果蠅隱（花）色素光感受機理的研究現(xiàn)狀

姚鵬程，鄭 偉，周志強，徐 蕾

（皖南醫(yī)學院活性生物大分子研究安徽省重點實驗室，蕪湖 241002）

太陽給予了地球光和熱，是生命的能量來源。但陽光中的中短波紫外線也會使生物體中的DNA產(chǎn)生損傷，進而抑制DNA的復制、轉(zhuǎn)錄，導致生物體受損、生長停滯甚至死亡［1］。光修復酶（photolyase）是進化過程中出現(xiàn)最早的DNA修復蛋白之一，其可利用光能直接修復紫外線導致的DNA損傷，恢復DNA的正常結(jié)構(gòu)［2-3］。在進化過程中，一部分光修復酶的功能發(fā)生了異化，獲得了調(diào)控基因表達以及生物節(jié)律的能力，而其DNA修復能力則減弱或喪失，從而進化成為隱（花）色素（cryptochrome，Cry）［4］。Cry根據(jù)其來源和結(jié)構(gòu)特征，可分為植物隱（花）色素和動物隱（花）色素，而動物隱（花）色素又可分為I型和II型。植物隱（花）色素可作為藍光受體參與調(diào)控植物的生長發(fā)育及光形態(tài)建成。動物II型隱（花）色素如哺乳動物隱（花）色素，可作為轉(zhuǎn)錄抑制因子參與抑制生物鐘基因的轉(zhuǎn)錄表達，從而調(diào)控生物節(jié)律。而動物I型隱（花）色素，如果蠅隱（花）色素（Drosophilacryptochrome，dCry），則作為光受體參與校準生物節(jié)律［4］。

果蠅飼養(yǎng)簡便，遺傳背景清楚，僅含有四對染色體，便于研究，可通過化學誘變獲得其突變體，并且可通過轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)導等方法對其進行轉(zhuǎn)基因操作，是生命科學中常用的模式生物之一。果蠅體內(nèi)基因組中約50%與哺乳動物編碼蛋白質(zhì)的基因具有高度同源性，約有60%的人類疾病相關(guān)基因在果蠅的基因組中存在直系同源物。因此，以果蠅為模式生物探究人類的生理活動以及疾病發(fā)病機制有非常重要的作用和意義［5］。2017年，諾貝爾生理學或醫(yī)學獎得主Hall JC、Rosbash M及Young MW在有關(guān)生命節(jié)律的分子機制研究過程中也選擇了果蠅作為主要研究對象。本文針對目前關(guān)于dCry光感受的機理及其信號狀態(tài)的爭論，綜述了dCry在果蠅生物鐘系統(tǒng)中的功能、結(jié)構(gòu)特征以及其光感受機理和信號狀態(tài)的研究現(xiàn)狀，并對今后的研究方向作了展望。

1 dCry在果蠅生物鐘系統(tǒng)中的功能

人們很早就發(fā)現(xiàn)果蠅的運動以及蛹的羽化都具有明顯的晝夜節(jié)律［6］。1971年，Konopka等［7］通過化學誘變得到了三種果蠅突變體（per0，perS和perL），分別能引起果蠅羽化及自發(fā)運動節(jié)律的喪失、加快和減慢。這三個突變都位于同一個基因上，該基因被命名為period，簡稱為per，以表明其調(diào)節(jié)生物節(jié)律的特性。這一發(fā)現(xiàn)首次在分子水平證明了生物鐘基因的存在。在per基因發(fā)現(xiàn)二十多年后，人們陸續(xù)在果蠅中發(fā)現(xiàn)了其他生物鐘基因，如timeless（tim）、clock、cycle、jetlag（jet）以及cry等［8-12］。這些生物鐘基因及其表達的蛋白質(zhì)組成了果蠅的生物鐘系統(tǒng)。其中Clock和Cycle是轉(zhuǎn)錄因子，兩者形成二聚體后，在核內(nèi)可通過與增強子E-box結(jié)合激活一系列生物鐘基因的表達。而Per和Tim蛋白可形成二聚體，抑制Clock和Cycle對生物鐘基因（包括per和tim在內(nèi)）的轉(zhuǎn)錄激活作用，這樣就形成了一個轉(zhuǎn)錄/翻譯反饋振蕩回路，從而形成了基因表達的生物節(jié)律［4，9，13］。

dCry在果蠅生物鐘系統(tǒng)中可作為光受體對光進行感受，以光照為線索對生物節(jié)律進行校準。其在光照條件下構(gòu)象發(fā)生改變，C末端尾巴（C-terminal tail，CTT）彈出，位于其中心的活性區(qū)域暴露，進而通過與Tim蛋白結(jié)合使其通過Jet介導的泛素化途徑降解，從而解除Per-Tim二聚體對Clock和Cycle的抑制作用，使得生物鐘基因轉(zhuǎn)錄激活；而在暗處，dCry與Tim解離，轉(zhuǎn)錄激活被重新抑制，從而起到校準作用［4，13］。此外，有報道表明，在長時間光照下，dCry自身也可發(fā)生降解［12］。

2 dCry的結(jié)構(gòu)特征

在一級結(jié)構(gòu)上（圖1a），dCry的N末端與6-4光修復酶（一類可以修復DNA上紫外線造成的6-4光產(chǎn)物損傷的光修復酶）高度同源，稱為光修復酶同源區(qū)（photolyase homology region，PHR）［14］。但與光修復酶不同的是，dCry在C末端還存在一段短的尾部延伸，即C末端尾巴。

2.1 光修復酶同源區(qū)

晶體學研究揭示了dCry的空間結(jié)構(gòu)（PDB ID:4JZY，4GU5），其N端與6-4光修復酶的結(jié)構(gòu)高度同源，即光修復酶同源區(qū)。光修復酶同源區(qū)又可分為兩個相對獨立的結(jié)構(gòu)域，即α/β結(jié)構(gòu)域（α/β domain）和α螺旋結(jié)構(gòu)域（α-helix domain），兩者由一段肽段連接。在連接肽段中存在C末端尾巴基環(huán)（CTT base loop，氨基酸154～160位）模體，可以支持結(jié)合C末端尾巴。在光修復酶的α/β結(jié)構(gòu)域和α螺旋結(jié)構(gòu)域之間，通?？梢越Y(jié)合一個可以增加酶的光吸收能力的天線輔酶。但目前研究表明，與光修復酶不同，dCry并不結(jié)合天線輔酶［15-16］。

dCry的α螺旋結(jié)構(gòu)域和光修復酶一樣，可以結(jié)合一個黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）輔酶，此結(jié)構(gòu)域也可稱為FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該區(qū)域高度保守［17-18］。功能研究表明，F(xiàn)AD輔酶的結(jié)合對于dCry行使光感受功能是必需的［14］。在α螺旋結(jié)構(gòu)域中，dCry含有色氨酸（tryptophan，Trp）三聯(lián)體的電子傳遞路徑（W342、W397、W420），可在FAD光照還原中起到電子傳遞的作用，與光修復酶類似。最近的研究表明，可能還存在第四個Trp（W394）也在FAD光還原的電子傳遞中起作用［19］。值得注意的是，在dCry的α螺旋結(jié)構(gòu)域中，位于FAD輔酶N5位側(cè)面的一個殘基是C416，這不同于絕大部分光修復酶，該位點在大部分光修復酶中為保守的天冬酰胺。C416位殘基可能有助于dCry的FAD輔酶在光還原反應中保持在陰離子自由基狀態(tài)（FAD·-），此狀態(tài)可能為 dCry的激活所必需的條件［14，20］。此外，Xu等［21］的研究表明，位于FAD輔酶中異咯嗪環(huán)si面上方的V415位殘基也對在光還原反應中維持FAD·-狀態(tài)的穩(wěn)定性有貢獻。

在α螺旋結(jié)構(gòu)域中，dCry還存在一些與6-4光修復酶類似的模體，如磷酸結(jié)合環(huán)（phosphate-binding loop，氨基酸249～263位）、突出模體（protrusion motif，氨基酸288～306位）等結(jié)構(gòu)。但不同的是，6-4光修復酶在磷酸結(jié)合環(huán)處出現(xiàn)了近90°的彎曲，而dCry則是在其α8螺旋的基礎(chǔ)上多延伸了兩圈，從而在磷酸結(jié)合環(huán)處形成了一個小區(qū)域，使得FAD更容易與外界接觸、受外界影響。此外，dCry在類似于光修復酶結(jié)合底物的識別區(qū)域的位置還存在一段富含絲氨酸的C末端蓋子（C-terminal lit，氨基酸420～446位）模體，可參與和C末端尾巴的結(jié)合，其中包含若干磷酸化修飾的位點［15-16］。空間上，前述光修復酶同源區(qū)的C末端尾巴基環(huán)、磷酸結(jié)合環(huán)、突出模體以及C末端蓋子等模體形成一個口袋結(jié)構(gòu)，可通過類似于光修復酶結(jié)合底物的方式結(jié)合C末端尾巴（圖1b），這些模體可統(tǒng)稱為C末端尾巴耦合模體（CTT-coupled motif，CCM）［17］。

2.2 C末端尾巴

dCry的C末端尾巴（氨基酸528～539位）形成了一段α螺旋，占據(jù)了光修復酶同源區(qū)中由若干CCM組成的口袋結(jié)構(gòu)［14］。C末端尾巴中存在由三個連續(xù)的芳香族氨基酸（F534、F535、W536）組成的FFW模體（F代表苯丙氨酸，W代表色氨酸），以類似于底物與酶結(jié)合的方式與光修復酶同源區(qū)中的口袋結(jié)構(gòu)緊密結(jié)合。其中，F(xiàn)534位殘基結(jié)合于口袋結(jié)構(gòu)的中心位置，與口袋底部的FAD輔酶相接近［15-16］。有趣的是，在與dCry作用的生物鐘蛋白Tim中也存在一段含有FFW模體且類似于dCry的C末端尾巴的區(qū)域（Tim C-terminal tail-like，Tim-CTL）［14］。由此可推測，C末端尾巴在暗處與CCM結(jié)合，可以阻止dCry與Tim結(jié)合并維持自身穩(wěn)定。在光照條件下，dCry被激活后C末端尾巴從活性口袋中彈出，然后dCry可與Tim-CTL結(jié)合發(fā)揮作用，或者直接激活dCry自身的降解［20，22-23］。

3 dCry的光感受及信號狀態(tài)

3.1 dCry的光感受

對于dCry的光感受機理，目前尚未完全闡明。有觀點認為，dCry中FAD的光還原或化學還原是其光感受所必需的過程［14，20，24］。Vaidya 等［14］在 2013 年發(fā)表的文獻中證明，采用光還原或者化學還原可使dCry中的FAD達到陰離子自由基型FAD·-（或完全還原型FADH-）狀態(tài)，結(jié)果表明，這兩種還原方式均可使dCry構(gòu)象發(fā)生變化，并且氧化后構(gòu)象會恢復。而另一種觀點則認為，dCry中FAD在細胞內(nèi)可能是FAD·-，在光照下激發(fā)為 FAD·-的激發(fā)態(tài)（FAD·-*）才會導致構(gòu)象變化并激活dCry，且單純的化學還原不能使dCry激活［25-27］。然而，后一種觀點的問題在于，dCry的FAD·-狀態(tài)不穩(wěn)定，容易被氧化，該狀態(tài)在細胞中是否穩(wěn)定存在尚有疑問，且一些試驗測定表明，在體內(nèi)dCry所結(jié)合的FAD可能是氧化型（FADox）而不是FAD·-型的［14，24］。盡管目前看來，前一種觀點較為可信，但該試驗結(jié)果顯示dCry的光感受是一個可逆的過程，這就與一些研究所示的dCry光感受不可逆性相駁斥［28-30］。上述研究結(jié)果表明，dCry的光感受除光還原外還存在著一些不可逆的過程。

有文獻報導稱，dCry白天不穩(wěn)定，但在夜晚穩(wěn)定，其表達量在夜間達到最大值，暗示了光照也可增加dCry的降解，說明dCry的光感受存在不可逆性［4，12，14］。Busza 等［23］在之后的對 dCry 光感受時結(jié)構(gòu)變化的研究中也證明了光照停止后降解即停止。在機制的研究中，Ozturk等［31］發(fā)現(xiàn)果蠅體內(nèi)存在著dCry的光依賴性受體BRWD3（bromodomain and WD repeat domain containing 3），該受體在光照下與dCry相連接，并通過BRWD3/DDB1/CUL4/ROC1 E3連接酶復合體使dCry泛素化降解。這種變化還可能通過電子傳遞、蛋白相互作用或磷酸化狀態(tài)的改變對dCry的下游信號轉(zhuǎn)導起重要作用，其具體的機理目前還在研究中［12］。

圖1 果蠅隱色素的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of Drosophila cryptochrome

此外，體外研究也說明了在長時間藍光的作用下，Trp失電子形成陽離子自由基TrpH·+，該自由基與蛋白骨架中其他正電氨基酸相排斥，引起dCry中α22螺旋的構(gòu)象改變、CTT從活性區(qū)域彈出、Trp分解、FAD脫落這一系列不可逆反應［28］。實際上，大部分光修復酶和Cry中都含有Trp三（四）聯(lián)體的電子傳遞路徑。先前的研究表明，dCry中Trp三聯(lián)體（W342、W397、W420）的突變會使得體外光還原受到阻礙，但不影響 dCry 在體內(nèi)的生理活性［26-27，32-33］，這說明 Trp在dCry的光感受中扮演的角色有待進一步明確。因為Trp三聯(lián)體中Trp與FAD的位置遠近不同，正電荷所在部位對光照下dCry的穩(wěn)定性有著不可忽視的作用。Trp420最靠近FAD殘基，而Trp420H·+狀態(tài)相對不穩(wěn)定；Trp342與FAD殘基距離較遠，Trp342H·+狀態(tài)則相對穩(wěn)定［28］。

3.2 dCry的信號狀態(tài)

對于dCry的信號狀態(tài)，光還原試驗給出了兩個可能的模型：一種是當FADox被還原為FAD·-后，dCry構(gòu)象改變，此時為信號狀態(tài)（圖2a）；另一種是當FAD·-進一步被激發(fā)，形成激發(fā)態(tài)，即FAD·-*時，dCry構(gòu)象才發(fā)生變化，進而介導信號傳導（圖2b）［14，25］。這兩種模型都是以FAD狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楹诵?，對dCry的信號狀態(tài)進行闡述，即dCry從基態(tài)到信號狀態(tài)的改變僅由FAD狀態(tài)的變化引起。Hoang等［24］在對果蠅體內(nèi)dCry活性的研究中，比較不同波長光引起50%dCry降解的時間，并繪制其作用光譜，發(fā)現(xiàn)作用光譜峰值位于450 nm處，與dCry中FAD的特征吸收峰一致，更是進一步證明了上述理論。

Peschel等［34］通過小角度X射線散射試驗，從動力學角度進一步對dCry的信號狀態(tài)進行了研究。該試驗支持前期的一個試驗結(jié)論——信號狀態(tài)dCry的CTT從原先口袋結(jié)構(gòu)中彈出［14-15］。此外，Berntsson等［35］的研究還說明了dCry需在CTT某個殘基上接受一個H+后，才能順利彈出。因此隨著pH值的升高H+減少，使得傳遞受阻，dCry向信號狀態(tài)的轉(zhuǎn)化會被減緩或阻止，但是H+具體的結(jié)合位點尚未明確［35］。保守的H378位于FAD與CTT之間，并且在dCry的光反應中發(fā)揮質(zhì)子化作用［36］。但動力學分析表明，突變體H378A在兩個不同的pH下，信號狀態(tài)的形成并未發(fā)生改變，說明H378并非H+的結(jié)合位點［35］。該觀點所支持的信號狀態(tài)相當于在先前的基礎(chǔ)上加上了一個質(zhì)子，補充了先前的理論，但質(zhì)子具體的位置還有待進一步確認。

圖2 果蠅隱色素兩種可能的信號狀態(tài)模型［14］Fig.2 Two signaling state models of Drosophila cryptochrome［14］

dCry不僅在450 nm附近的藍光作用下發(fā)生反應，對長波紫外光也同樣敏感［37］。VanVickle-Chavez等［38］在dCry光降解的試驗中，在N末端連接一個熒光素酶，使dCry在光照下更易降解并便于檢測，同時在暗處仍能穩(wěn)定表達。通過測定在不同波長光照下熒光酶素的活性損失并繪制作用光譜來探究其作用的差異。結(jié)果表明，作用光譜在390 nm處達最大值，這與Hoang等［24］提出的氧化型FAD的特征吸收峰在450 nm處達最大值不同［25，37］。該結(jié)果與上述兩種試驗提出的信號狀態(tài)相矛盾，暗示了dCry在光照下存在FAD光還原以外的變化。值得注意的是，Kao等［39］對dCry的光譜學研究表明，dCry存在特殊熒光特性，不遵守一般的卡莎規(guī)則（Kasha’s rule），表現(xiàn)為對不同波長的激發(fā)光其熒光發(fā)射峰的波長也不同。該作者將此現(xiàn)象解釋為FAD基態(tài)和激發(fā)態(tài)發(fā)生“錐形交叉”（conical intersection，CI）的結(jié)果，這種熒光性質(zhì)是否和dCry的光感受和信號狀態(tài)有關(guān)，目前尚未有研究。

此外還有文獻顯示，在野生型果蠅中dCry可介導紅光所誘發(fā)的去極化，這種去極化在敲除dCry的果蠅以及經(jīng)FAD特異的抑制劑處理的果蠅中并不存在，這也提示了中性自由基FADH·可能在參與dCry信號狀態(tài)的形成［40］。綜上所述，dCry可對不同波長的光產(chǎn)生不同的反應，而以往單一試驗中往往僅使用藍光或是紫外光，這可能使試驗的結(jié)果不夠完整，而應用不同波長光對dCry信號狀態(tài)進行研究無疑是一條重要的思路。

4 總結(jié)與展望

dCry是一種光感受蛋白，作為果蠅生物鐘系統(tǒng)的重要組成部分，明確其作用機理有著重大意義?，F(xiàn)有研究已確認，dCry可以通過光依賴的方式與Tim結(jié)合，并促進其通過泛素化途徑降解，從而解除Per-Tim二聚體對生物鐘轉(zhuǎn)錄因子Clock-Cycle的轉(zhuǎn)錄抑制作用，進而校準生物鐘。在此過程中，dCry結(jié)合的FAD輔酶、CTT以及Trp三（四）聯(lián)體等結(jié)構(gòu)均扮演了重要角色。然而，dCry具體的光感受機理及信號狀態(tài)尚未完全闡明。對于dCry的光感受機理，目前需要明確的問題包括：FAD以何種狀態(tài)（氧化還原狀態(tài)、基態(tài)或激發(fā)態(tài)）激活dCry的構(gòu)象改變，以及光感受的過程是否可逆。對于dCry的信號狀態(tài)，問題體現(xiàn)在光照下dCry是否存在除FAD光還原以外的作用，以及不同波長的光對dCry的影響。

針對上述問題，我們也有一些有待驗證的設想。我們猜測光照下Trp三（四）聯(lián)體上正電荷的位置對dCry構(gòu)象的改變起著重要的作用。在光降解試驗中，盡管450 nm波長的藍光對dCry中FAD輔酶的光還原作用最快，但對降解的作用卻十分微小［38］。這可能是因為藍光對電子傳遞的作用較強，使得正電荷更多地分布在距離FAD中心較遠的W342上，與周圍正電荷氨基酸的經(jīng)典排斥作用較弱，因而對FAD乃至整個蛋白分子的影響較小。而使用波長較小的390 nm波長紫外光照射時，盡管光還原速率慢于藍光，但對電子在Trp三（四）聯(lián)體上的傳遞作用也較弱，使得正電荷停留在靠近FAD中心的W420上，對FAD以及其活性中心的正電荷氨基酸有著較強的作用，因而對整個構(gòu)象的影響較大。后續(xù)的研究中，我們可以利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建dCry突變體并繪制光降解作用光譜，從而進一步明晰dCry光感受機制。

此外，我們還推測dCry特殊的熒光性質(zhì)可能在光感受中起重要的作用。為驗證該設想，我們可以構(gòu)建關(guān)鍵位點的突變體或截去CTT構(gòu)建截短突變體，比較分析各突變體熒光及光照下熒光變化的差異，以探究dCry特殊熒光特性產(chǎn)生的機制，了解dCry是否存在類似綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）一樣的特殊熒光結(jié)構(gòu)［41］，并嘗試分析熒光與光還原的關(guān)系、各氨基酸殘基之間的作用關(guān)系。其次，在對dCry光感受結(jié)構(gòu)變化的研究中，可通過蛋白酶解試驗［14，25］研究光照不同時間及暗處恢復dCry的結(jié)構(gòu)變化和變化速率，闡明光感受是否可逆。Tim是果蠅生物鐘系統(tǒng)中直接與dCry作用的蛋白，研究在不同條件下dCry與Tim的蛋白相互作用對dCry光還原、光降解的影響對果蠅生物鐘系統(tǒng)的發(fā)展顯得尤為重要。最后，還可以利用熱分析、液相層析、圓二色譜、小角度X射線散射等多種方法對dCry在不同波長光照射下的結(jié)構(gòu)變化差異進行探究，從而明確dCry的光感受機理及信號狀態(tài)。通過上述試驗，我們期望能進一步明確dCry的光感受機理，為深入了解dCry的生理功能和作用機理打下基礎(chǔ)。

綜上所述，目前人們對于dCry在果蠅生物鐘系統(tǒng)中的基本功能及其蛋白結(jié)構(gòu)等方面已有比較透徹的認識，但對于dCry光感受的具體過程、光感受的信號狀態(tài)等問題尚存在一些爭議，光感受的具體機理有待進一步闡明。繼續(xù)研究dCry的光感受機理，不僅對于深入認識生物體對生物鐘系統(tǒng)的調(diào)控方式具有重要意義，也有助于蛋白質(zhì)光生物化學和光生物物理研究領(lǐng)域的深層次拓展。