茶中多酚類化合物抗流感病毒的研究進展

易 娟，劉 淼

（1.長沙衛(wèi)生職業(yè)學院，長沙 410000；2.湖南省科學技術(shù)信息研究所，長沙 410001）

流感是一個嚴重的公共衛(wèi)生問題，具有傳播快、發(fā)病率高、流行廣泛、病毒易產(chǎn)生變異等特點，其疫苗效用有限且供應不足［1］。金剛烷胺類藥和神經(jīng)氨酸酶抑制劑（如奧司他韋）等抗流感病毒藥物的耐藥性已被證實［2］。因此，迫切需要開發(fā)具有不同作用機制的抗病毒藥物。

茶中多酚類化合物是一類以兒茶素為主體的具生物氧化作用的酚性化合物，兒茶素約占多酚化合物的60%～80%［3］。茶多酚在抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗肥胖及防治心腦血管疾病等方面具有積極作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，兒茶素及其衍生物具有對抗多種病毒的作用，包括艾滋病毒［4］、寨卡病毒［5］、乙型肝炎病毒［6］、丙型肝炎病毒［7-8］、孔肯雅病毒［9］、單純皰疹病毒［10］、流感病毒［11-13］等，被認為是一種潛在的抗病毒先導體。兒茶素由兒茶素單體組成，包括兒茶素（catechin，C）、表兒茶素（epicatechin，EC）、沒食子兒茶素（gallocatechin，GC）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、兒茶素沒食子酸酯（catechin gallate，CG）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）及表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）等。其中EGCG占兒茶素總量的70%～80%，因其化學結(jié)構(gòu)（圖1）與幾個酚羥基連接，易氧化生成氫離子，在中性和堿性條件下不穩(wěn)定，故具有很強的抗氧化作用［14］。EGCG是二十余年來茶中多酚類化合物活性研究中使用最多、最受關(guān)注的成分，對包括流感病毒在內(nèi)的幾種包膜病毒具有廣泛的抗病毒活性［11-13］。茶黃素是EGCG和其他兒茶素單體在紅茶、普洱熟茶發(fā)酵工藝中形成的衍生物，與EGCG相比，它在一些研究中似乎表現(xiàn)出更強的抗病毒活性［15］。本文對近二十年來國內(nèi)外茶多酚類化合物如兒茶素及其衍生物的抗流感病毒作用、作用機制、臨床研究以及應用開發(fā)等方面進行了綜述與分析。

圖1 EGCG的化學結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of EGCG

1 茶中多酚類化合物抗流感病毒作用

在茶抗病毒研究中，大多數(shù)研究集中在兒茶素單體，特別是EGCG，體內(nèi)外試驗都發(fā)現(xiàn)綠茶中富含的EGCG 在抗流感中發(fā)揮重要作用［16-19］。Song等［16］通過體外試驗研究了綠茶中3個兒茶素單體對流感病毒的影響，發(fā)現(xiàn)EGCG和ECG均表現(xiàn)出抑制血凝素的活性，但EGCG的活性更強。EGCG和ECG對神經(jīng)氨酸酶活性的抑制作用比EGC強，可能是兒茶素骨架的3-沒食子酸基對抗病毒活性起著重要作用，而2位三羥基芐基部分的5'-OH起著次要作用。黃深惠等［17］對比了7種茶多酚物質(zhì)，體外試驗發(fā)現(xiàn)EGCG和ECG對3種流感病毒（H5N1、H1N1和H9N2）感染后的細胞有顯著保護作用，而GC、EC、EGC等其他5種作用較弱，可能與這5種茶多酚物質(zhì)沒有沒食子酸結(jié)構(gòu)有關(guān)。這些對比研究顯示，在成分繁多而復雜的茶中多酚類化合物中，兒茶素中的酯型兒茶素EGCG和ECG可能是最具研究價值的成分。動物試驗顯示，口服 EGCG［40 mg/（kg·d）］可顯著提高感染流感病毒的BALB/c小鼠的存活率，降低小鼠體內(nèi)的平均病毒滴度，并緩解致死性流感病毒感染導致的病毒性肺炎病理損傷，作用相當于口服陽性對照藥物奧司他韋［40 mg/（kg·d）］［18］。肖瀟等［19］也證實了 EGCG 能提高流感病毒感染小鼠的存活率，延長生存時間，并緩解流感導致的肺病理損傷。

經(jīng)化學修飾后的兒茶素衍生物能更好地發(fā)揮抗流感的作用，如引入酮基、?；蚋淖兺殒滈L度等能提高膜通透性或提高化學穩(wěn)定性［20-24］。EGCG的簡單類似物雙脫氧EGCG對甲型流感病毒（H3N2）的抑制作用為EGCG的4倍［20］。在EGCG中添加長?；湥–16-18）可將其抗流感病毒活性提高44倍，?；€提高了EGCG的化學穩(wěn)定性［22］。采用脂肪酶催化酯交換反應合成的一系列EGCG O-?；苌锉憩F(xiàn)出比EGCG高幾倍的活性，在EGCG中加入長鏈烷基可顯著增強其對多種細菌和真菌的活性［23］。2018年，Kaihatsu等［24］提出了一種新的EGCG脂肪酸衍生物——EGCG脂肪酸單酯，其中酚羥基上的脂肪酸有望增加病毒和細胞膜的通透性，對不同類型的病毒具有更好的抗病毒活性。根據(jù)兒茶素衍生物的結(jié)構(gòu)與抗病毒活性的關(guān)系，兒茶素衍生物的3-沒食子酸和5'-OH基團對其抗病毒活性起著關(guān)鍵作用，增強EGCG與病毒顆粒的結(jié)合親和力對提高殺病毒活性至關(guān)重要。以上這些研究都為EGCG等兒茶素在病毒感染防治中的應用開拓了新思路。

茶中多酚類物質(zhì)在發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化為茶紅素、茶黃素和茶褐素等高聚化合物。茶黃素（其化學結(jié)構(gòu)見圖2）及其衍生物是紅茶中的主要成分，目前茶黃素（theaflavin，TF1）、茶黃素-3-沒食子酸酯（theaflavin-3-gallate，TF2A）、茶黃素-3'-沒食子酸酯（theaflavin-3'-gallate，TF2B）、茶黃素-3，3'-雙沒食子酸酯（theaflavin-3，3'-digallate，TF3）是最主要的茶黃素類化合物［25］。早期體內(nèi)外試驗發(fā)現(xiàn)紅茶提取物、茶黃素單體TF3可抑制流感病毒［26-28］，并且被滅活的流感病毒在體內(nèi)不會發(fā)生逆轉(zhuǎn)［27］。近年來，Zu等［29-30］的動物試驗證實來自紅茶的茶黃素（TF純度為80%）以及3種茶黃素衍生物（theaflavins，TFs）對3種不同的流感病株［A/PR/8/34（H1N1）、A/Sydney/5/97（H3N2）和 B/Jiangsu/10/2003］有抑制作用；李湘瀲等［31］也證實茶黃素衍生物混合物（TF1、TF2A、TF2B、TF3 總質(zhì)量分數(shù)＞85%）能明顯抑制 H5N1泰國株的假病毒。2014年，Yang等［15］對比研究了茶黃素、原花青素B-2、EGCG、EGC等茶中多酚物質(zhì)抗病毒作用，發(fā)現(xiàn)茶黃素和原花青素等二聚體比EGCG等單體表現(xiàn)出更強的抗流感病毒活性，二聚體分子的茶黃素可能是抗流感病毒的重要化合物。盡管已有研究發(fā)現(xiàn)茶黃素比EGCG抗病毒作用更強，但需要更多體內(nèi)外試驗和相關(guān)機制來驗證。

圖2 茶黃素的化學結(jié)構(gòu)Fig.2 Chemical structure of theaflavin

近年來開始受到科學家關(guān)注的消脂素是普洱茶中主要多酚成分的水解型鞣酸單寧，也具有抗流感病毒的作用［32-33］，可能是一種有效的抗病毒物質(zhì)。此外，研究發(fā)現(xiàn)茶多酚與其他物質(zhì)如抗壞血酸等聯(lián)合使用，能起到協(xié)調(diào)抗病毒的作用［34-35］。

2 茶中多酚類化合物抗流感病毒作用機制

2.1 抑制流感病毒對宿主細胞的吸附

流感病毒表面的糖蛋白血凝素（hemagglutinin，HA）與宿主細胞表面的唾液酸受體特異性結(jié)合后，病毒吸附于細胞表面并被細胞膜包裹，以胞吞的方式進入細胞。茶中多酚類化合物的抗流感效應有可能是通過干擾病毒膜蛋白，作用于吸附、進入和膜融合等步驟來抑制早期感染。最早Nakayama 等［26］認為紅茶提取物可抑制病毒附著于細胞，而不是抑制病毒在細胞中的復制。隨后他們又發(fā)現(xiàn)EGCG和TF3能有效阻止流感病毒在犬腎（Madin-Darby canine kidney，MDCK）細胞上的黏附，它們可與流感病毒的血凝素結(jié)合，抑制病毒對宿主細胞的附著，阻斷病毒在細胞內(nèi)的復制［27］。2005年，Song等［16］發(fā)現(xiàn) EGCG和ECG表現(xiàn)出抑制血凝的活性，且EGCG更為有效；它們對3種不同亞型流感病毒的血凝抑制敏感性差異很大，而且其對流感病毒的抑制作用不僅是由于兒茶素可與血凝素的特異性相互作用，而且還可以改變病毒包膜的物理性質(zhì)。Colpitts等［36］將甲型流感病毒H1N1和H3N2病毒株暴露于100μmol/L EGCG或100μmol/L EC中，測試處理過的病毒粒子對雞紅細胞的血凝能力，發(fā)現(xiàn)EGCG抑制了所有4種病毒株的血凝反應，而EC無明顯作用。同時研究表明EGCG能與唾液酸競爭結(jié)合甲型流感病毒表面糖蛋白，從而抑制血凝反應，抑制病毒體附著。然而與前面的研究不同之處是，它不影響病毒粒子包膜的完整性或流動性。2012年，Liu等［37］報道了4種兒茶素單體對H5N1流感病毒血凝素的抑制作用強弱依次為EGCG＞ECG＞EGC＞EC。通過研究分子結(jié)構(gòu)，他們認為沒食子酸基團和C5位上的羥基可能是抑制HA的主要原因。

HA蛋白前體（HA0）分子水解為HA1和HA2，是流感病毒感染性的先決條件。Kim 等［38］發(fā)現(xiàn)1μmol/L EGCG即可干擾HA0和HA2蛋白分泌，指出EGCG阻斷了流感病毒生命周期的早期步驟。EGCG通過降低病毒包膜的完整性來抑制病毒包膜與細胞膜之間的融合，從而導致流感病毒進入細胞的能力喪失。茶黃素衍生物混合物對病毒血凝素活性的抑制，可能是與病毒血凝素HA2亞基結(jié)合而不與HA1亞基結(jié)合［30-31］。此外，Zu等［30］通過定量聚合酶鏈鎖反應測定發(fā)現(xiàn)TF衍生物能抑制病毒HA基因的復制。

2.2 影響流感病毒在宿主細胞的復制

神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）又稱唾液酸酶，是分布于流感病毒包膜上的一種糖蛋白，可以催化唾液酸水解，協(xié)助成熟流感病毒脫離宿主細胞去感染新的細胞，是病毒復制和擴散的關(guān)鍵酶。NA抑制劑是抗流感病毒重要藥物［39］。研究顯示茶中多酚類物質(zhì)對 NA 有抑制作用［16，39-40］。2005 年，Song等［16］發(fā)現(xiàn)EGCG和ECG是MDCK細胞培養(yǎng)中流感病毒復制的有效抑制劑，在所有檢測的流感病毒亞型（包括A/H1N1、A/H3N2和B型流感病毒）中都觀察到這種作用，與EGC相比，EGCG和ECG對神經(jīng)氨酸酶活性的抑制作用更強。黃深惠等［17］也證實EGCG、ECG等7種茶多酚物質(zhì)對3種亞型流感病毒NA活性均有抑制作用，茶黃素衍生物混合物也能抑制NA活性［29-30］。2016年，Sahoo等［40］利用H1N1-NA的氨基酸序列預測三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在13種被測的不同植物提取物中，綠茶提取物等都對H1N1-NA的結(jié)合有抑制作用，這與它們和NA蛋白的氨基殘基相互作用有關(guān)。2015年，Müller 等［41］發(fā)現(xiàn)兒茶素與流感神經(jīng)氨酸酶的結(jié)合位點可能是在第430位氨基酸鄰近的結(jié)構(gòu)保守腔（被認為是第二個唾液酸結(jié)合位點），因此兒茶素可能通過抑制NA活性部位與唾液酸結(jié)合而抑制病毒從宿主細胞釋放。

流感病毒的RNA聚合酶在病毒生命周期中行使病毒基因組的轉(zhuǎn)錄與復制等功能。由于流感病毒頻繁變異，導致其對傳統(tǒng)抗病毒藥物的敏感度降低。開發(fā)療效好、針對性強、毒性低的新型抗病毒藥物已成為當今研究的一個熱點［42］。甲型流感RNA聚合酶具有內(nèi)切酶活性以消化宿主mRNA，因此，該核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域可作為抗甲型流感病毒藥物的靶點。Song等［16］報道了定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應，結(jié)果顯示600μmol/L高濃度的EGCG和1 200μmol/L高濃度的ECG導致病毒RNA合成下調(diào)，他們認為流感病毒產(chǎn)生量減少不是兒茶素的細胞毒作用，而是兒茶素具有抑制流感病毒RNA合成的能力。據(jù)報道，綠茶兒茶素抑制甲型流感病毒核酸內(nèi)切酶的活性，對接模擬表明沒食子酸與沒食子酸基團的兒茶素能很好地結(jié)合到核酸內(nèi)切酶活動區(qū)的活性囊中，從而實現(xiàn)穩(wěn)定的結(jié)合［43］。核酸內(nèi)切酶除參與核糖核酸轉(zhuǎn)錄后的剪切、修飾和降解外，還可識別外源DNA并將其降解，就生理意義而言，這是一種自身防御能力的體現(xiàn)。甲型流感病毒的核酸內(nèi)切酶活性在茶中兒茶素的干預下受到抑制，其功能即被抑制。

2.3 茶中多酚類化合物的抗氧化作用對流感病毒的影響

據(jù)報道，綠茶提取物不僅抑制甲型和乙型流感病毒在MDCK細胞的生長，在活體熒光顯微鏡下可見，其對宿主細胞溶酶體的酸化有濃度依賴抑制作用［44］。溶酶體是細胞漿內(nèi)單層脂蛋白膜包繞、內(nèi)含一系列酸性水解酶的小體，具有細胞自噬功能，其活性失調(diào)可導致細胞器活動異常，如產(chǎn)生過量反應氧化產(chǎn)物等。綠茶提取物，尤其是綠茶中的兒茶素，是公認的天然抗氧化劑，在茶提取物抗流感病毒研究中，它的強抗氧化性是否具有積極作用也成為研究者們的研究目標。

2012 年，衛(wèi)飛等［45］報道EGCG作用于被甲型H1N1流感病毒感染的宿主細胞后，宿主細胞氧化應激水平顯著增強，顯著降低了細胞內(nèi)活性氧及超氧化物陰離子水平，這表明EGCG抗氧化作用在抗流感病毒病理損傷中起重要作用。此外EGCG還可通過抑制流感病毒所致的宿主細胞自噬，發(fā)揮抗病毒作用。2018年，Lee等［46］研究發(fā)現(xiàn)綠茶提取物的抗病毒活性是由兒茶素與病毒蛋白的氧化交聯(lián)和改變病毒膜物理性質(zhì)介導的。Zu等［30］還發(fā)現(xiàn)茶黃素衍生物還可降低病毒感染過程中白細胞介素-6（interleukin- 6，IL-6）的表達，其抗炎特性可緩解組織損傷和細胞凋亡。在流感病毒復制周期，宿主細胞氧化應激和自噬所導致的氧化還原環(huán)境失衡，從另一個方向解釋了茶中多酚化合物抑制流感病毒活性的機理。兒茶素及其衍生物的強氧化作用，降低了受感染細胞內(nèi)的活性氧及超氧化物陰離子水平，而雙脫氫的兒茶素衍生物茶黃素可能進一步提升了EGCG的抑制效果，它有可能與目前批準上市的抗流感病毒藥物聯(lián)合使用，成為更有效的抗流感病毒藥物［20-21］。

3 茶中多酚類化合物抗流感病毒的流行病學調(diào)查及臨床研究

3.1 直接飲用綠茶抗流感的調(diào)查研究

Park等［47］報道了學齡兒童飲用綠茶與流感感染發(fā)生率的觀察研究，在流感季節(jié)（2008年11月至2009年2月季節(jié)性甲型流感）對日本靜岡（茶園區(qū)）2 663名年齡為6～13歲學生進行了2次飲茶與流感發(fā)病情況的問卷調(diào)查，從回收的2 050份調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，每天飲用1～5杯（1 000～6 200 mL）綠茶與流感感染呈負相關(guān)，顯示飲用綠茶有可能預防流感感染。

3.2 含EGCG的茶膠囊制劑的抗病毒試驗

Rowe等［48］對比觀察茶膠囊組（含EGCG和茶氨酸，相當于10杯綠茶）53名受試者和安慰劑組（不含茶成分）55名受試者，結(jié)果顯示茶膠囊組出現(xiàn)感冒癥狀和流感癥狀人數(shù)比安慰劑組少32.1%（P=0.035）。然而，該研究未將普通感冒和流感病毒感染者分開進行統(tǒng)計分析，也未進行流感抗原檢測，所以無法評價該營養(yǎng)補充劑對預防流感的作用。但該項研究有一個意外發(fā)現(xiàn)，作者分離了志愿參與者的外周血單個核細胞，發(fā)現(xiàn)服用茶膠囊3周可促進T細胞分泌γ-干擾素，這表明服用EGCG和茶氨酸有可能增強人體免疫功能（γδT細胞功能），達到預防普通感冒和流感的目的。

另一項隨機對照研究［49］使用綠茶膠囊（EGCG 378 mg/d、茶氨酸210 mg/d）進行人群干預，根據(jù)臨床癥狀和快速抗原檢測結(jié)果來確認流感患者，發(fā)現(xiàn)綠茶膠囊組有患者4例（4.1%）、安慰劑組有13例（13.1%），這表明服用綠茶膠囊組的臨床流感感染率明顯降低［28］。

3.3 用茶或茶提取物含漱抗病毒試驗

在一項前瞻性隊列研究中，對151名有紅茶含漱習慣的健康參與者和164名無紅茶含漱習慣的健康參與者進行5個月隨訪，根據(jù)抗體滴度檢測，發(fā)現(xiàn)含漱紅茶組健康參與者流感患病率為35.1%，無含漱紅茶組健康參與者流感患病率為48.8%，兩者存在顯著性差異（P＜0.050）［29］。另一項研究用快速抗原法檢測了124名療養(yǎng)院研究對象，3個月后，發(fā)現(xiàn)綠茶提取物含漱組的流感感染率明顯低于水含漱組流感感染率（P=0.028）［50］。

2016 年，Ide等［51］對日本5項茶或茶提取物漱口人群研究進行了Meta分析，受試者年齡跨度從16歲到83歲，受試人數(shù)合計1 890人，綜合分析發(fā)現(xiàn)，用紅茶或綠茶及含EGCG的綠茶提取物漱口顯著降低了流感感染風險，說明用茶或茶成分漱口可能有預防流感的作用。

現(xiàn)有的臨床研究均是將綠茶或紅茶提取物作為營養(yǎng)補充劑或衛(wèi)生用品，以評估預防流感的潛在作用，研究存在諸多局限性，如樣品數(shù)量偏少、研究對象均在日本等，還需要設計更嚴謹?shù)拇髽颖九R床觀察作為依據(jù)，以證明茶提取物漱口具有預防流感的作用。

4 茶中多酚類化合物抗流感病毒產(chǎn)品的應用研究

利用茶多酚的抗流感病毒作用，還可將其做成混合制劑，用作洗手液、噴霧劑、粉末或溶液等抗流感病毒產(chǎn)品［46，52-53］，或者用于抗流感疫苗佐劑等的研發(fā)［54-55］。2012 年，Shin等［52］應用流感病毒皮膚接觸傳播試驗模型評估綠茶提取物作為手消毒劑使用情況，發(fā)現(xiàn)其能清除皮膚表面的病毒。2018年，Lee等［46］發(fā)現(xiàn)綠茶提取物溶液或粉末中添加2%檸檬酸、0.1%苯甲酸鈉和0.2%抗壞血酸作為抗氧化劑，能顯示較強的病毒滅活能力并延長儲存時間至2個月之久，其研究結(jié)果表明基于綠茶提取物的物質(zhì)可成為安全環(huán)保的抗病毒個人衛(wèi)生用品。Lee等［53］的另一項研究發(fā)現(xiàn)，綠茶提取物中的天然兒茶素可作為滅活劑制備滅活病毒疫苗，其對流感病毒和登革熱病毒的滅活作用是完全的和不可逆的。接種綠茶提取物滅活的流感病毒疫苗，其誘導的抗體反應優(yōu)于福爾馬林等傳統(tǒng)的滅活疫苗。Won等［54］發(fā)現(xiàn)綠茶提取物能增強流感病毒裂解疫苗對黏膜免疫的影響。除了綠茶提取物外，劉洪卿等［55］發(fā)現(xiàn)普洱茶提取物能明顯提高H3N2流感病毒無佐劑疫苗的抗體效價，且具有良好的安全性，可作為疫苗佐劑，但究竟是普洱茶中何種成分在發(fā)揮免疫增強作用仍有待研究。

5 總結(jié)與展望

對茶中兒茶素及其衍生物的潛在抗流感病毒作用研究起步于二十多年前，經(jīng)歷了科學探索的一個普遍過程，即由簡到繁、由宏觀至微觀。體內(nèi)外研究揭示了兒茶素及其衍生物抗流感病毒的可能機制，包括抑制流感病毒在宿主細胞的附著、抑制流感病毒在宿主細胞的復制（可能與抑制一些酶的活性有關(guān)，如神經(jīng)氨酸酶和核酸內(nèi)切酶等）以及通過抗氧化作用調(diào)控氧化應激抑制細胞凋亡等。此外，幾項關(guān)于使用茶及其成分含漱的前瞻性隊列及隨機對照的人群試驗顯示出茶及其多酚化合物預防流感感染的效果［29，50-51］。茶中多酚類化合物作為一種潛在的廣譜抗病毒化合物，有可能成為抗流感病毒藥物的前體，或者抗流感病毒的營養(yǎng)補充劑、個人衛(wèi)生用品等。然而，該研究還處于開拓性階段，目前對茶中多酚類化合物的藥效學、藥動學以及安全性研究關(guān)注較少，臨床研究也有局限性。

二十余年來茶中多酚類化合物抗流感病毒的研究發(fā)現(xiàn)了茶黃素及其衍生物可能具有較綠茶兒茶素更強的抗流感病毒的作用。由于這些文獻對試驗材料茶黃素的定義各自不同（紅茶水、茶黃素、TF1、TF3等）導致無法準確確定究竟是哪種化合物，試驗材料定性不清楚，對研究結(jié)果的判定是有影響的。茶黃素是紅茶、普洱熟茶中的一個成分，是茶鮮葉或綠茶在發(fā)酵過程中的初級氧化產(chǎn)物，這種衍生物是否比兒茶素單體具有更強的抗病毒作用呢？有研究提示，云南普洱熟茶中的兒茶素衍生物或聚合而成的高分子量化合物，其清除活性氧自由基的能力比兒茶素EGCG強［56-57］。兒茶素衍生物的生物活性為研究者們提供了一個很有價值的思路。