調(diào)整葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)提高大腸桿菌L-蘇氨酸產(chǎn)量

朱麗飛 ， 王小元

（1. 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室 江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué) 食品安全國際聯(lián)合實驗室，江蘇無錫 214122；3. 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

關(guān)鍵字： 大腸桿菌；L-蘇氨酸；PTS 系統(tǒng)；galP；ptsH；ptsG

L-蘇氨酸是人體必需8 種氨基酸之一，廣泛應(yīng)用于食品添加劑、飼料添加劑、化妝品、醫(yī)藥、水產(chǎn)養(yǎng)殖和保健品等多個領(lǐng)域，是一種非常重要的發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品[1-3]。 大腸桿菌（Escherichia coli）作為一種模式微生物，具有遺傳背景清晰、易改造、生長迅速、對發(fā)酵條件要求低等優(yōu)點，最常用的是L-蘇氨酸生產(chǎn)菌株[4-7]。

磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）依賴的磷酸酶轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（PTS）是大腸桿菌中轉(zhuǎn)運葡萄糖的最主要方式，通過PEP 提供磷酸，把葡萄糖轉(zhuǎn)運到胞內(nèi)的同時使其磷酸化成葡萄糖-6-磷酸 （G-6-P）[8-9]，ptsH 基因編碼PTS 系統(tǒng)中磷酸組氨酸搬運蛋白HPr，ptsG 基因編碼膜透性酶EIICBGlc。 葡萄糖還可以通過galP基因編碼的半乳糖轉(zhuǎn)運蛋白GalP 進(jìn)入胞內(nèi)[10]。 G-6-P 由己糖磷酸異構(gòu)酶PgI（pgi 基因編碼）催化生成6-磷酸果糖（F-6-P），再由磷酸果糖激酶PfkA（pfkA基因編碼）催化生成1，6-二磷酸果糖；由于這一步是糖酵解的關(guān)鍵限速步驟，pfkA 基因的表達(dá)水平一定程度上可以反映出糖酵解的強弱以及糖酵解中碳流到磷酸烯醇式丙酮酸的強弱[11-13]。 PEP 作為糖酵解的產(chǎn)物，由eno 基因編碼的烯醇化酶催化合成，PEP 可被pykA 基因編碼的丙酮酸激酶催化生成丙酮酸，丙酮酸脫氫生成乙酰輔酶A，再經(jīng)gltA 基因編碼的檸檬酸合酶催化生成檸檬酸，進(jìn)入檸檬酸循環(huán)生成草酰乙酸。 草酰乙酸經(jīng)aspC 基因編碼的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶AspC 催化生成天冬氨酸[14]，再經(jīng)thrA 基因編碼的天冬氨酸激酶、thrB 基因編碼的高絲氨酸激酶、thrC 基因編碼的蘇氨酸合成酶等關(guān)鍵酶催化生成L-蘇氨酸，見圖1。

作為 PTS 系統(tǒng)的關(guān)鍵基因，ptsH 和 ptsG 的缺失或者突變會使PTS 系統(tǒng)不能正常轉(zhuǎn)運葡萄糖，而只能利用GalP 系統(tǒng)等其他不消耗PEP 的方式轉(zhuǎn)運葡萄糖[8，15]。 作者在一株大腸桿菌L-蘇氨酸高產(chǎn)菌TWF001 中敲除了ptsH 和 ptsG 基因， 并且在 ptsH的敲除菌基因組上過表達(dá)galP 基因，發(fā)現(xiàn)改善葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)有利于大腸桿菌L-蘇氨酸的合成。

圖1 大腸桿菌中L-蘇氨酸合成代謝路程Fig. 1 Biosynthesis pathway of L-threonine in E. coli

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

本研究所有的菌株和質(zhì)粒見表1， 所有的菌株都為大腸桿菌。 JM109 是用來構(gòu)建質(zhì)粒制作感受態(tài)用，發(fā)酵菌株TWF001 是作者所在實驗室篩到的一株 L-蘇氨酸高產(chǎn)菌， 保藏編號為 CCTCC no.M2017730[17]。 LB 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 10，NaCl 10，酵母粉5， 固體需要添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂。發(fā)酵種子培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 10，NaCl 10，酵母粉5，蔗糖 10，121 ℃滅菌 20 min。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖（30、40、50、60，根據(jù)需要添加），（NH4）2SO425，酵母粉 2，檸檬酸 2，KH2PO47.46，MgSO4·7H2O2，F(xiàn)eSO4·7H2O5，MnSO4·4H2O5，CaCO320；pH 6.8（NaOH 調(diào) pH），115 ℃滅菌 15 min。 酵母粉和蛋白胨：購自O(shè)XIOD 公司；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品：購自Sigma 公司；其他化學(xué)試劑：均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；HPLC 級甲醇和乙腈： 購自蘇州科盛公司；2×Taq PCR MasterMix：購自南京博爾迪生物科技有限公司；QuickCut DpnI 酶、PrimerStar DNA 聚合酶：購自 TaKaRa 公司；T4 DNA 連接酶、 反轉(zhuǎn)錄 cDNA 試劑盒： 購自 Fermentas 公司；T4 多聚核苷酸激酶：購自紐英倫生物技術(shù) （北京） 有限公司；ChamQTMUniversal SYBR qPCR Master Mix： 購自諾唯贊生物；Simply P 總 RNA 提取試劑盒： 購自 Bioflux 公司；質(zhì)粒提取試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒：購自天根生物科技有限公司；SanPrep 柱式PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒： 均購自生工生物工程股份有限公司。

1.2 實驗方法

本研究所有用來構(gòu)建質(zhì)粒和突變菌的引物信息見表 1， 敲除突變菌株所用引物設(shè)計參照MG1655 基因組。 基因組和質(zhì)粒的提取根據(jù)基因組和質(zhì)粒提取試劑盒的說明書進(jìn)行； 基因組片段用PrimerStar DNA 聚合酶 PCR 獲得， 片段回收用SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒，操作見說明書；菌落驗證用 2×Taq PCR MasterMix 進(jìn)行 PCR 驗證。

以 MG1655 基因組為模板， 以引物 ptsHf1/ptsHr1 擴增出ptsH 基因上游片段ptsH-U， 以引物ptsHf2/ ptsHr2 擴增出ptsH 基因上游片段ptsH-D，再通過重疊PCR 把上下游片段重疊到一起得到ptsH 的敲除片段 ptsH-UD。 以 pTargetF 為模板，以引物 sgRNA-ptsH-F/T-sgRNA-R 擴增出構(gòu)建pTargetF-ptsH 的片段， 片段經(jīng)過 DpnI 酶消化，T4 Pnk 激酶磷酸化，T4 DNA 連接酶連接后化轉(zhuǎn)到JM109 感受態(tài)中，構(gòu)建和擴增質(zhì)粒，在含50 mg/L 壯觀霉素的LB 平板上生長10 h 后， 用引物Y-ptsHF/T-sgRNA-R 篩選正確的轉(zhuǎn)化子， 得到敲除質(zhì)粒pTargetF-ptsH。 100 ng 敲除質(zhì)粒 pTargetF-ptsH 和500 ng 敲除片段 ptsH-UD 同時電轉(zhuǎn)入 80 uL 的TWF001/pCas 電轉(zhuǎn)感受態(tài)中，在 30 ℃、100 r/min 慢搖復(fù)蘇2 h，涂在含50 mg/L 壯觀霉素和卡那霉素的LB 平板，30 ℃培養(yǎng) 48 h 后用引物 ptsHf1/ ptsHr2 驗證，得到正確敲除的轉(zhuǎn)化子，正確的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接含50 mg/L 卡那霉素和0.5 mmol/L 異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的 LB 試管誘導(dǎo)培養(yǎng)去除pTargetF-ptsH質(zhì) 粒 ，42 ℃過 夜 培 養(yǎng) 去 除 pCas 質(zhì) 粒 ， 去 除pTargetF-ptsH 和pCas 質(zhì)粒后分別在含壯觀霉素和卡那霉素的LB 平板上進(jìn)行反篩， 確定是否去除質(zhì)粒成功，最后得到不含質(zhì)粒的正確敲除ptsH 基因的突變菌TWF001ΔptsH。

表1 本研究中所用到菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in the study

TWF001ΔptsG 的 構(gòu) 建 過 程 同 上 述TWF001ΔptsH 的構(gòu)建， 所用引物參照表 2 中的ptsGf1/ptsGr1、ptsGf1/ptsGr1、sgRNA -ptsG -F/T -sgRNA-R、Y-ptsG-F/T-sgRNA-R。

TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP 的 構(gòu) 建 是 以MG1655 基因組為模板， 以引物galPf1/galPr1 擴增出galP 基因上游片段galP-U，以引物galPf2/galPr2擴增出galP 基因上游片段galP-D， 引物Trc-F/Trc-R 95 ℃變性、4 ℃退火形成trc 啟動子片段，再通過重疊PCR 把上游、trc 啟動子和下游片段重疊到一起得到galP 的敲入片段trc-galP。以pTargetF 為模板，以引物sgRNA-galP-F/T-sgRNA-R 擴增出構(gòu)建pTargetF-galP 的片段， 片段經(jīng)過 DpnI 酶消化，T4 Pnk 激酶磷酸化，T4 DNA 連接酶連接后化轉(zhuǎn)到JM109 感受態(tài)中，構(gòu)建和擴增質(zhì)粒，在含50 mg/L 壯觀霉素的LB 平板上生長10 h 后，用引物Y-galP -F/T-sgRNA-R 篩選正確的轉(zhuǎn)化子， 得到敲除質(zhì)粒pTargetF-galP。 100 ng 敲除質(zhì)粒 pTargetF-galP 和500 ng 敲除片段 trc-galP 同時電轉(zhuǎn)入 80 uL 的TWF001ΔptsH/pCas 電轉(zhuǎn)感受態(tài)中，在 30 ℃、100 r/min慢搖復(fù)蘇2 h，涂在含50 mg/L 壯觀霉素和卡那霉素的 LB 平板，30 ℃培養(yǎng) 48 h 后用引物 Trc-F/galPr2驗證，得到正確敲入的轉(zhuǎn)化子，正確的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接含50 mg/L 卡那霉素和0.5 mmol/L 異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的LB 試管誘導(dǎo)培養(yǎng)去除pTargetF-galP質(zhì) 粒 ，42 ℃ 過 夜 培 養(yǎng) 去 除 pCas 質(zhì) 粒 ， 去 除pTargetF-galP 和pCas 質(zhì)粒后分別在含壯觀霉素和卡那霉素的LB 平板上進(jìn)行反篩， 確定是否去除質(zhì)粒成功， 最后得到不含質(zhì)粒的正確敲入trc-galP 基因的突變菌 TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP。

表2 本研究構(gòu)建質(zhì)粒和菌株所用引物Table 2 Primers usedused to construct plasmids andstrains in this study

表3 本研究RT-PCR 所用引物Table 3 Primers used for RT-PCR in this study

1.3 發(fā)酵過程參數(shù)測定

1.3.1 生物量的測定 生長在LB 培養(yǎng)基中的種子液的OD600的測定：取1 mL 菌液，再用去離子水稀釋相應(yīng)的倍數(shù)充分混勻， 用紫外分光光度計測定600 nm 下的吸光度，再乘以相應(yīng)倍數(shù)得到最后值。

生長在發(fā)酵培養(yǎng)基中的菌液的OD600的測定：取1 mL 菌液充分混勻，再用去1 mol/L 的稀鹽酸稀釋相應(yīng)的倍數(shù)， 用紫外分光光度計測定在波長為600 nm 下的吸光度，再乘以相應(yīng)倍數(shù)得到最后值。

圖2 菌株構(gòu)建流程和質(zhì)粒圖Fig. 2 Construction process of mutant strains and the map of plasmids

1.3.2 葡萄糖質(zhì)量濃度的測定 發(fā)酵液取樣，發(fā)酵液樣品 12 000 r/min 離心， 取上清液 10 μL 用去離子稀釋100 倍，用SBA40 還原糖測定儀測定葡萄糖的質(zhì)量濃度。

1.3.3 氨基酸含量的測定

1） 樣品預(yù)處理 發(fā)酵液12 000 r/min 離心，取500 μL 上清液加入到 500 μL 的 10%的三氯乙酸溶液中，充分混勻，4 ℃靜置 4 h 以上。 12 000 r/min 離心15 min，用0.22 μm 的水相針式濾膜過濾上清液，上清液稀釋合適的倍數(shù)后用HPLC 測定氨基酸含量。

2） 高效液相色譜 采用鄰苯二甲醛柱前衍生法[18]。 儀器采用 Agilent 1200 超高效液相色譜儀，色譜柱為 Thermo ODS -2HYPERSIL C18 column（250 mm×4.0 mm，USA）。 流動相（水相）：3.01 g 無水乙酸鈉溶解于超純水中，200 μL 三乙胺，5 mL 四氫呋喃，超純水定容到1 L，乙酸調(diào)至pH 7.2。 洗脫相（有機相）：3.01 g 無水乙酸鈉溶解于200 mL 超純水中，用5%醋酸調(diào)至pH 7.2，再加400 mL 的HPLC級甲醇和400 mL 的HPLC 級乙腈。

1.4 實時熒光定量PCR 分析

相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平通過StepOnePlus 實時熒光定量儀（美國Applied Biosystems 公司）檢測，所用引物見表2。發(fā)酵對數(shù)中期的發(fā)酵液，低速短暫離心取上清液去除發(fā)酵液中的CaCO3，12 000 r/min 離心收集菌體，RNA 的提取步驟、cDNA 的反轉(zhuǎn)錄合成以及RT-qPCR 的詳細(xì)步驟及參數(shù)分別按照Bioflux RNA 提取試劑盒說明書、Fermentas 公司反轉(zhuǎn)錄cDNA 試劑盒和諾唯贊生物ChamQTM Universal SYBR qPCR Master Mix 說明書，數(shù)據(jù)的分析參照文獻(xiàn)[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 突 變 菌 TWF001ΔptsH、TWF001ΔptsG 和TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP 的構(gòu)建驗證

3 株突變菌構(gòu)建的電泳驗證結(jié)果見圖3。 對照菌 TWF001 用引物 ptsHf1/ptsHr2 進(jìn)行 PCR 驗證，擴增出1 500 bp 左右大小的條帶， 如1 泳道所示，大小正確；突變菌TWF001ΔptsH 用引物ptsHf1/ptsHr2擴增出了1 200 bp 左右大小的條帶， 如2 泳道所示，大小正確，電泳結(jié)果顯示敲除了正確大小的條帶，ptsH 基因敲除成功。

圖 3 TWF001ΔptsH、TWF001ΔptsG 和 TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP 構(gòu)建驗證Fig. 3 Verification of TWF001ΔptsH，TWF001ΔptsG and TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP by PCR

突變菌 TWF001ΔptsG 用引物 ptsGf1/ptsGr2 PCR 驗證，擴增出1 500 bp 左右大小的條帶，如3泳道所示， 大小正確； 而對照菌TWF001 用引物ptsGf1/ptsGr22 擴增出的片段大小為 3 000 bp 左右，如4 泳道所示，大小正確。 電泳結(jié)果顯示敲除了正確大小的條帶，ptsG 基因敲除成功。

對照菌TWF001 經(jīng)過基因組測序顯示沒有完整的galP 基因， 只存在galP 起始十幾個堿基的片段，且沒有其它同源性較高的序列。 要插入的片段包括一段galP 位置上的上游同源片段、trc 啟動子和galP 基因，大小為2 048 bp，突變菌TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP 用引物 galPf1/galPr2 PCR 驗證，擴增出2 000 bp 左右大小的條帶， 如 5 泳道所示， 大小正確； 而 TWF001ΔptsH 基因組上沒有引物 galPr2 結(jié)合位點， 所以擴增不出條帶， 如6 泳道所示。TWF001 基因結(jié)構(gòu)特殊，galP 基因本身有1 395 bp，在基因組上插入trc 啟動子過表達(dá)galP 基因片段的難度較大。 PCR 驗證正確的轉(zhuǎn)化子，提取基因組，高保真酶擴增插入片段，對片段進(jìn)行測序檢驗，完全正確插入片段并且沒有突變的就是最終正確突變株。

2.2 TWF001ΔptsH 在不同葡萄糖質(zhì)量濃度培養(yǎng)基中的搖瓶發(fā)酵結(jié)果分析

為了進(jìn)一步提高TWF001 的L-蘇氨酸含量，在TWF001 中 敲 除 ptsH 基 因 ， 得 到 突 變 株TWF001ΔptsH。突變株在葡萄糖質(zhì)量濃度為30 g/L[6]的培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測定生長OD600、葡萄糖質(zhì)量濃度和L-蘇氨酸的產(chǎn)量。 為了探究L-蘇氨酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率能否隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的升高進(jìn)一步提升，又分別在含40、50、60 g/L 葡萄糖質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。

出發(fā)對照菌TWF001 和突變菌 TWF001ΔptsH在含 30、40、50、60 g/L 葡萄糖的培養(yǎng)基中的搖瓶發(fā)酵結(jié)果見圖4。

由圖 4（a）可知，TWF001ΔptsH 在各個葡萄糖質(zhì)量濃度中的生長都要比TWF001 慢，生長受到明顯的抑制。 當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為30 g/L 時，TWF001的最大OD600為15.59，當(dāng)葡萄質(zhì)量濃度繼續(xù)升高到40、50 g/L 時，隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的升高，TWF001的生長越好，60 g/L 的葡萄糖就開始抑制菌體的生長。 TWF001ΔptsH 在 30 g/L 葡萄糖中的最大 OD600為12.03，隨著葡萄糖質(zhì)量濃度升高到40、50、60 g/L時，雖然OD600變大了，但是發(fā)酵前期18 h 內(nèi)，菌體生長非常緩慢，不利于發(fā)酵合成L-蘇氨酸。

如圖 4（b）所示，TWF001 在 30 g/L 葡萄糖質(zhì)量濃度發(fā)酵時，發(fā)酵24 h 耗盡葡萄糖；隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的升高， 發(fā)酵36 h 最多能耗掉50 g/L 的葡萄糖。TWF001ΔptsH 在30 g/L 葡萄糖質(zhì)量濃度發(fā)酵時，發(fā)酵30 h 耗盡葡萄糖，隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的升高，耗糖明顯被抑制，發(fā)酵36 h 最多能耗掉40 g/L的糖， 并且當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度等于或者高于40 g/L時，發(fā)酵前18 小時幾乎不消耗葡萄糖，葡萄糖攝取被嚴(yán)重抑制，各個質(zhì)量濃度中的耗糖速度都比對照菌慢。

圖4 TWF001 和TWF001ΔptsH 在葡萄糖質(zhì)量濃度為 30、40、50、60 g/L 的培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵Fig. 4 Flask fermentation of TWF001 and TWF001ΔptsH in medium with 30，40，50，60 g/L glucose

如圖 4（c）所示，TWF001 在 30 g/L 葡萄糖質(zhì)量濃度發(fā)酵時L-蘇氨酸產(chǎn)量為12.97 g/L， 糖酸轉(zhuǎn)化率為0.43 g/g； 隨著葡萄糖質(zhì)量濃度升高到40 g/L時，L-蘇氨酸產(chǎn)量為18.41 g/L， 此時達(dá)到最大轉(zhuǎn)化率0.46 g/g；隨著葡萄糖質(zhì)量濃度升高到50 g/L 時，L-蘇氨酸產(chǎn)量達(dá)到最大的22.56 g/L，轉(zhuǎn)化率下降到0.45 g/g；當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為60 g/L 時，蘇氨酸產(chǎn)量反而下降。TWF001ΔptsH 在30 g/L 葡萄糖發(fā)酵時L-蘇氨酸產(chǎn)量為17.90 g/L， 比對照 TWF001 提高38.01%，這時的轉(zhuǎn)化率為0.60 g/g；葡萄糖質(zhì)量濃度升高到 40 g/L 時，L-蘇氨酸產(chǎn)量達(dá)到最大的22.16 g/L，但是轉(zhuǎn)化率下降到0.58 g/g，隨著葡萄糖質(zhì)量濃度升高到50、60 g/L 時， 蘇氨酸產(chǎn)量反而下降，并且比對照菌要低。

ptsH 基因的敲除在30、40 g/L 葡萄糖質(zhì)量濃度時能明顯地提高L-蘇氨酸的產(chǎn)量以及糖酸轉(zhuǎn)化率，但是生長和糖耗受到抑制，并且40 g/L 的葡萄糖就開始明顯抑制生長和糖耗，降低轉(zhuǎn)化率，只適合在30 g/L 的葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵。

2.3 TWF001ΔptsG 在不同葡萄糖質(zhì)量濃度培養(yǎng)基中的搖瓶發(fā)酵結(jié)果分析

為了進(jìn)一步提高TWF001 的L-蘇氨酸含量，在TWF001 中 敲 除 ptsG 基 因 ， 得 到 突 變 株TWF001ΔptsG。 突變株在 30 g/L 葡萄糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測定生長OD600、葡萄糖質(zhì)量濃度和L-蘇氨酸的產(chǎn)量。 為了探究L-蘇氨酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率能否隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的升高進(jìn)一步提升，又分別在含40、50、60 g/L 葡萄糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。

出發(fā)對照菌 TWF001 和突變菌TWF001ΔptsG在含 30、40、50、60 g/L 葡萄糖的培養(yǎng)基中的搖瓶發(fā)酵結(jié)果見圖5。

如圖 5（a）所示，TWF001ΔptsG 在各個葡萄糖質(zhì)量濃度中的生長比TWF001 要慢一些，但生長沒有受到太大的抑制。 當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為30 g/L 時，TWF001ΔptsG 的最大 OD600為 11.61，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度繼續(xù)升高到40、50 g/L 時， 隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的升高，菌體生長的越好，60 g/L 的葡萄糖在發(fā)酵前18 小時抑制菌體的生長。

如圖 5（b）所示，TWF001ΔptsG 在 30 g/L 葡萄糖發(fā)酵時，發(fā)酵24 h 耗盡葡萄糖，與對照TWF001一致； 并且在40、50 g/L 的葡萄糖中的耗糖速度與對照菌十分接近，沒有明顯被抑制，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度升高到60 g/L 時，突變菌的葡萄糖攝取才表現(xiàn)出明顯被抑制。

圖5 TWF001 和TWF001ΔptsG 在葡萄糖質(zhì)量濃度為30、40、50、60 g/L 的培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵Fig. 5 Flask fermentation of TWF001 and TWF001ΔptsG in medium with 30，40，50，60 g/L glucose

如圖 5（c）所示，TWF001ΔptsG 在 30 g/L 葡萄糖發(fā)酵時 L-蘇氨酸產(chǎn)量為 17.59 g/L， 比對照TWF001 提高了35.62%，這時的轉(zhuǎn)化率為0.59 g/g；當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度升高到40 g/L 時，L-蘇氨酸產(chǎn)量為25.23 g/L，比對照TWF001 提高37.05%，為這個菌的最高幅度，此時的轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大0.63 g/g；當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度升高到50 g/L 時，L-蘇氨酸產(chǎn)量達(dá)到最大的28.39 g/L，只比對照提高了25.84%，轉(zhuǎn)化率也下降為0.57 g/g， 當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度升高到60 g/L 時，蘇氨酸產(chǎn)量反而下降。

ptsG 基因的敲除既能能明顯提高L-蘇氨酸的產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率，40 g/L 葡萄糖時達(dá)到最大的轉(zhuǎn)化率和L-蘇氨酸產(chǎn)量提升幅度，是最適宜的葡萄糖質(zhì)量濃度。

2.4 TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP 在不同葡萄糖質(zhì)量濃度培養(yǎng)基中的搖瓶發(fā)酵結(jié)果分析

上述發(fā)酵結(jié)果顯示，在30 g/L 葡萄糖培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，TWF001ΔptsH 的L-蘇氨酸產(chǎn)量為17.90 g/L，TWF001ΔptsG 的 L-蘇氨酸產(chǎn)量為 17.59 g/L。為了進(jìn)一步提高L-蘇氨酸產(chǎn)量， 在TWF001ΔptsH的基因組上用trc 啟動子過表達(dá)galP 基因， 得到突變株 TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP。 對突變株在 30 g/L葡萄糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，為了探究L-蘇氨酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率能否隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的升高進(jìn)一步提升，又分別在含40、50、60 g/L 葡萄糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。

出發(fā)對照菌TWF001 和突變菌TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP 在含 30、40、50、60 g/L 葡萄糖的培養(yǎng)基中的搖瓶發(fā)酵結(jié)果見圖6。

《太原縣志》中記載，明清時期風(fēng)峪溝內(nèi)水患嚴(yán)重，明洪武、嘉靖年間、清乾隆元年、十七年、三十三年、四十年均爆發(fā)過大規(guī)模的洪災(zāi)，對人畜、建筑、交通要道有較大的損害。在清乾隆四十一年完成對沙堰的修建之后，“工竣，而城北等村可永免山水沖突之患矣”[11]。從現(xiàn)存周家莊古村建筑建造手法及建筑材料可以看出，村中建筑呈現(xiàn)由高向低，由東向西發(fā)展的趨勢，就是村民為防止水患危害，而采用的布局形式（圖2）。

如圖 6（a）所示，TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP 在30、50、60 g/L 葡萄糖中的生長比 TWF001 要慢一些，但生長沒有受到太大的抑制。 當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為 30 g/L 時，TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP 的最大OD600為12.32；當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度繼續(xù)升高到40 g/L時，生長達(dá)到最好，并且比對照TWF001 略好。 升高到 50 g/L 時， 最大 OD600開始下降， 當(dāng)繼續(xù)升高到60 g/L 時，生長開始受到較明顯的抑制。

如圖 6（b）所示，TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP 在30 g/L 的葡萄糖中的耗糖速度與對照菌幾乎一致，發(fā)酵18 h 耗盡30 g/L 的葡萄糖， 當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度高于40 g/L 時，耗糖受到一定抑制，且質(zhì)量濃度越高抑制越明顯，發(fā)酵36 h，最多能耗盡40 g/L 的葡萄糖。

圖 6 TWF001 和 TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP 在葡萄糖質(zhì)量濃度為30、40、50、60 g/L 的培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵情況Fig. 6 Flask fermentation of TWF001 and TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP in medium with 30，40，50，60 g/L glucose

如圖 6（c）所示，TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP 在30 g/L 葡萄糖發(fā)酵時L-蘇氨酸產(chǎn)量為17.66 g/L，比對照TWF001 提高了36.16%， 這時的轉(zhuǎn)化率為0.60 g/g；當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度升高到40 g/L 時，L-蘇氨酸產(chǎn)量為 26.16 g/L， 比對照 TWF001 提高了42.10%，為3 株突變菌的最高幅度，此時的轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大的0.65 g/g，也是所有菌中最高的；當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度升高到50、60 g/L 時，L-蘇氨酸產(chǎn)量分別下降到到21.43、20.16 g/L。

ptsH 基因的敲除能提高L-蘇氨酸的產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率， 但是ptsH 的生長和糖耗受到明顯的抑制，在敲除ptsH 突變菌的基礎(chǔ)上用trc 啟動子過表達(dá)galP 基因，不僅能改善生長和葡萄糖攝取[20]，還能進(jìn)一步提高L-蘇氨酸的產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率。

2.5 基因ptsH 和ptsG 的敲除以及galP 的過表達(dá)對L-蘇氨酸合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平的影響

為了探究造成這3 株突變菌L-蘇氨酸產(chǎn)量差異的原因，對大腸桿菌中影響L-蘇氨酸合成的相關(guān)基因 thrA、thrB、thrC、pfkA、eno、pykA、gltA、gdhA 和aspC 進(jìn)行了實時熒光定量PCR 分析。 如圖7 所示，TWF001ΔptsH 中 thrA、thrB 和 thrC 的表達(dá)都有所提高，thrC 上升的最明顯， 這可能是蘇氨酸產(chǎn)量增加的主要原因之一；eno 基因明顯提高有利于合成更多的PEP[21]，pykA 基因的上調(diào)雖然不利于積累PEP，但有利于糖酵解的順利進(jìn)行合成丙酮酸，pfkA和gltA 基因是糖酵解和TCA 循環(huán)的關(guān)鍵限速步驟，它們的下調(diào)比較不利于生長[5]，這可能是TWF001ΔptsH 生長和糖耗受到抑制的原因之一。TWF001ΔptsG 中 thrA 基因明顯上調(diào)， 使得蘇氨酸合成加強，pfkA 和eno 基因上調(diào)的比較明顯， 這表示糖酵解的碳流和流向PEP 的碳流的提高，這有利于糖酵解和合成更多的PEP[11-13]，更多的PEP 供應(yīng)于蘇氨酸的合成，pykA 基因的上調(diào)也使得生長更好，gdhA 基因的上調(diào)有利于合成更多谷氨酸， 而胞內(nèi)氮源絕大部分來自谷氨酸[21]，有利于L-蘇氨酸的合成，apsC 基因的上調(diào)有利于合成天冬氨酸， 天冬氨酸是重要的蘇氨酸前體物質(zhì)。 在TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP 中，thrA、thrB、thrC、gdhA 和 aspC 這些基因都有明顯的上調(diào)，這些基因的上調(diào)都直接有利于L-蘇氨酸的合成， 這些可能是TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP 的L-蘇氨酸產(chǎn)量的提升幅度和糖酸轉(zhuǎn)化率最高的原因；eno 基因也明顯上調(diào)有助于PEP的合成，但是pfkA 和gltA 基因上調(diào)較弱，不利于糖酵解和TCA 循環(huán)。

TWF001、TWF001ΔptsH 和 TWF001ΔptsG 中沒有g(shù)alP 基因，3 株菌中g(shù)alP 的相對表達(dá)量相同，都為 1；TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP 中 galP 的相對表達(dá)量上升到16.2，提升幅度較大，表明插入基因組上的galP 基因得到表達(dá)。

圖7 L-蘇氨酸合成相關(guān)基因的實時熒光定量PCR 分析Fig. 7 RT -qPCR analysis of genes involved in L -threonien synthesis

3 結(jié) 語

在一株高產(chǎn)L-蘇氨酸的大腸桿菌中分別單獨敲除ptsH 和ptsG 基因，并在ptsH 敲除菌的基礎(chǔ)上過表達(dá)galP 基因，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，都能較大幅度提高L-蘇氨酸產(chǎn)量和提高糖酸轉(zhuǎn)化率，且菌株不攜帶任何表達(dá)質(zhì)粒，有利于工業(yè)發(fā)酵。

ptsG 編碼PTS 系統(tǒng)中特異識別結(jié)合葡萄糖的膜結(jié)合蛋白EIICBGlc，ptsH 編碼PTS 中磷酸組氨酸搬運蛋白HPr，是轉(zhuǎn)運磷酸基團過程的一種蛋白質(zhì)，但是它為PTS 系統(tǒng)轉(zhuǎn)運其他物質(zhì)所共用。 敲除這兩個基因都能使PTS 系統(tǒng)轉(zhuǎn)運葡萄糖受阻，從而通過其他轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)如GalP 和MglABC 轉(zhuǎn)運葡萄糖，能使用于PTS 系統(tǒng)轉(zhuǎn)運葡萄糖消耗的PEP 積累而用于代謝合成如L-蘇氨酸；RT-qPCR 也顯示這兩個基因的敲除能增加L-蘇氨酸合成相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)蘇氨酸的合成。

對 TWF001、TWF001ΔptsH 和 TWF001ΔptsG進(jìn)行搖瓶發(fā)酵， 此時葡萄糖質(zhì)量濃度為30 g/L，TWF001ΔptsH 的生長和糖耗沒有受到非常明顯抑制， 此時它的L-蘇氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率是最高的， 為了進(jìn)一步提高TWF001ΔptsH 的生長糖耗和L-蘇氨酸產(chǎn)量，在基因組上用trc 過表達(dá)galP 基因。GalP 蛋白轉(zhuǎn)運的葡萄糖只需要消耗一分子ATP，積累的PEP 可大部分用于合成代謝，而且能改善葡萄糖的攝取速度。 繼續(xù)提升培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度，并進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，研究結(jié)果顯示TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP 在40 g/L 的葡萄糖質(zhì)量濃度時達(dá)到最大的L-蘇氨酸產(chǎn)量26.16 g/L，提高幅度為42.11%，轉(zhuǎn)化率能達(dá)到0.65 g/g。 先敲除PTS 系統(tǒng)中與轉(zhuǎn)運葡萄糖相關(guān)的編碼基因，使細(xì)菌不能以PTS 系統(tǒng)為主要的轉(zhuǎn)運葡萄糖的途徑，從而減少用于轉(zhuǎn)運葡萄糖所需要的PEP，這樣來自糖酵解的PEP 可大部分用于合成代謝， 再過表達(dá)GalP 這樣不需要消耗其他重要中間代謝物的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)，這樣在不嚴(yán)重影響生長和糖耗的同時能大幅度提高L-蘇氨酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率。

之前有文獻(xiàn)報道敲除ptsG 或者ptsH 基因可以用來生產(chǎn)其他物質(zhì)[22-24]，本試驗在一株高產(chǎn)L-蘇氨酸中只敲除ptsH、ptsG 以及過表達(dá)galP 就能較大幅度的提升產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率，效果是十分明顯的，這在工業(yè)應(yīng)用上是比較有利的，但還可以進(jìn)一步繼續(xù)改造，使得生長和糖耗進(jìn)一步提升。

因為本出發(fā)菌基因組結(jié)構(gòu)較MG1655 復(fù)雜，生長緩慢、單菌落非常小，構(gòu)建較困難，可以繼續(xù)在本研究的基礎(chǔ)上，在突變菌TWF001ΔptsG 中用trc 過表達(dá) galP 基因， 以及在 TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP中過表達(dá)glk 基因，探究生長和L-蘇氨酸產(chǎn)量情況并進(jìn)行其他能提高蘇氨酸產(chǎn)量的代謝改造。