果蠅心臟發(fā)育標(biāo)記基因Svp的多克隆抗體制備

李玉玲，趙夢(mèng)婧，李瑞可，張亞楠，吳秀山，袁婺洲

（湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院心臟發(fā)育研究中心，長(zhǎng)沙 410081）

黑腹果蠅（Drosophilamelanogaster）是一種雙翅目昆蟲，具有生活史短、繁殖迅速、易于人工飼養(yǎng)、染色體少、突變性狀多等優(yōu)點(diǎn)。作為一種常見的模式生物，果蠅在現(xiàn)代生態(tài)學(xué)、群體生物學(xué)、行為學(xué)、系統(tǒng)學(xué)、遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和分子生物學(xué)等研究領(lǐng)域都被廣泛的應(yīng)用［1］，特別是在遺傳學(xué)、胚胎發(fā)育基因調(diào)控的研究中起著非常重要的作用。果蠅心臟發(fā)育過程與人類的心臟發(fā)育過程及調(diào)控機(jī)制有著密切的關(guān)聯(lián)，研究果蠅心臟發(fā)育的調(diào)控機(jī)制能為認(rèn)識(shí)人類先天性心臟病的發(fā)病機(jī)制和治療提供重要的線索［2-3］。

果蠅心臟位于胚胎背中線的表層下，呈線性管狀結(jié)構(gòu)，由具有收縮特性的心肌細(xì)胞和不能收縮的副心肌細(xì)胞組成［4-5］。Svp（seven-up）作為一種孤兒受體基因在類固醇受體家族中存在，它與果蠅復(fù)眼中的光感受器細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞以及心臟前體細(xì)胞等細(xì)胞的分化存在聯(lián)系，并且Svp在心肌細(xì)胞和副心肌細(xì)胞中都具有一定的表達(dá)量［6-7］。果蠅Svp基因定位于染色體3R上，cDNA長(zhǎng)度為846 bp，編碼282個(gè)氨基酸，是心臟發(fā)育的一種標(biāo)記基因，但目前尚無用于科學(xué)研究的商用Svp抗體。本研究采用DNA免疫技術(shù)來快速制備Svp抗體，為研究心臟發(fā)育分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

DNA免疫是指將編碼某種蛋白質(zhì)抗原的重組真核表達(dá)載體直接注射到動(dòng)物體肌肉、皮下或者腹腔等部位，利用宿主的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)合成外源目標(biāo)蛋白抗原，從而誘導(dǎo)特異性的免疫應(yīng)答反應(yīng)［8-9］。DNA免疫的應(yīng)答強(qiáng)度取決于表達(dá)載體表達(dá)抗原的能力以及免疫接種的途徑。DNA導(dǎo)入方式常用肌肉注射，其優(yōu)點(diǎn)有：橫紋肌細(xì)胞中溶酶體和DNA酶的含量較低，使得導(dǎo)入的質(zhì)粒DNA能夠在宿主細(xì)胞中長(zhǎng)久存在；被注射的DNA會(huì)以環(huán)型分子存在于肌肉細(xì)胞中，使得其在宿主細(xì)胞中得不到復(fù)制，也不能整合到宿主細(xì)胞的染色體中；肌肉細(xì)胞外空間與其特有的橫管系統(tǒng)有著直接的通道，當(dāng)DNA質(zhì)粒進(jìn)入肌肉細(xì)胞后以胞吞作用的方式使外源目標(biāo)蛋白抗原內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞［10-12］。前人的研究發(fā)現(xiàn)pCAGGS-P7真核表達(dá)載體具有很高的表達(dá)效率，該載體含有雞的β-actin啟動(dòng)子和巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）增強(qiáng)子，能使下游被插入基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中更高效表達(dá)，同時(shí)質(zhì)粒上具有KpnI、XhoI等多種方便目的基因插入的常見酶切位點(diǎn)［13-14］，故而被廣泛應(yīng)用。本研究通過克隆果蠅Svp基因轉(zhuǎn)錄本NM_169459.2 CDS區(qū)域的284～846 bp的序列片斷，構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒pCAGGS-P7-Svp，運(yùn)用DNA免疫技術(shù)免疫小鼠，分離獲得免疫后血清，制備出多克隆抗體。胚胎免疫熒光以及蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）鑒定檢測(cè)等試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法所制備的Svp多克隆抗體具備特異性，且效價(jià)較高，達(dá)到了果蠅心臟發(fā)育候選基因后續(xù)功能研究的應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、小鼠以及主要試劑

大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)細(xì)胞DH5α、真核表達(dá)載體pCAGGS-P7、野生型黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）W1118為湖南師范大學(xué)心臟發(fā)育研究中心試驗(yàn)室保存；野生型昆明白小鼠（Mus musculus）購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)試驗(yàn)動(dòng)物有限公司；2種限制性內(nèi)切酶XhoI、KpnI以及連接酶均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；高保真酶試劑盒購(gòu)自唯贊公司；DNA純化回收試劑盒、去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京自康為世紀(jì)生物公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

通過NCBI網(wǎng)站搜索果蠅Svp基因的cDNA序列，導(dǎo)入到Primer5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物Sqe1、Resqe1，預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度為563 bp的Svp基因片段，并在引物的5'端上加了同源臂序列位點(diǎn)，使得插入片段在5'和3'端分別帶有與線性化的質(zhì)粒序列相同的同源臂。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。引物如下（下劃線序列為限制性內(nèi)切酶KpnI、XhoI識(shí)別位點(diǎn)）：

Sqe1：5'CTATAGGGCGAATTGGGTACCAGAACA TACCCTTCTTCCCG3'

Re-sqe1：5'ATCGATACCGTCGACCTCGAGTCAC ATCGAAGGCAGATAGG3'

1.3 構(gòu)建pCAGGS-P7-Svp重組表達(dá)質(zhì)粒

首先從W1118野生型黑腹果蠅胚胎中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以 cDNA 為模板用上述 Sqe1、Resqe1為引物，進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增，成功擴(kuò)增出長(zhǎng)為563 bp的Svp基因部分序列。反應(yīng)條件為：95℃ 30 s預(yù)變性1個(gè)循環(huán)，95℃ 30 s 變性，44～60℃ 15 s 復(fù)性，72℃ 60 s延伸32個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min 1 個(gè)循環(huán)，4℃ 保存。所得PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖電泳回收制備，并與用限制性內(nèi)切酶KpnI、XhoI雙酶切回收的約 5 000 bp的pCAGGS-P7線性載體相連接。一步克隆連接體系為：10μL ddH2O + 4μL 5×CEII Buffer + 2 μL ExnaseII +3μL含同源臂的SvpDNA片段 + 1μL線性化載體。37℃恒溫水浴循環(huán)器中連接2 h。

1.4 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化及重組質(zhì)粒的鑒定

將Svp片段與pCAGGS-P7載體連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過氨芐青霉素抗性培養(yǎng)基篩選、挑取單克隆菌落，于液體培養(yǎng)基中37℃、220 r/min培養(yǎng)7 h。以Sqe1、Re-sqe1為引物，菌液為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）驗(yàn)證，再以雙酶切法和測(cè)序法鑒定，確定獲得重組質(zhì)粒為pCAGGS-P7-Svp陽性克隆。

1.5 DNA免疫技術(shù)制備小鼠抗體

用重組質(zhì)粒免疫4～6周齡昆明白小鼠：試驗(yàn)組5只小鼠，分別在其后肢股四頭肌注射700μg/L的重組質(zhì)粒，每只小鼠注射40μL。注射完畢后立即在注射部位兩側(cè)5 mm處用細(xì)胞融合轉(zhuǎn)基因儀（electro cell manipulator）兩端電極電擊2次，讓質(zhì)粒DNA盡快擴(kuò)散均勻。同時(shí)用pCAGGS-P7空載質(zhì)粒DNA等量注射5只小鼠作為對(duì)照組。注射時(shí)間為第0、21、28 天，共免疫3次，每次免疫的劑量與免疫方式相同，于免疫后第35 天取血并分離收集血清，添加1%疊氮化鈉后分裝，儲(chǔ)存于-80℃冰箱備用。

1.6 考馬斯亮藍(lán)染色及Western blot檢測(cè)Svp多克隆抗體效價(jià)

收集過夜果蠅胚胎100枚/管，液氮迅速冷凍后用組織研磨棒充分研磨，加入100μL的RIPA裂解液（RIPA lysis buffer），再添加 1μL蛋白酶抑制劑混勻，低溫離心機(jī)13 000 r/min離心10 min，收集上清液于冰上靜置1 h，充分裂解細(xì)胞。加入25μL上樣緩沖液，沸水煮10 min使蛋白變性，置于冰上冷卻備用。根據(jù)預(yù)測(cè)的目的蛋白的大小配制10%的聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離蛋白質(zhì)，切取部分含有Marker蛋白以及樣品的凝膠放入適量考馬斯亮藍(lán)染色液中，置于水平搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫染色過夜。然后，倒出染色液，加入適量考馬斯亮藍(lán)洗脫液，確保洗脫液可以充分覆蓋凝膠。將其置于水平搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫脫色4～24 h，期間更換洗脫液2～4次，直至藍(lán)色背景基本上全部被脫去，并且蛋白條帶染色效果達(dá)到預(yù)期。完成脫色后，將其用雙蒸水（double distilled water，ddH2O）浸泡，最后掃描得到果蠅全蛋白的考馬斯亮藍(lán)染色圖。使用濕轉(zhuǎn)的方式將電泳后的其他部分凝膠轉(zhuǎn)膜到硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜上，轉(zhuǎn)膜條件為300 mA恒流進(jìn)行。將轉(zhuǎn)完后的膜取出，配制5%脫脂牛奶封閉緩沖液（phosphate buffered saline TWEEN-20，PBST），在室溫下孵育2 h。封閉結(jié)束后，配制不同濃度的Svp多克隆抗體，4℃孵育過夜，然后用PBST以8 min/次漂洗3次。漂洗結(jié)束后加入1:2 000稀釋的鼠二抗在室溫下孵育2 h，PBST搖洗3次，每次8 min。清洗結(jié)束后，利用化學(xué)發(fā)光劑（electrochemiluminescence，ECL）顯影以檢測(cè)抗體的效價(jià)及目的蛋白的表達(dá)水平。

1.7 免疫熒光檢測(cè)Svp多克隆抗體特異性

收集9～15 h野生型黑腹果蠅W1118的胚胎，用毛筆輕輕將果蠅胚胎刷到300目過濾網(wǎng)紗布上，清水漂洗3次。然后將胚胎浸泡于30%次氯酸鈉溶液中約4 min，脫去胚胎表層絨毛膜，在顯微鏡下觀察到胚胎觸角消失即為脫膜成功。脫膜成功后立即用清水漂洗胚胎5次，用配制好的胚胎固定液在室溫?fù)u床孵育20 min以固定胚胎。去除固定液下層液體，加入5 mL甲醇后立即震蕩胚胎1 min脫去卵黃膜，靜置1 min后，去除上層液體，加入1 mL甲醇溶液漂洗胚胎，重復(fù)3次。最后，胚胎保在1 mL甲醇溶液中，-20℃保存。

取50μL固定好的胚胎于一只新離心管中，甲醇漂洗1次；500μL PBST漂洗胚胎3次，每次8 min；500μL 添加了牛血清蛋白的PBST室溫封閉1 h；500μL PBST漂洗胚胎3次，每次8 min；加500μL 1:100 PBST稀釋的Svp一抗和空白血清同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)，4℃搖床孵育過夜；500μL PBST漂洗3次，每次8 min；加500μL按適當(dāng)比例稀釋后的熒光二抗，室溫避光孵育2 h；500μL PBST漂洗胚胎3次，每次8 min；將胚胎轉(zhuǎn)移至載玻片，70%甘油封片，于熒光顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-P7-Svp的構(gòu)建及鑒定

如圖1所示，以Sqe1、Re-sqe1為引物，PCR擴(kuò)增得到約563 bp的Svp條帶，1～5泳道分別為44℃、48℃、52℃、56℃、60℃復(fù)性溫度下的PCR結(jié)果，結(jié)果顯示56℃的復(fù)性溫度擴(kuò)增效果最好。如圖2a 中pCAGGSP7-Svp重組質(zhì)粒示意圖所示，將pCAGGS-P7載體用KpnI、XhoI酶切，得到線性目的載體帶，然后將Svp目的帶連接到pCAGGS-P7質(zhì)粒的KpnI、XhoI酶切位點(diǎn)之間，獲得重組質(zhì)粒pCAGGS-P7-Svp。如圖2b所示，將重組pCAGGS-P7-Svp用KpnI、XhoI進(jìn)行單酶切以及雙酶切驗(yàn)證，在563 bp的Svp片段中也存在著1個(gè)XhoI酶切位點(diǎn)，所以在用XhoI單酶切時(shí)有2條帶，KpnI、XhoI雙酶切時(shí)有3條帶。最后將菌液提取質(zhì)粒測(cè)序，進(jìn)行核苷酸測(cè)序比對(duì)，結(jié)果表明pCAGGS-P7-Svp重組質(zhì)粒的Svp序列與NCBI上Svp序列一致。以上結(jié)果表明pCAGGS-P7-Svp重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 Svp基因 PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Svp gene PCR amplification electropherogram

2.2 Western blot鑒定Svp多克隆抗體效價(jià)

圖2 pCAGGS-P7-Svp 重組質(zhì)粒示意圖和酶切圖Fig.2 Schematic diagram of pCAGGS-P7-Svp recombinant plasmid and enzyme digestion result

收集野生型果蠅胚胎，提取總蛋白。如圖3a為考馬斯亮藍(lán)染色的果蠅總蛋白圖。分別以1:100，1:200，1:400，1:600，1:800比例稀釋后的Svp多克隆抗體作為一抗進(jìn)行了Western blot檢測(cè)，結(jié)果如圖3b所示。Svp多克隆抗體在各稀釋比例下都出現(xiàn)了一條76 kD的特異性條帶，說明免疫后的小鼠血清中產(chǎn)生了效價(jià)高的Svp蛋白的特異性抗體。而用免疫前血清以1:100稀釋作為一抗進(jìn)行檢測(cè)，未見特異性條帶。說明免疫后的小鼠血清中產(chǎn)生了Svp蛋白的特異性抗體，該抗體的特異性和敏感性良好，可以滿足今后試驗(yàn)的需求。

2.3 Svp多克隆抗體免疫熒光鑒定

用野生型黑腹果蠅胚胎進(jìn)行免疫熒光試驗(yàn)，對(duì)照組為免疫前血清的免疫熒光胚胎染色，試驗(yàn)組為用Svp多克隆抗體對(duì)9～15 h的野生型果蠅胚胎染色。對(duì)比Flybase數(shù)據(jù)，已知在理論上Svp蛋白會(huì)在果蠅胚胎背腹軸中線部位的部分心肌細(xì)胞和副心肌細(xì)胞表達(dá)，本試驗(yàn)結(jié)果顯示的Svp表達(dá)圖式也在背中線心臟細(xì)胞中表達(dá)，表明本研究制備的Svp多克隆抗體效價(jià)高。

圖3 Western blot鑒定抗體效價(jià)Fig.3 Identification of antibody by Western blot

圖4 Svp多克隆抗體免疫熒光鑒定（×200）Fig.4 Immunofluorescence identification of Svp polyclonal antibody (×200)

3 討論

Svp作為一個(gè)果蠅心臟發(fā)育的標(biāo)記基因，其特異性抗體對(duì)果蠅心臟發(fā)育研究有著重要作用。但鑒于目前無Svp的商用抗體，所以本研究采用DNA免疫技術(shù)，在降低成本的同時(shí)制備出高效價(jià)、特異性好的Svp抗體。將基因重組技術(shù)獲得的編碼Svp抗原蛋白的外源DNA直接注射進(jìn)小鼠肌肉，并電擊導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，使外源DNA在宿主細(xì)胞中表達(dá)合成免疫原性蛋白。在1個(gè)月內(nèi)多次注射，加強(qiáng)免疫應(yīng)答，分離并收集免疫后血清制備好抗體。然后用Western blot試驗(yàn)以及免疫熒光試驗(yàn)鑒定血清的效價(jià)和特異性，結(jié)果表明制備的Svp多克隆抗體能與果蠅體內(nèi)表達(dá)的Svp蛋白結(jié)合，且特異性較好，這為今后進(jìn)一步研究Svp基因的生物學(xué)功能提供了重要的研究材料。

相較于傳統(tǒng)免疫技術(shù)而言，DNA免疫是通過直接引起機(jī)體對(duì)外源蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)的免疫技術(shù)。DNA免疫能在自身細(xì)胞中合成外源性蛋白，使抗原在活體內(nèi)產(chǎn)生，在一些結(jié)構(gòu)復(fù)雜或難以表達(dá)的蛋白（如膜蛋白）抗體的制備過程中能有效節(jié)省免疫原的生產(chǎn)和純化時(shí)間，且其表達(dá)出的蛋白結(jié)構(gòu)更加接近于天然分子，有助于生產(chǎn)高親和力的抗體［15-16］。同時(shí)，這種免疫技術(shù)采用肌肉注射，進(jìn)入體內(nèi)的微量抗原一旦被肌細(xì)胞攝取，存在的半衰期延長(zhǎng)，不斷合成的外源蛋白持續(xù)性地刺激免疫系統(tǒng)，進(jìn)而能加強(qiáng)免疫細(xì)胞的記憶持久性。最后，DNA免疫操作方法簡(jiǎn)便，僅需在構(gòu)建高效表達(dá)質(zhì)粒后直接接種免疫小鼠，不需要進(jìn)行抗原提取和蛋白純化步驟［17-18］，進(jìn)而時(shí)間會(huì)更短、價(jià)格更低廉。而相比于單克隆抗體而言，本研究采用的DNA免疫技術(shù)制備的多克隆抗體能識(shí)別任一抗原上的多個(gè)表位，有助于放大低表達(dá)水平的靶蛋白信號(hào)，因此在免疫檢測(cè)中，可以識(shí)別更多的抗原，也較少受到抗原構(gòu)象變化的影響［19-20］。因此，在相同條件下，利用多克隆抗體可以提高檢測(cè)的靈敏度，從而在Western blot等檢測(cè)試驗(yàn)中得到更好的結(jié)果。