關(guān)帝山林區(qū)不同退化程度草地群落類型土壤細(xì)菌群落組成及生物多樣性研究

韓曉麗，黃春國，張蕓香，郭晉平*

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) a.林學(xué)院；b.農(nóng)學(xué)院，太谷 030801）

關(guān)帝山林區(qū)位于山西省境內(nèi)的呂梁山脈中段，屬于典型暖溫帶大陸性季風(fēng)氣候區(qū)［1］，區(qū)域內(nèi)植物種質(zhì)資源多樣，森林覆蓋率極高。其中，華北落葉松（Larix principis-rapprechtii）和云杉（Picea asperata）等天然次生林集中分布，而以山蒿（Artemisia brachyloba）、中亞苔草（Carex stenophylloides）、蒲公英（Taraxacum mongolicum）、車前草（Plantago asiatica）、東方草莓（Fragaria orientalis）及禾草科（Gramineae）等為主要優(yōu)勢(shì)植物種的草地植被群落類型也星羅棋布［2-3］，其在保持土壤、調(diào)節(jié)氣候、涵養(yǎng)水源及保護(hù)生物多樣性等方面均發(fā)揮關(guān)鍵作用［4-5］。由于受氣候變化、環(huán)境因子及人畜干擾等因素影響，該區(qū)域內(nèi)草地植被群落存在不同程度的退化現(xiàn)象，導(dǎo)致其質(zhì)量衰退、群落多樣性降低、生物生產(chǎn)力下降和水土流失的發(fā)生，直接或間接影響植被群落生態(tài)系統(tǒng)多樣性和生態(tài)環(huán)境服務(wù)功能，給當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)系統(tǒng)平衡和經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展造成了嚴(yán)重威脅［6-7］。

地上植物群落、土壤微生物群落及二者間耦合互作均對(duì)山地草地生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能產(chǎn)生重要影響［8］，且土壤微生物是草地生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)移的主要參與者［9］，常作為評(píng)價(jià)草地生態(tài)系統(tǒng)土壤質(zhì)量狀況、草地發(fā)育與演替的重要生物學(xué)指標(biāo)［10］。與真菌、放線菌和土壤原生動(dòng)物等土壤微生物相比，土壤細(xì)菌是第一大重要類群，約占到土壤微生物總量的70%～90%。土壤細(xì)菌在生物地球化學(xué)循環(huán)過程中發(fā)揮著重要作用［11］：驅(qū)動(dòng)和調(diào)控土壤中各養(yǎng)分元素的礦化、降解和轉(zhuǎn)化等生物學(xué)過程，對(duì)植物生長(zhǎng)和生物產(chǎn)量也產(chǎn)生重要影響［12］；直接參與土壤中氮素的氨化、硝化、反硝化和生物固持等生物化學(xué)過程［13］，對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)降解和土壤碳循環(huán)過程也發(fā)揮關(guān)鍵作用［14］。因而，土壤細(xì)菌群落組成及生物多樣性成為諸多學(xué)者關(guān)注和研究的焦點(diǎn)［15］。

Biolog-ECO微平板檢測(cè)法［16］、變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）指紋圖譜技術(shù)［17］和磷脂脂肪酸（phosphohpids fatty acids，PLFA）生物標(biāo)記法［18］等技術(shù)在鑒定土壤細(xì)菌群落組成、功能及生物多樣性等方面已得到廣泛應(yīng)用。而高通量測(cè)序技術(shù)［19］以其高通量、低成本、準(zhǔn)確率高和數(shù)據(jù)信息量大等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于鑒定和分析土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及生物多樣性。因此，本研究選擇關(guān)帝山林區(qū)3種典型退化草地植被群落類型為研究對(duì)象，采用高通量測(cè)序技術(shù)分析不同退化程度草地土壤細(xì)菌群落組成及生物多樣性的空間分布格局及差異性特征，為闡明土壤細(xì)菌群落在草地生態(tài)系統(tǒng)土壤碳、氮等養(yǎng)分代謝循環(huán)過程中的重要調(diào)控機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)揭示關(guān)帝山林區(qū)草地生態(tài)系統(tǒng)地下部分的生物與環(huán)境因子格局及生態(tài)學(xué)過程起到了重要的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 樣地概況

樣地位于呂梁山脈中段關(guān)帝山林區(qū)的山西省龐泉溝國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)，該區(qū)域?qū)儆诘湫团瘻貛Т箨懶约撅L(fēng)氣候，植物資源豐富，生物多樣性較高，年平均氣溫4.2℃，無霜期100～125 d，年降雨量822.6 mm，且集中于7～9月，海拔梯度1 600～2 831 m。土壤類型呈垂直分布帶，自下而上依次為：黃綿土、山地褐土、山地淋溶褐土、山地棕壤和亞高山草甸土。選取3種具代表性的典型草地群落類型作為研究對(duì)象，各類型草地存在不同程度退化，根據(jù)張金屯［6］山西高原草地退化分級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合牲畜放牧、人類干擾及植物種類組成和土壤狀況，將退化系列劃分為輕度退化草地（light degrade grass land，LDG）、中度退化草地（medium degrade grass land，MDG）和重度退化草地（heavy degrade grass land，HDG）。各個(gè)樣地的詳細(xì)的特征如表1所示。

同時(shí)，在每種草地群落類型樣地內(nèi)分別設(shè)置3個(gè)2 m×2 m的樣方，樣方間距大于10 m。采用混合多點(diǎn)取樣法分別采集0～10 cm（A層）和10～20 cm（B層）土壤樣品，并進(jìn)行過篩（2 mm）去除動(dòng)植物殘?bào)w和雜質(zhì)等。采用四分法留取混合土樣約10 g，然后使用50 mL離心管裝封并放入液氮及冰盒中攜帶回實(shí)驗(yàn)室，放置于-80℃冰箱內(nèi)以備提取土壤DNA。

1.2 細(xì)菌16S rRNA基因測(cè)序

土壤細(xì)菌群落組成及生物多樣性采用第二代高通量測(cè)序平臺(tái)（Illumina Miseq）進(jìn)行測(cè)序分析。其中，PCR擴(kuò)增引物為：520F（5'-GCACCTAAYTGGGY-DTAAAGNG-3'）和 802R（5'-TACNVGGGTATCTAATCC-3'）。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：2μL的純化DNA，5μL的Q5反應(yīng)緩沖液（5×），5μL的Q5高保真GC緩沖液（5×），0.25μL的Q5高保真DNA聚合酶（5 U/μL），2μL的dNTPs液（2.5 mmol/L），上游引物和下游引物（10μmol/L）各1μL，8.75μL的去離子水。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性2 min；98℃變性15 s；55℃退火30 s；72℃延伸 30 s，27個(gè)循環(huán)；最后 72℃延伸 5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在4℃保存，并用Agencourt AMPure Beads （Beckman Coulter，Indianapolis，IN，USA）試劑盒純化處理，使用PicoGreen dsDNA Assay Kit（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）檢測(cè)試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量分析。Illumina MiSeq高通量測(cè)序和分析委托上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行。

表1 不同退化程度草地群落類型主要特征Tab.1 Main features of different degeneration grassland community types

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

測(cè)序序列數(shù)據(jù)分析主要采用QIIME和R軟件包（v3.6.3）進(jìn)行，不同草地群落類型的土壤細(xì)菌群落組成聚類熱圖分析和α多樣性（Chao1和Shannon）均根據(jù)操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）矩陣列表中各樣本物種相對(duì)豐度計(jì)算獲得，使用SPSS 20.0（SPSS Inc.，Somers，NY，USA）軟件對(duì)細(xì)菌群落生物多樣性及優(yōu)勢(shì)菌群相對(duì)豐度進(jìn)行方差分析（analysis of variance，ANOVA）和多重比較，采用95%置信水平上Turkey-HSD檢驗(yàn)進(jìn)行差異性顯著的認(rèn)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤細(xì)菌群落α多樣性

不同退化程度草地群落類型和土層土壤細(xì)菌群落生物多樣性存在顯著性差異（圖1）。其中，重度退化的苔草草地群落類型（Carex stenophylloidesgrassland，CS）表層土壤（0～10 cm）細(xì)菌群落α多樣性（Chao1和Shannon指數(shù)）最高，輕度退化的蒿草草地群落類型（Kobresia grassland，KG）底層土壤（10～20 cm）細(xì)菌群落α多樣性最低；同一草地群落類型不同土層之間土壤細(xì)菌群落α多樣性也差異性顯著（Shannon指數(shù)），輕度退化的KG和重度退化的CS表層土壤（0～10 cm）細(xì)菌群落α多樣性顯著高于底層土壤（10～20 cm），而中度退化的沙棘灌叢草地群落類型（Hippophae rhamnoidesshrubs grassland，HR）土壤細(xì)菌群落α多樣性底層土壤（10～20 cm）顯著高于表層土壤（0～10 cm）。

圖1 不同草地類型和土層土壤細(xì)菌群落α多樣性分析Fig.1 Soil bacterial community alpha diversity among different grassland community types and soil layers

2.2 土壤細(xì)菌群落組成及優(yōu)勢(shì)菌群

不同退化程度草地群落類型和土層土壤細(xì)菌群落組成及優(yōu)勢(shì)菌群相對(duì)豐度含量存在顯著性差異。由圖2可知：相對(duì)豐度含量排名前十的細(xì)菌門中，變形菌門（Proteobacteria）和藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）在輕度退化的KG底層土壤（10～20 cm）中相對(duì)豐度含量最高，顯著高于其他草地群落類型和土層，屬于明顯的優(yōu)勢(shì)菌群；浮霉菌門（Planctomycetes）和迷蹤菌門（Elusimicrobia）在輕度退化的KG表層土壤（0～10 cm）中相對(duì)豐度含量最高；芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）在重度退化的CS底層土壤（10～20 cm）中相對(duì)豐度含量最高；酸桿菌門（Acidobacteria）在輕度退化的KG表層土壤（0～10 cm）和中度退化的HR底層土壤（10～20 cm）中相對(duì)豐度含量最高，且二者之間差異性不顯著；放線菌門（Actinobacteria）在中度退化的HR表層土壤（0～10 cm）中相對(duì)豐度含量最高；硝化螺旋菌門（Nitrospirae）在KG表層土壤（0～10 cm）、HR底層土壤（10～20 cm）和CS底層土壤（10～20 cm）中相對(duì)豐度含量最高，且相互之間差異性不顯著；綠彎菌門（Chloroflexi）在重度退化的CS表層土壤（0～10 cm）中相對(duì)豐度含量最高，顯著高于其它草地群落類型和土層，屬于明顯的優(yōu)勢(shì)菌群；擬桿菌門（Bacteroidetes）在KG表層土壤（0～10 cm）和HR表層土壤（0～10 cm）中相對(duì)豐度含量最高，且二者之間差異性不顯著。

圖2 不同草地類型和土層土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群相對(duì)豐度含量分析Fig.2 Relative abundance of soil bacterial dominant phyla among different grassland community types and soil layers

由表2可知：相對(duì)豐度含量排名前十的細(xì)菌屬中，涅瓦河菌屬（Nevskia）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、乳酸球菌屬（Lactococcus）、假諾卡氏菌屬（Pseudonocardia）和無色桿菌屬（Achromobacter）6個(gè)屬，在輕度退化的KG底層土壤（10～20 cm）中相對(duì)豐度含量最高，顯著高于其它草地群落類型和土層，屬于明顯的優(yōu)勢(shì)菌群；紅游動(dòng)菌屬（Rhodoplanes）在中度退化的HR底層土壤（10～20 cm）中相對(duì)豐度含量最高；節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）在重度退化的CS表層土壤（0～10 cm）中相對(duì)豐度含量最高，顯著高于其它草地群落類型和土層，屬于明顯的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬；浮霉?fàn)罹鷮伲≒lanctomyces）在輕度退化的KG表層土壤（0～10 cm）中相對(duì)豐度含量最高，且與HR表層土壤（0～10 cm）中相對(duì)豐度含量差異不顯著；小月菌屬（Microlunatus）在輕度退化的KG底層土壤（10～20 cm）和重度退化的CS表層土壤（0～10 cm）中相對(duì)豐度含量最高，且二者之間差異性不顯著。

表2 不同草地類型和土層土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)豐度含量Tab.2 Relative abundance of soil bacterial dominant genera among different grassland community types and soil layers

同時(shí)，根據(jù)不同草地群落類型和土層土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬聚類和熱圖分析可知（圖3），6個(gè)樣本聚類為兩大類群，即：不同草地群落類型的表層土壤（0～10 cm）和底層土壤（10～20 cm）類群。輕度退化的KG和中度退化的HR在同一土層深度土壤中細(xì)菌群落組成相似度較高，但不同土層深度之間土壤細(xì)菌群落組成差異性顯著。重度退化的CS與輕度退化的KG、中度退化的HR相比較，在不同土層深度土壤中細(xì)菌群落組成差異較大，且不同土層深度之間差異性顯著。

3 討論

土壤細(xì)菌是草地生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)的主要驅(qū)動(dòng)因子，其群落組成及生物多樣性對(duì)土壤肥力、理化性質(zhì)及土壤健康狀況等產(chǎn)生重要影響［20］。本研究結(jié)果表明，不同退化程度草地群落的土壤細(xì)菌α多樣性存在顯著性差異，且土層深度因素也顯著影響土壤細(xì)菌的α多樣性（圖1）。Tardy等［21］的研究表明土壤細(xì)菌群落生物多樣性決定著土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其生態(tài)服務(wù)功能。此外，F(xiàn)ierer等［22］的研究揭示了土壤細(xì)菌群落對(duì)土壤環(huán)境中各生態(tài)因子也產(chǎn)生了相應(yīng)作用。土壤細(xì)菌群落受氣候變化、干擾程度、草地類型及植物群落組成等因素的影響，會(huì)直接參與土壤有機(jī)質(zhì)的形成和降解過程，對(duì)土壤中有機(jī)質(zhì)含量產(chǎn)生重要影響［23-24］。重度退化的苔草草地表層土壤細(xì)菌α多樣性最高（圖1），其高豐度含量的節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）（表2）具有很強(qiáng)的抗旱性和耐餓性，可降解土壤中的有機(jī)化合物質(zhì)，使得土壤有機(jī)質(zhì)含量降低［25］，從而引起土壤退化及草地生態(tài)系統(tǒng)退化。同時(shí)，牲畜放牧［26］和人為干擾［27］等外因會(huì)顯著影響和改變土壤細(xì)菌種群數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)及生物多樣性，引起土壤硬度和有機(jī)質(zhì)含量等土壤理化特性發(fā)生變化，造成土壤退化［20］。

圖3 不同草地群落類型和土層土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬聚類熱圖Fig.3 Heat map and cluster of soil bacterial dominant genera among different grassland community types and soil layers

“缺氮”是退化草地土壤環(huán)境養(yǎng)分失衡的重要表現(xiàn)形式之一，其嚴(yán)重制約著退化草地生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)和平衡［9］。而土壤細(xì)菌直接參與土壤氮素養(yǎng)分的循環(huán)與轉(zhuǎn)化過程，決定著土壤肥力的高低及健康狀況［28］，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和群落演替產(chǎn)生重要影響［29］。本研究結(jié)果相對(duì)豐度排名前十的土壤細(xì)菌門（屬）中多數(shù)是土壤反硝化細(xì)菌［綠彎菌門（Chloroflexi）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）等］，其相對(duì)豐度含量隨草地退化程度增加而顯著增高（圖2和表2），其主導(dǎo)的反硝化作用易引起土壤中氮素養(yǎng)分流失，造成土壤“缺氮”和加速草地退化［30-31］。而芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）屬于革蘭氏陰性細(xì)菌，能利用和降解土壤中的主要碳源物質(zhì)，可顯著降低土壤有機(jī)質(zhì)含量［32］，其相對(duì)豐度含量在重度退化的苔草草地底層土壤中最高，表明由土壤細(xì)菌活動(dòng)導(dǎo)致土壤有機(jī)質(zhì)含量降低可能是引起關(guān)帝山林區(qū)草地退化的主要原因之一。

同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)土層深度因素對(duì)關(guān)帝山林區(qū)草地土壤細(xì)菌群落組成及生物多樣性影響差異性顯著，這與前人研究結(jié)果一致，主要是由于土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分含量等生態(tài)因子隨土層深度增加而顯著降低的緣故［33］。