激活JNK后對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤抑瘤效果的探究

姜瑞芬，譚擁軍，黃明敏

（湖南大學(xué)生物學(xué)院，長(zhǎng)沙 410082）

c-jun氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinase，JNK）是一種Ser/Thr蛋白激酶，屬于絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族。JNK激酶家族包括3種蛋白質(zhì)（JNK1、JNK2和JNK3），JNK蛋白行使功能必須要處于激活的磷酸化狀態(tài)［6］。當(dāng)細(xì)胞受到藥物、細(xì)胞因子或其他外界應(yīng)激的刺激后，JNK蛋白會(huì)被磷酸化。激活后的JNK磷酸化特定底物上的絲氨酸和蘇氨酸殘基，引起細(xì)胞功能發(fā)生改變，包括對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥等的影響［7］。而JNK的核底物中大部分為轉(zhuǎn)錄因子，JNK可以直接結(jié)合到下游轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子區(qū)域改變其轉(zhuǎn)錄活性，或直接磷酸化修飾該因子，引起其下游基因的表達(dá)變化［8］。JNK是調(diào)節(jié)許多生理過(guò)程的主要蛋白激酶，包括炎癥反應(yīng)、形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞增殖、分化、存活和凋亡等方面［9］。另外，JNK的持續(xù)活化與癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。已有文獻(xiàn)表明，JNK在肝癌、皮膚癌、乳腺癌中發(fā)揮重要作用［10-12］，因此可以作為治療某些疾病的靶點(diǎn)。

茴香霉素（anisomycin，ANS）是JNK的經(jīng)典激動(dòng)劑，可誘導(dǎo)多種細(xì)胞內(nèi)JNK的磷酸化，使其轉(zhuǎn)化為活性狀態(tài)［13-14］。本文通過(guò)使用JNK激動(dòng)劑的方式，對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中的磷酸化JNK（phospho-JNK，P-JNK）進(jìn)行有效的調(diào)節(jié)，探究JNK激活后對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展是否起到關(guān)鍵作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251來(lái)源于中南大學(xué)湘雅附屬醫(yī)院神經(jīng)退行性疾病實(shí)驗(yàn)室；Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）以及胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)GIBCO公司；ANS購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)碧云天公司；P-JNK抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，JNK和β-actin抗體購(gòu)買(mǎi)于英國(guó)abcam公司，Rabbit和mouse二抗購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)碧云天公司；反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）引物由長(zhǎng)沙擎科公司合成；RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒來(lái)自美國(guó)Thermo Fisher公司。

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Thermo公司；倒置熒光顯微鏡購(gòu)買(mǎi)自日本Nikon公司；凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自上海天能公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems 公司；微孔板檢測(cè)儀（酶標(biāo)儀）購(gòu)自上海美谷分子儀器有限公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自于美國(guó)Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人源神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251為貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，培養(yǎng)于含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2濃度培養(yǎng)條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%以上時(shí)，按照1:3的比例進(jìn)行傳代，或者加茴香霉素進(jìn)行藥物處理。

建立健全國(guó)有施工企業(yè)的財(cái)務(wù)管理制度，是加強(qiáng)企業(yè)財(cái)務(wù)管理工作的重要前提，也是能夠保障財(cái)務(wù)管理有效進(jìn)行的保障。只有建立了嚴(yán)格的規(guī)章制度，才能使企業(yè)的財(cái)務(wù)管理有章可循，進(jìn)而推動(dòng)企業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。規(guī)章制度的建立一定要對(duì)企業(yè)的整體負(fù)責(zé)，具有全面性，讓企業(yè)所有的財(cái)會(huì)工作都變得有據(jù)可依。不僅要制定規(guī)章制度，制度還需要強(qiáng)有力的執(zhí)行力，要對(duì)員工進(jìn)行培訓(xùn)，使其深入了解每一項(xiàng)制度，提高其遵守制度的自覺(jué)性，并且依靠員工之間的競(jìng)爭(zhēng)心理，使其在日常工作中做到相互監(jiān)督，管理人員也要遵章守法，提高自控力，讓自己的一言一行都能對(duì)其他人起到良好的榜樣作用。共同促進(jìn)公司又好又快發(fā)展。

1.2.2 在線網(wǎng)站篩選有JNK表達(dá)差異性的腫瘤模型

UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）是一個(gè)有效的癌癥數(shù)據(jù)在線分析和挖掘的網(wǎng)站，主要是基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)癌癥數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。我們進(jìn)入TCGA analysis界面，輸入要搜索的基因MAPK8（JNK1），分別與下面TCGA dataset中不同的腫瘤類型進(jìn)行相關(guān)性和生存分析的篩選，找到最合適的腫瘤模型。

1.2.3 CCK-8檢測(cè)

將U251細(xì)胞接種于96孔板中，每個(gè)孔接種量約4 000個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)12.0 h并完全貼壁后，在試驗(yàn)組中加不同質(zhì)量濃度的茴香霉素，對(duì)照組中加相應(yīng)等體積的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）作為對(duì)照，設(shè)置5組平行。48.0 h后將原培養(yǎng)基吸掉，每孔加入含10% CCK-8的新鮮培養(yǎng)基100μL，37℃培養(yǎng)箱中孵育1.0 h，在酶標(biāo)儀中進(jìn)行測(cè)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)

將U251細(xì)胞接種于24孔板中，確保每個(gè)孔細(xì)胞數(shù)相同且密度小于10%。待細(xì)胞完全貼壁后，試驗(yàn)組分別加入質(zhì)量濃度為1.0μg/mL和3.0μg/mL的茴香霉素，對(duì)照組加入同等體積的DMSO作為對(duì)照，每組設(shè)置3組平行。分別在0、24.0、48.0、72.0 h時(shí)對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色并對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，從而觀察加藥后茴香霉素對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

1.2.5 細(xì)胞周期檢測(cè)

將U251細(xì)胞接種于2個(gè)6 cm培養(yǎng)皿中，確保密度相同且待完全貼壁后，其中一皿用1.0μg/mL茴香霉素處理8.0 h作為試驗(yàn)組，另一皿加相同體積的DMSO處理相同的時(shí)間作為對(duì)照組。將藥物處理后的2皿細(xì)胞消化下來(lái)制成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色，室溫避光孵育30 min；將染色完成的細(xì)胞吸打混勻，用篩網(wǎng)過(guò)濾到流式管內(nèi)，再在流式細(xì)胞儀中進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，得到的數(shù)據(jù)用flowjo軟件進(jìn)行分析，從而得到細(xì)胞各周期變化的結(jié)果。

1.2.6 劃痕試驗(yàn)

將細(xì)胞以50%以上密度接種于12孔板，每孔接種細(xì)胞數(shù)相等，培養(yǎng)12.0 h待細(xì)胞完全貼壁且鋪滿整個(gè)孔底后，將培養(yǎng)基吸掉并將12孔板倒置過(guò)來(lái)，在每個(gè)孔底平行的劃3條線。然后將12孔板正放，用無(wú)菌的200μL槍頭沿著孔底的橫線劃痕。用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）將細(xì)胞沖洗2遍后加入新鮮培養(yǎng)基，試驗(yàn)組同時(shí)加入1.0μg/mL的茴香霉素于37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。在加藥0 h和24.0 h后拍照，比較對(duì)照組和試驗(yàn)組的傷口愈合能力。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）

未經(jīng)任何處理的U251細(xì)胞為對(duì)照組，1.0μg/mL茴香霉素分別處理0、4.0、8.0、12.0 h的U251細(xì)胞為試驗(yàn)組。把對(duì)照組和試驗(yàn)組的細(xì)胞消化下來(lái)提取總蛋白，將處理好的樣品以每孔80μg的上樣量進(jìn)行膠濃度為12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），再濕轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上；將其置于室溫下5%的脫脂奶粉封閉2.0 h左右，在稀釋好的一抗中進(jìn)行4℃孵育過(guò)夜；用含吐溫的Tris鹽緩沖液（tris buffered saline tween，TBST）洗膜6次，每次5 min；再在對(duì)應(yīng)的二抗中室溫孵育2.0 h，TBST洗膜6次，每次5 min；最后將洗好的膜放在凝膠成像儀上，滴加顯色液后進(jìn)行顯影曝光并拍照。

1.2.8 RT-PCR

未經(jīng)任何處理的U251細(xì)胞為對(duì)照組，1.0μg/mL茴香霉素分別處理0、4.0、8.0、12.0 h的U251細(xì)胞為試驗(yàn)組。將對(duì)照組和試驗(yàn)組的細(xì)胞加入Trizol后，用RNA提取試劑盒按照其說(shuō)明書(shū)上的步驟進(jìn)行RNA的提取，再用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將得到的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計(jì)相關(guān)基因的反轉(zhuǎn)錄引物，10μL體系加樣，進(jìn)行RT-PCR，以GAPDH基因的循環(huán)數(shù)作為內(nèi)參。RT-PCR儀程序設(shè)置為三步法擴(kuò)增程序（95℃5 min ；95℃ 15 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán) ；95℃ 15 s、60℃ 60 s、95℃ 15 s，1 個(gè)循環(huán)）。相關(guān)基因的引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 相關(guān)基因的qRT-PCR引物Tab.1 The qRT-PCR primers of related genes

1.2.9 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

將U251細(xì)胞接種于2個(gè)6 cm培養(yǎng)皿中，確保密度相同且待完全貼壁后，其中一皿用1μg/mL茴香霉素處理8.0 h后作為試驗(yàn)組，另一皿加相同體積的DMSO處理相同的時(shí)間為對(duì)照組。在2個(gè)培養(yǎng)皿中加入1.5 mL Trizol直接裂解細(xì)胞，吹打均勻至無(wú)粘稠后加入經(jīng)去RNA酶處理的EP（eppendorf）管中，凍于-80℃冰箱。將樣品寄送至上海美吉生物公司，進(jìn)行RNA的抽提以及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA sequencing，RNA-seq）的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 在線網(wǎng)站分析JNK與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展之間具有很強(qiáng)的相關(guān)性

UALCAN是一個(gè)基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)癌癥數(shù)據(jù)進(jìn)行分析的在線網(wǎng)站。我們對(duì)JNK和不同腫瘤模型進(jìn)行了相關(guān)性和生存分析比對(duì)，發(fā)現(xiàn)JNK1（MAPK8）基因與神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）之間的相關(guān)性最高（圖1a），并且JNK1與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的預(yù)后有關(guān)（圖1b）。因此，我們選擇了神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251作為試驗(yàn)開(kāi)展的細(xì)胞模型。

圖1 在線網(wǎng)站分析JNK與神經(jīng)膠質(zhì)瘤之間的相關(guān)性Fig.1 Analysis of the correlation between JNK and gliomas via an online website

2.2 JNK被激活的最適條件探究

將U251細(xì)胞傳代至6 cm培養(yǎng)皿中，保證每皿細(xì)胞密度相同。待細(xì)胞完全貼壁后，在4皿細(xì)胞中分別加入不同質(zhì)量濃度（0.5、1.0、1.5、2.0μg/mL）的茴香霉素作為試驗(yàn)組，另一皿空白細(xì)胞中加入DMSO作為對(duì)照組。培養(yǎng)箱放置1 h后，收集蛋白，做Western blot檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果表明茴香霉素質(zhì)量濃度為1.0μg/mL時(shí)激活JNK效果最好，具體結(jié)果如圖2a所示。同樣的方法傳代細(xì)胞，DMSO處理的為對(duì)照組，1μg/mL的茴香霉素分別處理不同時(shí)間（0.5、1.0、1.5 h）的細(xì)胞為試驗(yàn)組。將蛋白收集，做Western blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)茴香霉素處理細(xì)胞的時(shí)間為1.0 h時(shí)JNK的激活效果最好，結(jié)果如圖2b所示。因此可以得出結(jié)論，質(zhì)量濃度為1μg/mL、處理時(shí)間為1.0 h的茴香霉素激活U251細(xì)胞中JNK的效果最好。

圖2 Western blot試驗(yàn)探究激活JNK的最適條件Fig.2 Western blot experiments explore optimal conditions for activating JNK

2.3 激活JNK后能夠抑制U251的細(xì)胞增殖

取一皿密度較高的U251細(xì)胞，用1.0μg/mL的茴香霉素進(jìn)行處理，分別在0 h（圖3a1）、24.0 h（圖3a2）、48.0 h（圖3a3）、72.0 h（圖3a4）時(shí)于顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察并拍照。發(fā)現(xiàn)隨著茴香霉素處理時(shí)間的增加，原本呈長(zhǎng)梭形的U251細(xì)胞逐漸皺縮變圓，且細(xì)胞間的連接增多，如圖3a所示。將U251細(xì)胞鋪96孔板后用不同質(zhì)量濃度的茴香霉素處理，進(jìn)行CCK-8檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在一定的范圍內(nèi)，隨著茴香霉素質(zhì)量濃度的增加，U251細(xì)胞的活力逐漸減弱，如圖3b所示。將U251細(xì)胞鋪24孔板，分別用1.0μg/mL、3.0μg/mL的茴香霉素處理細(xì)胞不同時(shí)間進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)隨著處理時(shí)間的增加，細(xì)胞增殖數(shù)逐漸降低，且3.0μg/mL處理的細(xì)胞比1.0μg/mL處理的細(xì)胞增殖數(shù)更低，如圖3c所示。1.0μg/mL茴香霉素分別處理1.0、8.0、12.0、24.0 h的U251細(xì)胞，分別提取RNA后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR，發(fā)現(xiàn)隨著處理時(shí)間的增加，與增殖相關(guān)的增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、Polo 樣激酶1（Polo-like kinase 1，PLK1）基因的mRNA表達(dá)量逐漸降低，如圖3d所示，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PCNA、PLK1基因的蛋白表達(dá)量也逐漸降低，結(jié)果如圖3e所示。以上結(jié)果均說(shuō)明了茴香霉素通過(guò)激活JNK有效抑制了U251細(xì)胞的細(xì)胞增殖。

2.4 激活JNK后能夠抑制U251細(xì)胞的遷移能力

將U251細(xì)胞鋪12孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到100%時(shí)，進(jìn)行劃痕試驗(yàn)來(lái)分析細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。用DMSO處理的為對(duì)照組（圖4a1、4a2），用同體積1.0μg/mL茴香霉素處理的孔為試驗(yàn)組（圖4a3、4a4），分別在0 h（圖4a1、4a3）、24.0 h（圖4a2、4a4）時(shí)觀察劃痕寬度的變化并拍照。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)24.0 h后對(duì)照組細(xì)胞劃痕被分裂增殖的細(xì)胞愈合，寬度明顯變窄，而試驗(yàn)組細(xì)胞劃痕寬度未出現(xiàn)任何變化（圖4a）。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞內(nèi)源JNK活性被激活后，U251細(xì)胞的遷移能力受到了顯著抑制。為了進(jìn)一步揭示細(xì)胞遷移能力的變化，采用qRT-PCR分析了E-鈣黏蛋白（E-cadherin，E-cad）的表達(dá)水平。E-cad是人黏附因子，其表達(dá)水平與細(xì)胞的遷移能力呈負(fù)相關(guān)［15］。試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)JNK被激活后，E-cad基因的表達(dá)量隨之上升（圖4b），且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Western blot檢測(cè)，E-cad蛋白的表達(dá)量也呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)（圖4c）。上述試驗(yàn)說(shuō)明在U251細(xì)胞中依靠藥物活化的JNK，抑制了U251細(xì)胞的遷移能力。

圖3 激活JNK后能夠抑制U251的細(xì)胞增殖Fig.3 Activated JNK can inhibits U251 cell proliferation

2.5 激活JNK后能夠引起U251細(xì)胞周期的阻滯

為了進(jìn)一步分析激活后的JNK對(duì)于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的影響，接下來(lái)進(jìn)行了細(xì)胞周期分析。將茴香霉素處理8.0 h和DMSO處理8.0 h的U251細(xì)胞收集下來(lái)，濾網(wǎng)過(guò)濾后上流式細(xì)胞儀，進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)，并將所得數(shù)據(jù)用flowjo軟件進(jìn)行分析。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，茴香霉素處理后的U251細(xì)胞 G0/G1期細(xì)胞比率增加，G2/M 期細(xì)胞比率減少，而S期細(xì)胞比率變化不明顯，如圖5a、5b所示。上述結(jié)果表明，在JNK被激活的條件下，U251細(xì)胞的周期被阻滯在G0/G1期。

圖4 激活JNK后能夠抑制U251細(xì)胞的遷移Fig.4 Activated JNK can inhibits U251 cell migration

2.6 RNA-seq分析尋找受JNK調(diào)節(jié)的下游轉(zhuǎn)錄因子

圖5 激活JNK后能夠引起U251細(xì)胞周期的阻滯Fig.5 Activated JNK can cause U251 cell cycle arrest

為了進(jìn)一步探究JNK是如何引起U251細(xì)胞的功能發(fā)生變化，尋找受JNK調(diào)節(jié)的靶作用因子，揭示激活后的JNK對(duì)于神經(jīng)膠質(zhì)瘤起到抑瘤效果的分子機(jī)制，我們進(jìn)行了RNA-seq分析。我們將嚴(yán)格按照要求處理的細(xì)胞送至上海美吉生物公司，進(jìn)行RNA的抽提以及RNA-seq分析。得到的數(shù)據(jù)通過(guò)R studio軟件進(jìn)行基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA），富集到的P53和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）通路，恰好是已有文獻(xiàn)表明為JNK下游的通路，結(jié)果如圖6a、6b所示?？梢?jiàn)RNA-seq得到的數(shù)據(jù)是可靠的。通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)平臺(tái)，在對(duì)照組與試驗(yàn)組中篩選出的有表達(dá)差異的轉(zhuǎn)錄因子中，挑選了常見(jiàn)的且與腫瘤相關(guān)的P53和 Fox head家族進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)P53家族的得分最高，如圖6c所示，因此我們推測(cè)受JNK調(diào)節(jié)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子為P53。

3 討論

目前在所有的腦腫瘤中，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病率占第一位，并且其發(fā)病率高，術(shù)后復(fù)發(fā)快且預(yù)后差，嚴(yán)重威脅著人類健康。由于傳統(tǒng)治療方式如手術(shù)、化療、放療等的治療效果難以使人滿意［16］，近年來(lái)研究者們對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的研究逐漸趨向于不同通路的靶點(diǎn)治療，這使得人類從分子水平調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展成為可能［17］。

JNK蛋白作為能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞許多生理過(guò)程的主要蛋白激酶，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。但在不同類型的癌癥中，JNK行使的功能也不同。有文獻(xiàn)報(bào)道，JNK可以通過(guò)增強(qiáng)肝細(xì)胞增殖和促進(jìn)新生血管形成而在肝癌中起到促癌作用，JNK途徑還可抑制乳腺癌的發(fā)展［18-19］。而對(duì)于神經(jīng)膠質(zhì)瘤來(lái)說(shuō)，有研究表明，JNK與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的干性相關(guān)［20］，并且JNK通路與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的細(xì)胞凋亡也有關(guān)［21-22］。但具體JNK是否會(huì)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響，以及有怎樣的影響，這是本課題接下來(lái)將要開(kāi)展的研究?jī)?nèi)容。

本文通過(guò)生物信息數(shù)據(jù)分析得出JNK與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展存在很強(qiáng)的相關(guān)性，通過(guò)使用茴香霉素實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)P-JNK水平的有效調(diào)節(jié)，利用Western blot試驗(yàn)探究其發(fā)揮作用的最適條件是質(zhì)量濃度為1.0μg/mL、時(shí)間為1.0 h。在此基礎(chǔ)上用茴香霉素處理U251細(xì)胞，通過(guò)CCK-8檢測(cè)、細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞劃痕和流式細(xì)胞檢測(cè)等試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)激活JNK后能夠引起U251細(xì)胞的細(xì)胞增殖和遷移的抑制以及細(xì)胞周期的阻滯，從而達(dá)到抑瘤效果。本文通過(guò)激活JNK發(fā)現(xiàn)其能夠?qū)ι窠?jīng)膠質(zhì)瘤產(chǎn)生抑瘤效果，為JNK可作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療靶點(diǎn)提供了依據(jù)；通過(guò)RNA-seq分析找到關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子P53，為進(jìn)一步探究JNK影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)節(jié)機(jī)制提供了方向。

圖6 RNA-seq分析尋找受JNK調(diào)節(jié)的下游轉(zhuǎn)錄因子Fig.6 RNA-seq analysis to find downstream transcription factors regulated by activated JNK