二次諧波和偏振光影像技術(shù)在燒燙傷小鼠瘢痕膠原纖維病理變化中的應(yīng)用

賀改英，唐靖惠，馬淑驊，孫婭楠，楊偉峰，王 毅*

（1.中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長春 130118）

燒燙傷引起的瘢痕發(fā)病率高［1］，在一項(xiàng)為期5年的多中心隨訪研究調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，在平均燒傷面積為10%體表面積的患者中，有78.9%燒燙傷患者有瘢痕［2］。瘢痕不僅影響美觀，伴隨著瘙癢和疼痛［3］，而且瘢痕的攣縮常引起關(guān)節(jié)活動受阻，這些對患者的心理和生理均產(chǎn)生了重要影響［4-6］，所以早期防治和評估燒燙傷瘢痕至關(guān)重要。膠原纖維是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成份，占真皮的70%～85%，燒燙傷后膠原纖維的變化直接影響了瘢痕的愈后、皮膚彈性和拉伸強(qiáng)度等功能，所以活體動態(tài)評估瘢痕部位膠原纖維的病理改變，可為藥物篩選和臨床治療提供指導(dǎo)。

目前評估創(chuàng)傷愈合瘢痕形成過程主要是通過肉眼觀察拍照評估，它只能記錄創(chuàng)口表面表征，有一定的主觀性，容易造成試驗(yàn)結(jié)果的誤判。研究皮膚深層的變化是主要通過取材后對瘢痕組織的膠原纖維進(jìn)行病理染色，但這種方法不能定量檢測膠原纖維的排列和密度等方面的信息。液晶偏光成像方法是近年來在皮膚創(chuàng)傷檢測中新興的試驗(yàn)技術(shù)，它通過對雙折射特性明顯的物質(zhì)（如膠原纖維）進(jìn)行定性和定量檢測，反應(yīng)皮膚深層結(jié)構(gòu)信息，與病理染色方法相比有絕對的優(yōu)勢。

本試驗(yàn)通過二次諧波（second harmonic generation，SHG）成像技術(shù)活體、動態(tài)、無創(chuàng)檢測瘢痕組織乳頭層和網(wǎng)狀層膠原纖維的排列規(guī)律和和密度變化，并與液晶偏光影像系統(tǒng)相對照，旨在通過總結(jié)規(guī)律，用光學(xué)成像技術(shù)建立一種活體快速、可定量的評估方法，為預(yù)防和治療瘢痕形成的藥物治療提供檢測方法，為瘢痕形成相關(guān)疾病的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動物

C57BL/6Cnc小鼠，12只，雄性，6～7周齡，體重（20±2）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號為SCXK（京）2016-0006。將其飼養(yǎng)于12 h光照/12 h 黑暗的環(huán)境中，自由攝食和飲水。

1.1.2 主要儀器與試劑

4%多聚甲醛（中國，索萊寶公司）；異氟烷（中國，瑞沃德公司）；雙光子掃描顯微鏡（日本，Olympus公司）；液晶偏光影像系統(tǒng)（美國，CRi Abrio公司）；石蠟切片機(jī)（美國，Thermo公司）；小動物麻醉機(jī)（中國，瑞沃德公司）；倒置顯微鏡（日本，Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立和試驗(yàn)分組

12只C57BL/6Cnc小鼠隨機(jī)分為2組，即正常對照組（sham）和瘢痕組（scar）。C57BL/6小鼠被適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，經(jīng)麻醉后背部進(jìn)行剃毛和脫毛處理。對文獻(xiàn)［7］中動物燒燙傷模型的構(gòu)建方法進(jìn)行改良建立小鼠燒燙傷模型。scar組使用96.5℃的水蒸氣在背部胸椎段中間部位造模6 s，建立創(chuàng)傷面為1 cm直徑的深度燒燙傷模型，使用傷口敷料進(jìn)行包扎。72 h后模仿臨床燒燙傷處理方法去除結(jié)痂，常規(guī)飼養(yǎng)6個月。

1.2.2 SHG成像技術(shù)

各組小鼠麻醉后固定于雙光子顯微鏡載物臺上，采用激發(fā)波長為850 nm［8］，數(shù)值孔徑為1.05的25倍水浸顯微物鏡對真皮組織進(jìn)行z軸掃描，步進(jìn)5μm，圖像采集像素為 1 024 pixel×1 024 pixel，420～460 nm濾光片收光，采集速度4μm/pixel，觀察正常皮膚、瘢痕和瘢痕周圍乳頭層和網(wǎng)狀層膠原纖維，通過Java圖像處理與分析軟件（image processing and analysis in Java，Image J）分析膠原纖維排列方向和膠原纖維面密度，其中膠原纖維面密度是膠原纖維所占面積占總面積的比值。

1.2.3 液晶偏光影像技術(shù)

各組小鼠取相應(yīng)部位組織，將其置于4%多聚甲醛中固定48 h，經(jīng)過修剪、脫水后，將組織進(jìn)行包埋，切厚度為6μm的切片，進(jìn)一步脫蠟，通過液晶偏光影像系統(tǒng)觀察正常皮膚、瘢痕和瘢痕周圍乳頭層和網(wǎng)狀層的膠原纖維，并通過系統(tǒng)自帶軟件對膠原纖維方位角變異程度和相位差進(jìn)行定量分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

一致性、密度、方位角及相位差數(shù)據(jù)均通過GraphPad Prism 6軟件計算；所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，組間比較采用單因素方差分析，以±s表示，P＜0.050為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 燒燙傷瘢痕和瘢痕周圍外觀的觀察

常規(guī)飼養(yǎng)正常和燒燙傷小鼠6個月后，對正常皮膚和瘢痕部位進(jìn)行拍照，觀察小鼠正常皮膚、瘢痕和瘢痕周圍的外觀（圖1）。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)瘢痕部位皮膚顏色偏暗，與周圍皮膚顏色不一致，而且瘢痕部位沒有毛發(fā)生長。

圖1 造模6個月后，小鼠正常皮膚、瘢痕和瘢痕周圍外觀Fig.1 Appearance of normal skin, scar and scar edge after six months of burns

2.2 SHG成像技術(shù)研究燒燙傷瘢痕膠原纖維的病理變化

2.2.1 SHG成像技術(shù)研究燒燙傷瘢痕膠原纖維排列的變化

為了從皮膚水平面研究正常皮膚、瘢痕和瘢痕周圍水平面膠原纖維的排列，我們通過SHG成像技術(shù)檢測乳頭層和網(wǎng)狀層膠原纖維，并通過Image J軟件分析膠原纖維排列方向。正常皮膚乳頭層膠原纖維纖細(xì)，網(wǎng)狀層膠原纖維粗大，不管是乳頭層還是網(wǎng)狀層，其膠原纖維各個方向均有排列，呈隨機(jī)排列的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖2a、2b）。 瘢痕部位乳頭層和網(wǎng)狀層膠原纖維排列方向一致，與表皮平行（圖2a、2b），與正常皮膚比較，瘢痕部位乳頭層和網(wǎng)狀層膠原纖維排列一致性均明顯增加（P＜0.050，P＜0.050）。瘢痕周圍膠原纖維排列與瘢痕部位相似，與表皮呈平行排列（圖2a、2b）。如圖2c所示，與正常皮膚比較，瘢痕周圍乳頭層和網(wǎng)狀層膠原纖維排列一致性均顯著增加（P＜0.010，P＜0.010）。這些結(jié)果表明，從水平面觀察瘢痕和瘢痕周圍乳頭層和網(wǎng)狀層的膠原纖維，其排列方式發(fā)生了改變，這種改變會影響皮膚正常彈性和拉伸性能的發(fā)揮。

2.2.2 SHG成像技術(shù)研究燒燙傷瘢痕膠原纖維面密度的變化

為了從皮膚水平面分析正常皮膚、瘢痕和瘢痕周圍皮膚水平面膠原纖維面密度的變化，本試驗(yàn)通過圖像處理與分析軟件Image J對乳頭層和網(wǎng)狀層SHG成像的膠原纖維面積進(jìn)行分析。正常皮膚乳頭層膠原纖維稍纖細(xì)，網(wǎng)狀層膠原纖維粗大，但排列均稀疏（圖3a），纖維面密度較低（圖3b）。與正常皮膚比較，瘢痕部位乳頭層和網(wǎng)狀層膠原纖維面密度明顯增加（圖3a、3b）（P＜0.050，P＜0.050）。瘢痕周圍與正常皮膚比較，乳頭層和網(wǎng)狀層膠原纖維面密度分別增加了1.35倍和1.60倍（圖3a、3b），具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.050，P＜0.001）。這些結(jié)果表明，不管是瘢痕部位還是瘢痕周圍，乳頭層和網(wǎng)狀層水平面的膠原纖維均明顯增生。

2.3 液晶偏光影像技術(shù)研究燒燙傷瘢痕膠原纖維的病理變化

2.3.1 液晶偏光影像技術(shù)研究燒燙傷瘢痕膠原纖維排列的變化

液晶偏光影像技術(shù)不僅可以對具有雙折射特性的物質(zhì)進(jìn)行成像，對排列方向進(jìn)行偽彩標(biāo)注，將相同方向的雙折射信號按照同一顏色進(jìn)行標(biāo)注，同時可對雙折射物質(zhì)的方向進(jìn)行定量分析。膠原纖維具有雙折光性，所以液晶偏光影像技術(shù)可以對膠原纖維進(jìn)行偽彩標(biāo)注成像和分析。

為觀察正常皮膚、瘢痕和瘢痕周圍皮膚矢狀面膠原纖維的排列，我們通過液晶偏光影像技術(shù)對離體組織膠原纖維排列的方位角進(jìn)行檢測。膠原纖維呈現(xiàn)的雙折射信號方位角的變異程度代表膠原纖維排列方向的特征，變異程度越小，說明膠原纖排列方向越一致，反之，說明呈隨機(jī)排列。正常皮膚乳頭層和網(wǎng)狀層膠原纖維均呈現(xiàn)多種顏色，膠原纖維方位角變異程度大（圖4a）。瘢痕部位乳頭層和網(wǎng)狀層膠原纖維顏色較少，呈平行排列，與正常皮膚比較，乳頭層和網(wǎng)狀層方位角變異程度均顯著降低（圖4a、4b）（P＜0.001，P＜0.010）。瘢痕周圍方位角與正常皮膚比較，其變異程度均顯著降低（圖4a、4b）（P＜0.010，P＜0.010）。這些結(jié)果表明瘢痕和瘢痕周圍乳頭層和網(wǎng)狀層矢狀面膠原纖維的排列方向變異程度降低，方向趨向一致。

2.3.2 液晶偏光影像技術(shù)研究燒燙傷瘢痕皮膚膠原纖維密度的變化

通過液晶偏光影像技術(shù)對離體組織矢狀面膠原纖維的相位差進(jìn)行檢測，相位差值代表纖維組織雙折光信號的密度，相位差值越大代表膠原纖維密度越大，反之密度越小。正常皮膚乳頭層和網(wǎng)狀層排列稀疏，膠原纖維相位差值較小。瘢痕部位乳頭層和網(wǎng)狀層排列密集，膠原纖維相位差值增加，與正常皮膚比較，乳頭層相位差值增加，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.050），網(wǎng)狀層相位差值顯著增加（P＜0.010）。與正常皮膚比較，瘢痕周圍乳頭層和網(wǎng)狀層排列均密集，膠原纖維相位差值均增加（P＜0.050，P＜0.010），具體結(jié)果詳見圖5。以上結(jié)果表明，瘢痕部位和瘢痕周圍乳頭層和網(wǎng)狀層矢狀面的膠原纖維明顯增生，這與人體燒燙傷瘢痕的特點(diǎn)一致。

圖2 SHG成像技術(shù)檢測乳頭層和網(wǎng)狀層膠原纖維排列的變化Fig.2 Arrangement of collagen fibers in papillary layer and reticular layer detected by SHG imaging technology

圖3 SHG成像技術(shù)檢測乳頭層和網(wǎng)狀層膠原纖維面密度的變化Fig.3 Area density of collagen fibers in papillary layer and reticular layer detected by SHG imaging technology

圖4 液晶偏光影像技術(shù)研究乳頭層和網(wǎng)狀層膠原纖維排列的變化Fig.4 Arrangement of collagen fibers in papillary layer and reticular layer detected by liquid crystal polarized imaging technology

圖5 液晶偏光影像技術(shù)研究乳頭層和網(wǎng)狀層膠原纖維密度的變化Fig.5 Density of collagen fibers in papillary layer and reticular layer detected by liquid crystal polarized imaging technology

3 討論

瘢痕是各種創(chuàng)傷后所引起的正常皮膚組織的外觀形態(tài)和組織病理學(xué)改變的統(tǒng)稱［9］，創(chuàng)傷愈合后瘢痕的演變通常經(jīng)歷增生期、消退期和成熟期，不同時期瘢痕內(nèi)的病理狀態(tài)并非一致［10］。在嚙齒類動物的燒燙傷瘢痕中，大量研究設(shè)置6個月作為研究瘢痕最長的時間［11-13］，這個時間可能是嚙齒類動物瘢痕成熟期，所以本試驗(yàn)選擇了6個月作為研究瘢痕的時間。

本試驗(yàn)在檢測瘢痕部位膠原纖維病理變化的同時，還對瘢痕周圍組織進(jìn)行了檢測，這是因?yàn)轳：壑車梢苑从碂隣C傷部位愈合且不留有瘢痕皮膚的膠原纖維是否正常。瘢痕部位沒有毛發(fā)生長，瘢痕周圍部位有毛發(fā)，但不易脫毛，脫毛后殘留毛根粗、長，而正常部位毛發(fā)容易脫毛，脫毛后殘留毛根細(xì)、短。本試驗(yàn)的檢測需要對病理組織進(jìn)行脫毛處理，所以容易辨別瘢痕周圍組織、瘢痕組織和正常組織。

在皮膚的真皮組織中，膠原纖維含量占70%～85%，是細(xì)胞外的主要成分。研究發(fā)現(xiàn)膠原纖維的排列和密度在皮膚的生物力學(xué)特性中發(fā)揮著重要作用［14］。正常皮膚膠原纖維呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，膠原纖維面密度較小，這種結(jié)構(gòu)特點(diǎn)維持了皮膚正常的彈性和拉伸強(qiáng)度，而在瘢痕組織中，膠原纖維的排列［15-17］和密度［18-21］均發(fā)生了改變。為進(jìn)一步觀察真皮不同深度膠原纖維的病理變化，本試驗(yàn)從真皮的分層著手研究，真皮分為乳頭層和網(wǎng)狀層［22］，乳頭層和網(wǎng)狀層在結(jié)構(gòu)和功能等方面表現(xiàn)不同。乳頭層是緊鄰表皮的薄層結(jié)締組織，膠原纖維細(xì)密，乳頭層含有豐富的毛細(xì)血管和游離神經(jīng)末梢，其主要作用是加強(qiáng)與表皮的連接，為表皮提供營養(yǎng)。網(wǎng)狀層是位于乳頭層下方的厚層結(jié)締組織，膠原纖維粗大，交織成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其主要作用是為皮膚提供結(jié)構(gòu)支撐和拉伸作用。本試驗(yàn)從乳頭層和網(wǎng)狀層的角度，分別研究了燒燙傷小鼠瘢痕和瘢痕周圍膠原纖維的排列和密度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳頭層和網(wǎng)狀層膠原纖維排列方向趨向一致，均與表皮平行，密度均增加，這些膠原纖維排列和密度的病理改變勢必影響皮膚正常的生物力學(xué)特性。

本試驗(yàn)通過偏振光影像技術(shù)對離體膠原纖維進(jìn)行了成像和定量檢測。傳統(tǒng)方法對離體組織膠原纖維的檢測主要是進(jìn)行病理染色，但這種方法不能定量檢測膠原纖維的排列和密度。液晶偏光影像系統(tǒng)通過特有的液晶補(bǔ)償光學(xué)元件可以將偏振光波產(chǎn)生的光程差信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枺偻ㄟ^軟件在監(jiān)測器上還原成明暗不同的光信號。而且液晶偏光成像采用近似圓偏振光片，可彌補(bǔ)傳統(tǒng)線偏振光的不足，無論雙折射的物質(zhì)取向如何，均可以對物質(zhì)的方位角變異程度和密度定量分析。膠原纖維具有雙折光性，在離體組織經(jīng)脫蠟后，不需任何染色條件下，液晶偏振光影像技術(shù)可以對膠原纖維檢測，并通過系統(tǒng)自帶軟件對方位角變異程度和密度進(jìn)行定量分析［23-24］，而膠原纖維排列和密度的分析對于診斷瘢痕具有重要的意義。

雖然偏振光影像技術(shù)對膠原纖維的檢測擁有傳統(tǒng)方法不可比擬的優(yōu)點(diǎn)，但無創(chuàng)、活體檢測才能反映出更多的生物醫(yī)學(xué)信息。SHG成像技術(shù)是新近發(fā)展起來的激光掃描非線性光學(xué)顯微術(shù)，以生物組織非中心對稱性的內(nèi)源性信號為來源，不需進(jìn)行染色，可以直接原位成像，而且采用近紅外的飛秒激光作為光源，對組織探測深、損傷小、分辨率高［25］。二次諧波成像技術(shù)不僅可以對活體組織x和y平面進(jìn)行掃描，同時對z軸方向進(jìn)行檢測，從而實(shí)現(xiàn)三維成像。膠原纖維具有強(qiáng)烈的二階非線性極化率和結(jié)構(gòu)非中心對稱性，可以產(chǎn)生二次諧波。SHG成像技術(shù)可以活體、無創(chuàng)、定量研究膠原纖維的病理變化。目前SHG成像技術(shù)廣泛應(yīng)用于藥物透皮［26］和癌變組織［27］，而且也逐漸應(yīng)用到瘢痕膠原纖維的研究中［28-30］。本試驗(yàn)通過SHG成像技術(shù)活體、無創(chuàng)檢測了燒燙傷小鼠瘢痕乳頭層和網(wǎng)狀層膠原纖維的病理變化，這為將來在人體無創(chuàng)和定量研究瘢痕提供了方法。

本試驗(yàn)通過SHG和液晶偏振光影像技術(shù)從活體皮膚水平面和離體組織矢狀面檢測燒燙傷小鼠瘢痕膠原纖維排列方向和密度的變化，雖然SHG成像技術(shù)與液晶偏振光影像技術(shù)物理機(jī)制不同，但反映出來的意義相同，均可以反應(yīng)膠原纖維排列和密度的病理變化。而且本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SHG和液晶偏振光影像技術(shù)對膠原纖維的檢測結(jié)果趨勢一致，即瘢痕部位、瘢痕周圍乳頭層和網(wǎng)狀層膠原纖維的排列方向均偏向一致，與表皮平行，膠原纖維密度明顯增加，這種結(jié)果趨勢的相同為僅通過SHG成像技術(shù)無創(chuàng)鑒別瘢痕組織提供了可能?？傊?，通過本研究希望建立一種活體、無創(chuàng)鑒別瘢痕組織的評估方法，為人體預(yù)防和治療瘢痕形成的藥物治療提供檢測方法。