湯姆青霉的抗菌活性研究

趙文婧，翟飛紅，吳麗華，燕平梅，李 娜

（太原師范學(xué)院生物系，晉中 030619）

青霉（Penicillium）是自然界中一個非常重要的真菌類群，廣泛地存在于自然界中，空氣、土壤和腐爛的物質(zhì)上均可發(fā)現(xiàn)其存在。它與人類的關(guān)系十分密切，其發(fā)酵產(chǎn)物等均可以用于抗生素的制備。眾所周知，青霉素主要是由產(chǎn)黃青霉（P.chrysogenum）產(chǎn)生的，它是最早被發(fā)現(xiàn)、最先被提純并最早應(yīng)用于臨床的抗生素。灰黃青霉（P.griseofulvum）產(chǎn)生的灰黃霉素是抑制諸如腳蘚之類的真菌性皮膚病最好的抗生素。本實驗室從山西省汾陽混交林土壤中分離得到了一株湯姆青霉PT95菌株，該菌株能形成大量堅硬、沙粒狀的微菌核，并能在菌核內(nèi)積累類胡蘿卜素。關(guān)于湯姆青霉PT95（P.thomiiPT95）菌株對氧脅迫的細(xì)胞響應(yīng)前期已經(jīng)做了詳細(xì)的研究［1］，研究發(fā)現(xiàn)PT95菌株在不良環(huán)境下可以分化形成菌核，同時啟動體內(nèi)的各種抗氧化機(jī)制來抵御不良環(huán)境。如前所述，抗生素的制備很多都是從青霉菌代謝產(chǎn)物中提取出的，李浩華等［2］在海洋真菌湯姆青霉FS77（P.thomiiFS77）中做了相關(guān)的抗菌活性研究，發(fā)現(xiàn)P.thomiiFS77菌株的發(fā)酵液中存在抗菌物質(zhì)［2］。為了證實青霉PT95菌株是否具有一定的抗菌性能，本文將采用牛津杯法和濾紙片法試驗對湯姆青霉PT95抑菌活性進(jìn)行研究，從7種待測菌種中篩選出具有最佳抑菌效果的菌種，并以此作為后續(xù)研究的對象，進(jìn)行最小抑菌質(zhì)量濃度的測定以及培養(yǎng)基的優(yōu)化，為湯姆青霉PT95在抗菌方面的進(jìn)一步研究及其應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

湯姆青霉PT95保存于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agarose，PDA）培養(yǎng)基上。抑菌試驗指示菌株大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）、黑根霉（Rhizopus nigricans）均保存于太原師范學(xué)院微生物學(xué)實驗室。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 液體培養(yǎng)基

本試驗所用的液體培養(yǎng)基：乳酸菌MRS液體（lactobacilli DeMan-Rogosa-Sharpe broth，MRS broth）培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖液體（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基。

1.2.2 固體培養(yǎng)基

本試驗所用的固體培養(yǎng)基：MRS固體培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

優(yōu)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方：葡萄糖10.00 g/L，蛋白胨5.00 g/L，MgSO4·7H2O 0.20 g/L，NaCl 3.00 g/L，瓊脂 20.00 g/L，pH7.0～7.2［3］。

1.3 研究方法

1.3.1 菌株的培養(yǎng)及樣品的制備

1.3.1.1 湯姆青霉PT95發(fā)酵液制備

用接種環(huán)挑取一環(huán)湯姆青霉PT95并接種于100 mL PDB培養(yǎng)基中，其中試驗組中加入濃度為0.03 mmol/mL的環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP），對照組中不加 cAMP，分別置于25℃搖床中200 r/min振蕩培養(yǎng)5 d。在超凈臺無菌操作過濾掉菌絲體［4］，留湯姆青霉PT95發(fā)酵液備用。

1.3.1.2 指示菌株的活化

取植物乳桿菌、德氏乳桿菌保存液各100μL，分別接種于50 mL MRS液體培養(yǎng)基中；取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌保存液各100μL分別接種于50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中；挑取枯草芽孢桿菌接種于50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中。將上述接好菌的培養(yǎng)基全部置于37℃搖床中150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

挑取適量黑根霉菌株接種于50 mL PDB培養(yǎng)基中，置于25℃搖床中150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

挑取適量釀酒酵母菌株接種于50 mL PDB培養(yǎng)基中，置于30℃搖床中150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

1.3.2 最佳抑菌效果菌株的篩選

1.3.2.1 濾紙片法檢測發(fā)酵液的抑菌活性

將直徑為1.2 cm的濾紙圓片高壓蒸汽滅菌后備用，用滅菌鑷子取滅菌濾紙片分別放入發(fā)酵上清液與無菌水中浸泡2 h備用。

吸取200μL活化好的各指示菌株分別放置于無菌培養(yǎng)皿中，待滅菌好的培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時，再取25 mL不同的培養(yǎng)基倒入相應(yīng)加入指示菌株的培養(yǎng)皿中。待平板凝固好后，取上述濾紙片（以無液體滴下為準(zhǔn)）放置于培養(yǎng)基上，每個平板放4個濾紙片（其中3個加發(fā)酵液，1個加無菌水），4個濾紙片間距大致相等，在各指示菌株的最適培養(yǎng)溫度下分別培養(yǎng) 12～24 h。

1.3.2.2 牛津杯法檢測發(fā)酵液的抑菌活性

將若干牛津杯置于小燒杯中滅菌備用。吸取200μL活化好的各指示菌株分別置于冷卻后的無菌培養(yǎng)皿中，待滅菌好的培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時，再取25 mL不同的培養(yǎng)基分別倒入相應(yīng)加入指示菌株的培養(yǎng)皿中。待平板凝固好后，用滅菌鑷子夾取牛津杯放于培養(yǎng)基上，每個平板放4個牛津杯（其中3個加發(fā)酵液，1個加無菌水），4個牛津杯間距大致相等，然后吸取200μL發(fā)酵液或無菌水加入牛津杯中，在各指示菌株的最適培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)12～24 h。

依據(jù)抑菌率大小，從上述供試的7種指示菌中篩選出具有最佳抑菌效果的菌株，并將其作為后續(xù)試驗的菌種。

抑菌率=（抑菌圈直徑-牛津杯直徑/濾紙片直徑）/抑菌圈直徑×100%。

1.3.3 最小抑菌質(zhì)量濃度的測定

將湯姆青霉PT95的發(fā)酵液在50℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至原體積的1/5，然后加入95%乙醇進(jìn)行沉淀，使發(fā)酵液最終濃度為75%，4℃冰箱放置2 d后離心，棄去沉淀，重復(fù)1次上述步驟，取上清液在50℃下濃縮成浸膏，冷卻干燥成凍干粉備用［5］。

準(zhǔn)確稱取一定量的發(fā)酵液凍干粉用2.5%的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）分別配制成質(zhì)量濃度為5.12、2.56、1.28、0.64、0.32、0.16 mg/mL的樣品溶液［6-7］，并采用牛津杯法計算抑菌率來確定最小抑菌質(zhì)量濃度。

1.3.4 培養(yǎng)基的優(yōu)化

根據(jù)最佳抑菌效果菌種的篩選結(jié)果，在優(yōu)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基上對碳源、氮源和無機(jī)鹽進(jìn)行篩選，通過測定抑菌率的大小對培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.4.1 最適碳源的篩選

分別以可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、麥芽糖代替優(yōu)化基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基中的葡萄糖作為唯一碳源［8］，用篩選的高抑菌活性菌株制備液體菌種，采用牛津杯法計算抑菌率的大小。

1.3.4.2 最適氮源的篩選

分別以尿素、檸檬酸銨、氯化銨、磷酸二氫銨、硝酸銨、酵母膏替代優(yōu)化基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基中的蛋白胨作為唯一氮源。用篩選的高抑菌活性菌株制備液體菌種，采用牛津杯法計算抑菌率的大小。

1.3.4.3 無機(jī)鹽的篩選

在優(yōu)化基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基中，分別加入KH2PO4、FeSO4、KH2PO4+FeSO4，加入的量均占其培養(yǎng)基總量的0.05%［9-10］，其他組分均相同，將篩選的高抑菌活性菌株制備液體菌種，采用牛津杯法計算抑菌率的大小。

1.3.4.4 最適MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度的篩選

在優(yōu)化的基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)MgSO4·7H2O的質(zhì)量濃度分別為0.10、0.20、0.30、0.40 g/L，其他成分保持一致［11］，將篩選的高抑菌活性菌株制備液體菌種，采用牛津杯法計算抑菌率的大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳抑菌效果菌株的篩選

采用濾紙片法和牛津杯法，利用十字交叉法測量抑菌圈的直徑，通過抑菌率公式計算抑菌率，根據(jù)抑菌率確定最佳抑菌效果的菌株。

從表1可以看出，枯草芽孢桿菌可以作為具有最佳抑菌效果的指示菌株，其抑菌率可以達(dá)到56.37%。湯姆青霉PT95發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌、釀酒酵母以及大腸桿菌均有抑菌活性，但是均低于對枯草芽孢桿菌的抑菌活性。從表中數(shù)據(jù)可以初步推斷湯姆青霉PT95發(fā)酵液對德氏乳桿菌與植物乳桿菌可能有殺菌作用，對根霉沒有抑制作用。

從表1和表2可以看到，加了cAMP的試驗組與不加cAMP的對照組的湯姆青霉PT95發(fā)酵液結(jié)果基本相同，所以之后的一系列試驗均采取不加cAMP的湯姆青霉PT95發(fā)酵液作為后續(xù)研究的對象。

表1 發(fā)酵液對不同指示菌株抑菌率的分析（%）Tab.1 Analysis of bacteriostatic rate of fermentation broth to different indicator strains (%)

表2 發(fā)酵液對不同指示菌株的抑菌圈直徑（cm）Tab.2 Diameter of bacteriostatic circle of fermentation liquid to different indicator strains (cm)

圖1為采用牛津杯法和濾紙片法得到的對枯草芽孢桿菌的抑菌圖，其中圖1a和圖1d是沒有添加cAMP的抑菌圖，圖1b和圖1c是添加了cAMP的抑菌圖。

根據(jù)圖1培養(yǎng)皿中菌落形成情況以及抑菌圈的直徑進(jìn)行判斷可知，牛津杯法較濾紙片法更適合抑菌試驗。牛津杯法可以更好地控制湯姆青霉PT95菌株發(fā)酵濾液的量，抑菌圈更接近圓形，更便于測量，能盡可能地減小試驗誤差。

圖1 兩種方法測定有無cAMP的發(fā)酵液對枯草芽孢桿菌的抑菌作用Fig.1 Two methods to determine the bacteriostatic effect of the fermentation liquid with or without cAMP on Bacillus subtilis

2.2 最小抑菌質(zhì)量濃度的測定

對湯姆青霉PT95發(fā)酵液進(jìn)行蒸發(fā)濃縮和冷凍干燥，得到的凍干粉為黏稠狀似膠質(zhì)的棕黃色固體。對凍干粉進(jìn)行最小抑菌質(zhì)量濃度的試驗，從表3中可以看出，湯姆青霉PT95發(fā)酵液對枯草芽孢桿菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為0.64 mg/mL。

2.3 培養(yǎng)基的優(yōu)化

通過上述試驗可確定枯草芽孢桿菌為具有最佳抑菌效果的菌種，選取其作為后續(xù)優(yōu)化試驗的菌株。在優(yōu)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基上首先進(jìn)行了抑菌試驗，枯草芽孢桿菌的抑菌率達(dá)到65.40%，接著進(jìn)行了最適碳源、氮源、無機(jī)鹽的篩選。

2.3.1 最適碳源的篩選

用供試碳源代替優(yōu)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，保持碳含量一致。供試碳源有可溶性淀粉、蔗糖、乳糖和麥芽糖4種，結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出，不同碳源對湯姆青霉PT95菌株抑制枯草芽孢桿菌的生長均具有一定的影響。在其他組分均相同的情況下，以麥芽糖為碳源時的抑菌率最高，且抑菌率可達(dá)70%，高于優(yōu)化基礎(chǔ)培養(yǎng)的抑菌率，其次為乳糖、蔗糖，而抑菌率最低的為可溶性淀粉。所以當(dāng)以可溶性淀粉為碳源時，湯姆青霉PT95菌株對枯草芽孢桿菌的抑菌效果最差。說明湯姆青霉PT95可以有效利用麥芽糖這一碳源產(chǎn)生一些抑菌活性物質(zhì)，故可選取其作為最適碳源。

表3 發(fā)酵液提取樣品對枯草芽孢桿菌的最小抑菌質(zhì)量濃度測定（mg/mL）Tab.3 Determination of the minimum inhibitory concentration of the sample extracted from fermentation filtrate to Bacillus subtilis（mg/mL）

圖2 最適碳源的篩選Fig.2 Selection of the most suitable carbon source

2.3.2 最適氮源的篩選

分別用磷酸二氫銨、尿素、檸檬酸銨、氯化銨、硝酸銨、酵母膏替代優(yōu)化基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基中的蛋白胨作為唯一氮源。

磷酸二氫銨、尿素、檸檬酸銨、氯化銨為供試氮源時，枯草芽孢桿菌幾乎不生長，說明枯草芽孢桿菌不能有效利用磷酸二氫銨、尿素、檸檬酸銨、氯化銨等無機(jī)氮來進(jìn)行自身生長［11-14］。而以酵母膏為供試氮源時，枯草芽孢桿菌菌落生長均勻，但在牛津杯添加湯姆青霉PT95菌株發(fā)酵液后抑菌效果不是很明顯。這表明改變優(yōu)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源并不能促進(jìn)枯草芽孢桿菌的生長或提高抑菌率，因此優(yōu)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨即為最適氮源成分。

2.3.3 無機(jī)鹽的篩選

在優(yōu)化基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基中分別加入KH2PO4、FeSO4、KH2PO4+FeSO4，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在加入無機(jī)鹽的培養(yǎng)基中枯草芽孢桿菌長勢較差，這說明枯草芽孢桿菌不能有效利用這些無機(jī)鹽進(jìn)行自身的生長繁殖，因此優(yōu)化基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基中無需加入無機(jī)鹽來提高抑菌率。

2.3.4 最適MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度的篩選

在優(yōu)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，湯姆青霉PT95菌株的抑菌率可以達(dá)到65.4%。在優(yōu)化培養(yǎng)基上分別添加不同質(zhì)量濃度的MgSO4·7H2O，如圖3所示。從圖3可得知，MgSO4·7H2O的質(zhì)量濃度在0.30 g/L的情況下抑菌率最高，可以達(dá)到67.57%，隨著MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度的提高，其抑菌率開始下降，所以最適的MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度為0.30 g/L。

圖3 MgSO4·7H2O最適質(zhì)量濃度的篩選Fig.3 Selection of the optimum concentration of MgSO4·7H2O

3 討論

王書錦等［15］從黃海、渤海、遼寧近海地區(qū)分離得到海洋真菌508株，已鑒定出20多株，主要為青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）、鐮刀菌屬（Fusarium）等的菌種，其中10%以上菌種的發(fā)酵產(chǎn)物具有抗細(xì)菌或抗真菌的生物活性；黃菁菁等［16］從福建廈門、晉江及詔安沿海地區(qū)采集到的29個樣品中分離到390株真菌，有63.3%的菌株表現(xiàn)出了對一種或幾種指示菌具有拮抗作用，通過形態(tài)鑒定發(fā)現(xiàn)，這些菌株以青霉屬和曲霉屬為主。

微生物在其生命過程中產(chǎn)生的天然代謝產(chǎn)物是天然抗生素的重要來源，它具有在低濃度下選擇性地抑制或殺死它種生物或腫瘤細(xì)胞的能力。隨著抗生素的發(fā)展和應(yīng)用，近年來倍受人們關(guān)注的兩個問題為：1）細(xì)菌及真菌耐藥性的增加致使抗生素的療效有所下降；2）一些不致病的菌成為條件致病菌，在臨床上有一定的威脅［13］。微生態(tài)活菌制劑主要以乳酸菌、嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌、糞腸球菌為主，不僅具備與抗生素相似的調(diào)節(jié)腸道等功能，且不產(chǎn)生耐藥性、不傷身體，具有促生長之功效，是抗生素的理想替代者。而湯姆青霉PT95菌株是否也能代謝產(chǎn)生抗生素，這需要進(jìn)行不斷的篩選優(yōu)化等進(jìn)一步的研究。

本研究通過選取7種常見的細(xì)菌或真菌作為指示菌株，采用牛津杯法和濾紙片法用湯姆青霉PT95的發(fā)酵液對這7種菌進(jìn)行了抑菌活性試驗，發(fā)現(xiàn)湯姆青霉PT95發(fā)酵液中存在某些抑菌物質(zhì)，尤其是對枯草芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抑菌活性，同時也獲得了抑菌試驗的最佳培養(yǎng)條件。以此為基礎(chǔ)，本文還采用牛津杯法測定了湯姆青霉PT95抑制枯草芽孢桿菌的最小質(zhì)量濃度，并采用單因素試驗對培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。從試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，湯姆青霉PT95菌株發(fā)酵液的凍干粉對枯草芽孢桿菌有抑菌活性，最小抑菌質(zhì)量濃度為0.64 mg/mL。本研究結(jié)果表明優(yōu)化培養(yǎng)有助于提高湯姆青霉PT95的抑菌活性，而其中的抑菌機(jī)理值得我們進(jìn)一步深入研究。