黃原膠對Suc-Asn反應(yīng)體系中5-羥甲基糠醛形成的影響

葉 倩，徐 寧，郭紅英*，秦 丹，譚興和，王 鋒，王仁才

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) a.食品科技學(xué)院；b.園藝園林學(xué)院，長沙 410128；2.湖南省食用菌研究所，長沙 410013）

5-羥甲基糠醛（5-Hydroxymethylfural，5-HMF）純品為針狀晶體或粉末，具有甘菊花味，5-HMF易溶于甲醇、水、乙酸乙酯，可溶于氯仿、苯、乙醚，微溶于四氯化碳溶液，難溶于石油醚［1］，分子式為C6H6O3，結(jié)構(gòu)如圖1所示。5-HMF主要是在熱加工食品（如烘焙、燒烤等）過程中產(chǎn)生的一種可以刺激呼吸道、眼睛、黏膜，引起皮膚過敏及腸道潰瘍的有害物質(zhì)［2］，雖可對食品增色調(diào)香［3］，但卻具有一定的致癌性［4-5］。目前已知5-HMF的主要產(chǎn)生途徑有3種：焦糖化反應(yīng)、果糖脫水和美拉德反應(yīng)［6-7］。美拉德反應(yīng)和焦糖化反應(yīng)是形成食品風(fēng)味及感官的主要來源，但又會(huì)產(chǎn)生一系列對人體有毒有害的物質(zhì)，如5-HMF和丙烯酰胺等物質(zhì)［8］。因此，如何有效抑制5-HMF在食品熱加工過程的產(chǎn)生至關(guān)重要。

圖1 5-羥甲基糠醛的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structure of 5-HMF

黃原膠（xanthan gum），又稱漢生膠或黃桿菌膠，屬于微生物膠，顏色為淺黃色或白色，易溶于水，具有穩(wěn)定、乳化、膠凝等作用，常用于食品工業(yè)生產(chǎn)［9］。陳季旺課題組［10-12］先后研究了于外裹糊配方中添加黃原膠對油炸外裹糊魚塊的丙烯酰胺、油脂、水分等含量和感官品質(zhì)的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明黃原膠對油炸外裹糊魚塊的丙烯酰胺含量、色度和質(zhì)構(gòu)、水分蒸發(fā)和油脂吸收等均有顯著影響?，F(xiàn)有較新研究顯示，5-HMF可參與丙烯酰胺的生成，其生成機(jī)理是葡萄糖在熱反應(yīng)條件下脫水生成3-脫氧葡萄糖醛酮（3-DG），進(jìn)一步脫水生成3，4-DG和5-HMF，這些羰基化合物都可與天冬酰胺反應(yīng)生成丙烯酰胺［13-14］。且多項(xiàng)試驗(yàn)報(bào)道了溫度和pH值對黃原膠的流變性和黏度的影響較小［15-16］。因此本試驗(yàn)采用蔗糖（Suc）和天冬酰胺（Asn）為主要反應(yīng)底物，建立美拉德模擬反應(yīng)體系，通過改變反應(yīng)條件等方法探究黃原膠對體系中5-HMF形成的影響，旨在為降低熱處理食品中有害物質(zhì)5-HMF的產(chǎn)生提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸（分析純）購于武漢市江北化學(xué)試劑有限責(zé)任公司；5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)品購于SIGMA公司；蔗糖（分析純）、L-天冬酰胺（生化試劑）、黃原膠（化學(xué)純）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）購于梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

CP214型電子天平購于奧豪斯儀器上海有限公司；VORTEX-5型漩渦振蕩儀購于海門市其林貝爾儀器制造有限公司；722S型可見分光光度計(jì)購于上海菁華科技儀器有限公司；Waters e2695型高效液相色譜儀購于美國Waters公司；SHZ-DⅢ型循環(huán)水系真空泵購于鞏義市予華儀器有限公司；TGW16型臺(tái)式高速微量離心機(jī)購于長沙英泰儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 建立Suc-Asn反應(yīng)體系

準(zhǔn)確稱取0.342 3 g蔗糖和0.264 2 g天冬酰胺于250 mL圓底燒瓶中，再加入0.5%乳酸溶液100μL和300μL不同質(zhì)量濃度的黃原膠溶液，充分混合，密封后置于160℃油浴鍋中反應(yīng)10 min后取出，水冷卻3 min，加3.0 mL超純水，渦旋1 min，過膜（0.45μm）后待測。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

按1.2.1建立Suc-Asn反應(yīng)體系，以抗氧化能力、褐變度、5-羥甲基糠醛含量為優(yōu)化指標(biāo)，探究影響體系中5-HMF生成的因素。配方設(shè)計(jì)：1）固定反應(yīng)時(shí)間10 min、黃原膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%、pH值為7，考察不同反應(yīng)溫度（120、140、160、180、200℃）對體系中5-HMF形成的影響；2）固定反應(yīng)溫度160℃、黃原膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%、pH值為7，考察不同反應(yīng)時(shí)間（4、6、8、10、12、14、16 min）對體系中5-HMF形成的影響；3）固定反應(yīng)時(shí)間為10 min、反應(yīng)溫度為160℃、pH值為7，考察不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的黃原膠溶液（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）對體系中5-HMF形成的影響；4）固定反應(yīng)時(shí)間10 min、黃原膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%、反應(yīng)溫度160℃，考察不同 pH 值（1、2、3、4、5、6、7、8）對體系中5-HMF形成的影響。

1.2.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定各反應(yīng)條件的影響范圍，進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.3 測定方法

1.3.1 抗氧化能力的測定

參照郭紅英［17］和 Mohsen等［18］的方法，配制濃度為6.5×10-4mol/L的DPPH-甲醇溶液作為母液，用50%甲醇將母液稀釋10倍，按表1進(jìn)行反應(yīng)，并于DPPH溶液的最大吸收波長517 nm測A0、Ai、Aj所表示樣品的吸光度值（注：Ai所表示的樣品需在室溫下反應(yīng)30 min后方可進(jìn)行吸光度的測定）。每個(gè)試樣做3個(gè)平行試驗(yàn)，取其平均值。

表1 DPPH試驗(yàn)加樣（mL）Tab.1 Volumes of ingredients for DPPH test (mL)

樣品對DPPH自由基的清除能力（scavenging activity，SA）表示為：

其中，A0：DPPH與溶劑混合液的吸光度；Ai：DPPH與樣品反應(yīng)后的吸光度；Aj：樣品與溶劑混合液的吸光度。

1.3.2 5 -HMF的測定

參照 Zhang 等［19］和張玉玉等［20］的方法進(jìn)行5-HMF的測定。5-HMF標(biāo)曲配制：將5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品用10%甲醇溶液配制成0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L的不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）。檢測條件：色譜柱Agilent TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Agilent TC-C18保護(hù)柱；流動(dòng)相為乙腈和0.1%甲酸水溶液（V乙睛∶V0.1%甲酸=10∶90）；流速為1 mL/min；柱溫為35℃；進(jìn)樣量為10μL；二極管陣列檢測器波長為285 nm。5-HMF標(biāo)準(zhǔn)樣品不同質(zhì)量濃度的色譜圖如圖2所示。根據(jù)檢測樣品中5-HMF色譜峰面積及其相對應(yīng)的質(zhì)量濃度，從而可計(jì)算出樣品中5-HMF的含量，以5-HMF的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=16 212x+832.35，R2=0.999 8，表明5-HMF質(zhì)量濃度與色譜峰面積線性關(guān)系良好。

圖2 5-HMF標(biāo)準(zhǔn)HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of 5-HMF standards

1.3.3 褐變度的測定

將樣品稀釋20倍，用分光光度計(jì)在420 nm波長下測定其吸光值［21］。每個(gè)樣品做3次平行試驗(yàn)，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用 Excel 2010 和SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 反應(yīng)溫度對Suc-Asn反應(yīng)體系的影響

反應(yīng)溫度對Suc-Asn反應(yīng)體系中5-HMF生成量、DPPH自由基清除能力和褐變度的影響如表2所示。5-HMF生成量隨反應(yīng)溫度的升高呈現(xiàn)先增加后趨于平穩(wěn)的趨勢。當(dāng)反應(yīng)溫度高于140℃時(shí)，5-HMF生成量得到顯著性提升，160℃時(shí)5-HMF含量僅為3.81 mg/L，當(dāng)溫度為200℃時(shí)5-HMF含量達(dá)到最大值73.63 mg/L，此時(shí)可達(dá)最大抑制率66.73%。DPPH自由基清除能力隨反應(yīng)溫度升高而加強(qiáng)，最大可達(dá)92.73%，褐變度也達(dá)最大值，這可能是由于當(dāng)反應(yīng)溫度較低時(shí)，蔗糖與天冬酰胺未能反應(yīng)完全，此時(shí)5-HMF的形成是一個(gè)累加的過程，隨著反應(yīng)溫度的繼續(xù)升高，5-HMF的累加速度受到抑制，聚合或分解反應(yīng)加?。?2］，所以5-HMF的含量會(huì)趨于平穩(wěn)，體系抗氧化能力增強(qiáng)，類黑素與焦糖色素的生成量也隨之增加，致使褐變度增加。

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間對Suc-Asn反應(yīng)體系的影響

反應(yīng)時(shí)間對Suc-Asn反應(yīng)體系中5-HMF生成量、DPPH自由基清除能力和褐變度的影響如表3所示。5-HMF含量隨著反應(yīng)時(shí)間的延長呈顯著性增長趨勢，在12 min時(shí)抑制率可達(dá)75.39%。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，DPPH抗氧化能力呈現(xiàn)先緩慢增加至趨于平穩(wěn)后降低的趨勢，在12 min時(shí)達(dá)到最大值，這一結(jié)果與涂宗財(cái)?shù)龋?3］研究的樣品經(jīng)高溫長時(shí)間熱處理導(dǎo)致抗氧化活性降低的結(jié)論一致。吸光值隨反應(yīng)時(shí)間的增加而增加，在16 min時(shí)吸光值達(dá)到最大值，反應(yīng)前期，由于時(shí)間相對較短，美拉德產(chǎn)物產(chǎn)出量相對較少，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，產(chǎn)物量得到積累［24］，致使褐變度增加。

表2 反應(yīng)溫度對Suc-Asn反應(yīng)體系的影響Tab.2 Effect of reaction temperature on Suc-Asn reaction system

表3 反應(yīng)時(shí)間對Suc-Asn反應(yīng)體系的影響Tab.3 Effect of reaction time on Suc-Asn reaction system

2.1.3 黃原膠質(zhì)量濃度對Suc-Asn反應(yīng)體系的影響

黃原膠質(zhì)量濃度對Suc-Asn反應(yīng)體系中5-HMF生成量、DPPH自由基清除能力和褐變度的影響如表4所示。反應(yīng)產(chǎn)物5-HMF生成量、褐變度隨著添加黃原膠質(zhì)量濃度的升高而降低，而樣品對DPPH自由基的清除能力呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢，在添加黃原膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%時(shí)達(dá)到最大值。5-HMF生成量的變化趨勢說明，不同質(zhì)量濃度的黃原膠溶液可顯著抑制反應(yīng)產(chǎn)物5-HMF的生成，其抑制機(jī)理可能是因?yàn)樘砑狱S原膠質(zhì)量濃度增大，溶液黏稠度隨之增加，體系流動(dòng)性降低，此時(shí)反應(yīng)底物被包埋，不利于美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，從而抑制5-HMF的生成。

表4 黃原膠質(zhì)量濃度對Suc-Asn反應(yīng)體系的影響Tab.4 Effect of xanthan concentration on Suc-Asn reaction system

2.1.4 pH值對Suc-Asn反應(yīng)體系的影響

pH值對Suc-Asn反應(yīng)體系中5-HMF生成量、DPPH自由基清除能力和褐變度的影響如表5所示。5-HMF生成量隨pH值的增加呈現(xiàn)先降低后增加再降低的變化趨勢，在pH值為3時(shí)達(dá)到最低值0.29 mg/L，此時(shí)抑制率為96.35%，當(dāng)pH值為7時(shí)5-HMF含量僅為0.31 mg/L。DPPH自由基清除能力隨著pH值的增加呈現(xiàn)先增加后降低再增加的變化趨勢，在pH值為3和8時(shí)DPPH自由基清除能力分別為88.89%和86.87%。吸光值隨pH值的增加呈先降低后增高再降低的顯著性波動(dòng)變化趨勢。高pH值既有助于羰氨縮合使反應(yīng)產(chǎn)物增加，又有助于糠醛類物質(zhì)重排成還原酮類產(chǎn)物。故5-HMF含量和DPPH自由基清除能力相對較高［25］。

表5 pH值對Suc-Asn反應(yīng)體系的影響Tab.5 Effect of pH value on Suc-Asn reaction system

2.2 Suc-Asn反應(yīng)體系檢測指標(biāo)的相關(guān)性分析

對Suc-Asn反應(yīng)體系在160℃下不同反應(yīng)時(shí)間的樣品5-HMF含量、褐變度以及抗氧化能力進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r可以反映兩個(gè)變量間的相關(guān)密切程度。本試驗(yàn)中判斷兩變量相關(guān)密切程度的具體標(biāo)準(zhǔn)為：0＜∣r∣＜0.3表明微弱相關(guān)；0.3＜∣r∣＜0.5表明低度相關(guān) ；0.5＜∣r∣＜0.8表明顯著相關(guān)；0.8＜∣r∣＜1.0表明高度相關(guān)。

由表6可知，5-HMF含量與褐變度的相關(guān)系數(shù)最大，呈高度相關(guān)，其次是褐變度與抗氧化能力的相關(guān)系數(shù)，最后為5-HMF與抗氧化能力低度相關(guān)。褐變度能衡量美拉德反應(yīng)的程度是由于美拉德反應(yīng)中會(huì)產(chǎn)生大量棕色含氮的共聚物和聚合物，即類黑素［26］，美拉德反應(yīng)還會(huì)產(chǎn)生影響熱加工食品的風(fēng)味色澤的中間產(chǎn)物和揮發(fā)性香氣物質(zhì)等［27-28］，這些物質(zhì)還具有一定的抗氧化性［29］。

表6 測定指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)Tab.6 Correlation coefficient of determination standard

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

為確定各因素的最佳參數(shù)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選定時(shí)間A、溫度B、黃原膠質(zhì)量濃度C、pH值D四個(gè)因素的合適范圍進(jìn)行正交試驗(yàn)，具體水平如表3所示，正交試驗(yàn)結(jié)果見表7。因本試驗(yàn)的最優(yōu)組合要求黃原膠溶液能對Suc-Asn體系中5-HMF形成起到抑制作用，因此應(yīng)選擇最小K值作為每個(gè)因素的最優(yōu)水平組合成最優(yōu)組合（Ki表示任意列上水平號(hào)為i時(shí)所對應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果之和，R是每個(gè)因素下K的最大值減最小值）。

由表8可以看出，時(shí)間、溫度、濃度、pH值這四個(gè)因素的極差R值分別是24.01、50.68、19.19、27.70，所以這四個(gè)因素對Suc-Asn體系中5-HMF形成影響的主次順序是B＞D＞A＞C，即溫度＞pH值＞時(shí)間＞濃度。時(shí)間、溫度和濃度中K1最小，pH值中K3最小，因此只考慮抑制體系中5-HMF含量這一指標(biāo)時(shí)，最優(yōu)組合為A1B1C1D3，即當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為12 min，反應(yīng)溫度為160℃，添加0.1%黃原膠溶液及pH值為7時(shí)，黃原膠可對Suc-Asn體系中5-HMF的形成起到最佳的抑制作用。但是試驗(yàn)組并沒有該組合，因此需要進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)。

表7 正交試驗(yàn)因素水平表Tab.7 Factors and their levels in the orthogonal array design

表8 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.8 Experimental design and corresponding results for orthogonal array analysis

2.4 驗(yàn)證性試驗(yàn)

通過檢測5-HMF含量，將分析最佳組合與試驗(yàn)最佳組合得出的含量進(jìn)行比較，試驗(yàn)重復(fù)三次，試驗(yàn)結(jié)果見表9。由表9可知，正交試驗(yàn)分析得出的最優(yōu)組合產(chǎn)生的5-HMF含量低于試驗(yàn)最優(yōu)組，因此分析結(jié)果成立，即試驗(yàn)的最優(yōu)組合為反應(yīng)時(shí)間12 min，反應(yīng)溫度160℃，0.1%黃原膠溶液，pH為7。

表9 驗(yàn)證性試驗(yàn)Tab.9 The replication experiment

3 討論

本試驗(yàn)通過建立Suc-Asn反應(yīng)體系模擬美拉德反應(yīng)過程，探究反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、黃原膠質(zhì)量濃度、體系pH值這四個(gè)因素對體系中5-HMF生成量、抗氧化能力和褐變度的影響。在單因素試驗(yàn)中，不同反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、黃原膠質(zhì)量濃度和體系pH值均對5-HMF生成量有顯著影響，抑制率從5.20%到80.00%不等。反應(yīng)前期，反應(yīng)時(shí)間較短，反應(yīng)溫度較低時(shí)，蔗糖與天冬酰胺反應(yīng)不完全，此時(shí)美拉德產(chǎn)物產(chǎn)出量相對較少，隨著反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行，產(chǎn)物量得到積累，致使5-HMF生成量增加，體系抗氧化能力增強(qiáng)，褐變度增加。體系pH值既能影響羰氨縮合反應(yīng)的程度，又能在高pH值時(shí)促使糠醛類物質(zhì)重排成還原酮類產(chǎn)物，引起褐變。黃原膠獨(dú)特的膠凝作用可使得體系流動(dòng)性降低，反應(yīng)底物被包埋，從而抑制美拉德反應(yīng)的進(jìn)行。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，得到最佳反應(yīng)條件：反應(yīng)時(shí)間為12 min，反應(yīng)溫度為160℃，0.1%的黃原膠溶液，pH值為7。此時(shí)反應(yīng)產(chǎn)生的5-HMF含量最低。

目前關(guān)于黃原膠抑制熱處理食品中5-HMF生成量的研究相對較少，多是研究黃原膠對美拉德反應(yīng)丙烯酰胺生成量的影響或抗氧化劑對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物5-羥甲基糠醛生成量的影響。Shapla等［30］研究發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)加工溫度可顯著減少5-HMF的形成。陳季旺課題組［10-12］研究發(fā)現(xiàn)在外裹糊中添加黃原膠可顯著增加美拉德反應(yīng)產(chǎn)物丙烯酰胺的生成量，但本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)黃原膠對5-HMF生成量有抑制作用，這可能是由于黃原膠可促進(jìn)5-HMF進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成丙烯酰胺［14］，但其具體機(jī)理還需進(jìn)一步證實(shí)。張振華［31］發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH為5.7時(shí)，5-HMF產(chǎn)量最低。Aykin等［32］研究發(fā)現(xiàn)在面制品中添加適量NaHCO3可有效抑制5-HMF的生成。張易楠［33］發(fā)現(xiàn)槲皮素和表兒茶素的羥基氫可與5-HMF及其前體的羥基發(fā)生分子間脫水反應(yīng)，從而抑制5-HMF含量的產(chǎn)生。目前關(guān)于抑制5-HMF生成的研究相對較多，且其抑制方法繁多，黃原膠雖可減少5-HMF含量的生成，且與其他抑制方法存在一定的相似性，但其抑制機(jī)理仍有待進(jìn)一步研究，此試驗(yàn)旨在為5-HMF的控制提供更多依據(jù)。