，正式試驗(yàn)70 d，每天08:00和16:00進(jìn)行飼喂，自由采食和飲水。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，取背最長(zhǎng)?。╨ongissimus muscle，LD）樣品，分別置于4℃冰箱、多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）及液氮中保存。試驗(yàn)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)參考文獻(xiàn)［13］。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 剪切力測(cè)定

取厚度約2.54 cm的LD樣品，放置于沸水浴中處理，當(dāng)樣品中心溫度達(dá)到70℃時(shí)立即取出樣品冷卻至室溫，并于1℃條件下保存24 h。之后，使用鉆孔機(jī)取上述6塊圓柱形樣品（直徑為1.27 cm），剪切力測(cè)定儀（Mecmesin，West Sussex，英國(guó)）測(cè)定Warner-Bratzler剪切力（Warner-Bratzler shear force，WBSF）。

1.2.2 IMF 含量測(cè)定

采用索氏提取法測(cè)定LD中IMF含量［14］。將LD真空冷凍干燥至恒重，在索氏提取器中利用乙醚進(jìn)行粗脂肪分離。8 h后，將樣品取出、真空干燥并重新稱重。IMF含量由以下公式計(jì)算：

IMF%=［干燥前重量（g）-干燥后重量（g）］/［干燥前重量（g）］×100% 。

1.2.3 馬森（Masson）三色染色

經(jīng)4%的PFA（pH7.4）固定的LD樣品用于Masson三色染色分析。固定后的樣品連續(xù)經(jīng)過(guò)酒精脫水（70% 酒精，30 min ；80% 酒精，30 min ；95% 酒精，30 min，3次；100% 酒精，30 min，3次）、二甲苯透明（20 min，3次）、石蠟浸蠟（2 h，3次）后包埋，并用切片機(jī)（Leica RM 2265，德國(guó)）進(jìn)行石蠟切片。樣品（7μm）經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精復(fù)水后進(jìn)行三色染色。樣品置于顯微鏡下拍照（Leica DMi8，德國(guó)），其中每一樣品均隨機(jī)選取10個(gè)視野。

1.2.4 RNA提取和real time qPCR分析

LD樣品中的總RNA依據(jù)Trizol試劑（Sigma，Saint Louis，MO，美國(guó)）說(shuō)明提取，總RNA濃度和完整性由 NanoDrop（NanoDrop Instruments，Delaware，美國(guó)）和瓊脂糖凝膠電泳共同確定。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA Co.，Ltd.Dalian，中國(guó)）合成cDNA，CFX RT-PCR檢測(cè)系統(tǒng)（Bio-Rad，Hercules，California，美國(guó)）進(jìn)行real time qPCR分析。PCR循環(huán)參數(shù)如下：95℃，20 s；55℃，20 s；72℃，20 s，36個(gè)循環(huán)。引物序列見(jiàn)表1。擴(kuò)增完成后，通過(guò)熔解曲線對(duì)產(chǎn)物純度進(jìn)行確認(rèn)，PRL13作為內(nèi)參基因。采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.1.2 儀器。U3000高效液相色譜儀(配置DAD檢測(cè)器，美國(guó)戴安公司)；MS205DU電子分析天平(瑞士METTLERROLEDD公司)；EXceed-AC-24超純水機(jī)(成都康寧實(shí)驗(yàn)專用純水設(shè)備)；GT SONIC-P3超聲波清洗儀(固特超聲股份有限公司)。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）分析

取100 mg LD樣品，溶解于500μL預(yù)冷裂解液中勻漿后，4℃14 000 r/min離心15 min。裂解液成分如下：20 mmol/L 三（羥甲基）氨基甲烷（Tris-HCl）（pH 7.4），2% 十二烷基苯磺酸鈉（SDS），1% 聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100），5.0 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA），5.0 mmol/L 乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA），1 mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT），100 mmol/L 氟化鈉（NaF），2 mmol/L 偏釩酸鈉（NaVO3），0.5 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）。取上清液，并與等體積的上樣緩沖液（150 mmol/L Tris-HCl，20% 甘油，2 mmol/L的2-巰基乙醇，0.004%的溴酚藍(lán)）混合后煮沸備用。制備好的蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulhtate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）（BIO-RAD，美國(guó)）、NC 膜轉(zhuǎn)膜（BIO-RAD，美國(guó)）、封閉（脫脂奶粉）后加入相應(yīng)的一抗與二抗。蛋白定量使用Odyssey遠(yuǎn)紅外掃描系統(tǒng)（LI-COR Biosciences，Lincoln，NE，美國(guó)）完成。其中β-tubulin表達(dá)量作為內(nèi)參蛋白。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences for real-time qPCR

本研究所用抗體信息如下：FABP4（bs-4059R），SREBP1（bs-1402R），CCAAT/enhancer-binding protein α（C/EBPα，bs-1630R），CCAAT/enhancer-binding protein β（C/EBPβ，bs-1396R），peroxisome proliferator-activated receptor γ（PPARγ，bs-4590R），β-tubulin（bsm-33034M）購(gòu)于中國(guó)博奧森公司；ACC（#3662）購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling公司；山羊抗小鼠二抗（goat antimouse secondary antibody，926-68070）與山羊抗兔二抗goat anti-rabbit secondary antibody，926-32211）均購(gòu)于美國(guó)LI-COR公司。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）分析

將500 mg LD樣品加入4.5 mL pH為7.4的預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）中，并在冰上進(jìn)行勻漿，4℃、2 500 r/min離心20 min后取上清，用于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）分析。試驗(yàn)所用試劑盒信息如下：FAS（ml03668）、ACC（ml036689）、MDH（ml036689）、LPL（ml025647）、HSL（ml036706）均購(gòu)于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)中，組內(nèi)每只肉羊均作為一個(gè)試驗(yàn)單位，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Graphpad Prism 7統(tǒng)計(jì)軟件（Monrovia，CA，USA）進(jìn)行單因素方差分析，Duncan法進(jìn)行多重分析。P＜0.05則認(rèn)為是差異顯著，P＜0.01則認(rèn)為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 日糧中添加SBP對(duì)肉羊LD剪切力的影響

剪切力是反應(yīng)羊肉嫩度的重要指標(biāo)。如圖1所示，與對(duì)照組相比，肉羊日糧中添加7.8%SBP和16%SBP均可以極顯著降低LD中WBSF（P＜0.01）。

圖1 日糧中添加SBP對(duì)肉羊LD中WBSF的影響Fig.1 The effects of different dietary SBP level on WBSF in LD muscle in lambs

2.2 日糧中添加SBP對(duì)LD中IMF的影響

2.3 日糧中添加SBP對(duì)脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響

如圖3a所示，日糧中添加16%SBP可顯著提高ZFN423的mRNA水平（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，C/EBPα（圖3b，P＜0.01）與PPARγ（圖3c，P＜0.05）的mRNA表達(dá)極顯著或顯著上升。Western blot的結(jié)果顯示，16SBP組中轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和C/EBPα的蛋白含量顯著上升（圖3d、3e，P＜0.05），而C/EBPβ蛋白含量未見(jiàn)顯著變化（圖3f）。

圖2 日糧中添加SBP對(duì)肉羊LD中IMF的影響Fig.2 The effects of different dietary SBP level on IMF content in LD muscle in lambs

2.4 日糧中添加SBP對(duì)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，16SBP組肉羊LD中SREBP1的表達(dá)在mRNA（圖4a，P＜0.05）與蛋白水平（圖4b，P＜0.05）均顯著高于其他兩組。如圖4c、4d所示，日糧中添加SBP未顯著影響FABP4的表達(dá)水平。與對(duì)照組相比，日糧中添加16%SBP可顯著增加FAS的mRNA水平（圖4e，P＜0.05）。如圖4f顯示，日糧中添加7.8%SBP和16%SBP均可以顯著增加ACC的含量（P＜0.05）。

2.5 不同SBP水平對(duì)LD中脂肪代謝相關(guān)酶活力的影響

表2 日糧中添加SBP對(duì)肉羊LD中脂肪酸代謝相關(guān)酶活性的影響Tab.2 Effect of dietary SBP supplementation on fatty acid metabolism-related enzyme activities in Longissimus thoracis et lumborum muscle of lambs

圖3 日糧中添加SBP對(duì)肉羊LD中脂肪細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響Fig.3 The effects of different dietary SBP level on adipogenesis related transcriptional factor expression LD muscle in lambs

圖4 日糧中添加SBP對(duì)肉羊LD中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.4 The effects of different dietary SBP level on the enzymes expression of lipid metabolism

如表2所示，與對(duì)照組相比，7.8SBP與16SBP組中的FAS活性顯著升高（P＜0.05），而ACC的活性在16SBP組中顯著高于其他兩組（P＜0.05）。日糧中添加SBP未改變LD中的MDH活性。與對(duì)照組相比，16SBP組中的HSL均顯著降低（P＜0.05），而LPL未見(jiàn)顯著差異。

3 討論

隨著羊肉消費(fèi)市場(chǎng)的成熟，消費(fèi)者對(duì)優(yōu)質(zhì)羊肉的需求逐漸增加。嫩度是決定羊肉品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一［15］，其高低受到了動(dòng)物品種、營(yíng)養(yǎng)水平、飼養(yǎng)管理、養(yǎng)殖環(huán)境、宰前與宰后操作的影響［16］。WBSF是衡量肉嫩度的常用指標(biāo)之一，WBSF越小，肌肉嫩度越好。本研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加7.8%SBP即可以顯著降低WBSF，說(shuō)明了SBP有提高羊肉嫩度的功能。黃酮是沙棘的重要活性成分之一。李垚等［17］在肉雞日糧中添加沙棘黃酮后發(fā)現(xiàn)了雞肉剪切力有下降趨勢(shì)，本研究進(jìn)一步證明了沙棘活性物質(zhì)與肉嫩度的相關(guān)性。

肌內(nèi)脂肪含量是決定肉品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一，其含量的高低影響了羊肉的多汁性、適口性、肉風(fēng)味以及肉嫩度等指標(biāo)［18］。本試驗(yàn)測(cè)定了IMF含量，并證明了日糧中添加SBP顯著增加了IMF的含量。鑒于IMF對(duì)肉嫩度的貢獻(xiàn)，添加SBP導(dǎo)致的IMF含量升高解釋了WBSF降低的原因。與本試驗(yàn)結(jié)果類似的是，肉雞日糧中添加一定比例的沙棘黃酮可以有效降低腹脂率，降低血液中的甘油三酯、膽固醇以及低密度脂蛋白，有效地提高了胸肌中的IMF含量［6］。結(jié)合我們的結(jié)果推測(cè)，沙棘中可能存在影響脂質(zhì)代謝及肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化的活性物質(zhì)。

動(dòng)物體內(nèi)脂肪組織可分為4大類，皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪、肌間脂肪和肌內(nèi)脂肪［19］，其含量的高低受脂肪細(xì)胞分化能力與脂肪沉積能力的共同影響。在胚胎發(fā)育早期，肌肉纖維、肌內(nèi)脂肪細(xì)胞和成纖維細(xì)胞來(lái)源于一種常見(jiàn)的間充質(zhì)祖細(xì)胞群，在此期間形成肌源性或纖維/脂肪源性細(xì)胞譜系［20］。間充質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞經(jīng)過(guò)兩個(gè)階段，即決定與分化［21］，其中ZNF423在特化階段其關(guān)鍵作用，決定了脂肪前體細(xì)胞的形成［22］。ZNF423可以誘導(dǎo)PPARγ的表達(dá)，它可以誘導(dǎo)纖維脂肪祖細(xì)胞分化為前體脂肪細(xì)胞進(jìn)而分化為成熟的脂肪細(xì)胞。前人研究發(fā)現(xiàn)ZNF423在具有較高成脂能力的牛肌間質(zhì)血管中含量豐富，ZNF423的過(guò)量表達(dá)促進(jìn)了低脂細(xì)胞的成脂分化，反之亦然［23］。本研究發(fā)現(xiàn)，16SBP組的ZNF423基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，表明16SBP組肉羊LD有更高的前體脂肪細(xì)胞形成能力。脂肪細(xì)胞分化同時(shí)受到了C/EBPβ、C/EBPα和PPARγ等轉(zhuǎn)錄因子的共同調(diào)控，其中，C/EBPα直接與PPARγ基因的啟動(dòng)子結(jié)合，誘導(dǎo)其表達(dá)，并啟動(dòng)脂肪細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，使前體細(xì)胞最終分化為成熟的脂肪細(xì)胞［24］。PPARγ是脂肪生成的主要調(diào)節(jié)因子，其激動(dòng)劑（羅格列酮、噻唑烷二酮、吡格列酮等）通常對(duì)治療代謝功能障礙和糖尿病有效［25］。前人研究表明，飼料中添加噻唑烷二酮和吡格列酮可以顯著促進(jìn)育肥豬IMF的沉積，而不影響背膘厚［26］。本研究證實(shí)了日糧中添加沙棘果渣可有效提高C/EBPα和PPARγ的表達(dá)水平，說(shuō)明了沙棘果渣有增加LD中肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化的功能，具體的活性成分有待進(jìn)一步研究。

IMF含量的高低也與脂肪代謝能力相關(guān)。為了進(jìn)一步分析SBP增加LD中IMF的原因，本試驗(yàn)分析了與脂肪酸代謝相關(guān)酶類的表達(dá)量及活性。SREBP1與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的代謝密切相關(guān)，是諸多脂肪酸合成相關(guān)酶相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子［27］。本研究結(jié)果證明了日糧中添加SBP可有效地促進(jìn)SREBP1的表達(dá)，而其下游基因ACC與FAS的表達(dá)也相應(yīng)增加。ACC和FAS均為脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，其中ACC 催化乙酰輔酶A的羧化反應(yīng)生成丙二酰輔酶A，而FAS催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A合成棕櫚酸酯［28-29］。本研究結(jié)果證明了日糧中添加16%SBP可顯著增加二者的酶活性。FABP4是一種脂肪酸結(jié)合蛋白，其表達(dá)高低與IMF含量及脂肪酸的合成能力呈正相關(guān)［30］。肉牛中的研究結(jié)果表明，F(xiàn)ABP4是影響牛肉嫩度和IMF沉積的重要候選基因之一［31］。本研究發(fā)現(xiàn)的日糧中SBP對(duì)LD中FABP4、ACC及FAS的調(diào)控作用證明了日糧中添加SBP可以促進(jìn)LD中脂肪細(xì)胞的脂肪酸合成。

除受合成影響外，IMF沉積能力與脂肪酸的分解有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加16%SBP可顯著降低HSL酶活力。由于HSL是脂肪酸分解的限速酶，可以將甘油三酯分解成游離脂肪酸、甘油二酯和甘油［32］，本結(jié)果說(shuō)明了SBP可以抑制LD中脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸降解。雖然LPL可以將甘油三酯分解成脂肪酸和甘油，調(diào)控脂肪沉積［33］，但本研究未發(fā)現(xiàn)LPL活性受SBP調(diào)控。

綜上所述，日糧中添加16%的SBP可通過(guò)促進(jìn)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子ZNF423、PPARγ和C/EBPα等的表達(dá)促進(jìn)LD中脂肪細(xì)胞形成。同時(shí)促進(jìn)ACC與FAS的酶活性，促進(jìn)甘油三酯合成，抑制HSL酶活性，從而抑制甘油三酯分解，最終促進(jìn)IMF的增加，降低肉嫩度。由于SBP中含有眾多的活性物質(zhì)，這些變化的轉(zhuǎn)錄因子及酶活性是受何種活性物質(zhì)調(diào)控尚待進(jìn)一步研究。