TAT-SOD 在長期保藏的重組畢赤酵母中表達(dá)的條件優(yōu)化

李孔翰， 陳玲琳， 周建森， 劉樹滔

（福州大學(xué) 生物工程研究所，福建 福州 350002）

超氧化物歧化酶 （Superoxide Dismutase， 簡稱SOD）是一種含金屬的、人體最重要的抗氧化酶，它在維持機(jī)體自由基產(chǎn)生和消除之間的動(dòng)態(tài)平衡方面起著重要作用[1]。 SOD 可分為 CuZn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD 等 3 種類型。 其中 CuZn-SOD 分布最廣，廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、過氧化物酶體及線粒體膜間隙中， 對(duì)防御內(nèi)源性和外源性活性氧毒性、預(yù)防衰老以及炎癥等方面有重要意義[2-5]。 目前CuZn-SOD 雖然已在食品、醫(yī)藥、化妝品等方面有所應(yīng)用，但由于它是大分子蛋白質(zhì)，細(xì)胞膜通透性差。這限制了SOD 的實(shí)際應(yīng)用。 TAT-SOD 是TAT 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域與CuZn-SOD 的融合蛋白質(zhì)， 其中的TAT 片段可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)功能[6]。 TATSOD 作為獨(dú)特的新型抗氧化酶，改善了細(xì)胞膜通透性差的問題，因此具有較大的應(yīng)用潛力[7]。

巴斯德畢赤酵母作為甲醇營養(yǎng)酵母，近年來被公認(rèn)為最優(yōu)秀、應(yīng)用最廣泛的外源基因表達(dá)系統(tǒng)之一[8]。 作者所在實(shí)驗(yàn)室的陳瑩等 2007 年構(gòu)建了TAT-SOD 的重組畢赤酵母表達(dá)菌株，實(shí)現(xiàn)了TATSOD 在該菌株的高水平表達(dá)[9]。 由于發(fā)酵條件（包括pH 值、培養(yǎng)溫度、溶解氧、甲醇濃度、誘導(dǎo)時(shí)間等）的優(yōu)化是提高外源蛋白質(zhì)在畢赤酵母表達(dá)水平的重要手段， 陳躬瑞等對(duì)搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，使SOD 酶活水平從 289 U/mL 提高到 475 U/mL[10]。 類似，張海玲等使用畢赤酵母密碼子的偏好性構(gòu)建了能高效分泌表達(dá)人源CuZn-SOD 的畢赤酵母工程菌，用來優(yōu)化表達(dá)以提高產(chǎn)量[11]。鄭屹峰等通過搖瓶實(shí)驗(yàn)，研究了不同因素對(duì)人CuZn-SOD 在畢赤酵母中表達(dá)的影響[12]。 但這些研究對(duì)SOD 表達(dá)優(yōu)化的內(nèi)在機(jī)制， 如目的基因轉(zhuǎn)錄水平的差異尚未深入分析。 另外，表達(dá)菌株可能因長期保藏而發(fā)生退化，目前很少對(duì)長期保藏菌株表達(dá)目的蛋白質(zhì)的優(yōu)化條件進(jìn)行研究。 作者以2007 年構(gòu)筑并長期保藏在-20 ℃的TAT-SOD 重組畢赤酵母菌作為出發(fā)表達(dá)菌株，研究搖瓶實(shí)驗(yàn)的誘導(dǎo)劑體積分?jǐn)?shù)、誘導(dǎo)溫度、初始pH 等因素對(duì)發(fā)酵菌株的生物量、TAT-SOD 的蛋白質(zhì)表達(dá)水平和酶活的影響， 并通過熒光定量PCR 測定目的基因的mRNA 的表達(dá)水平等方法分析優(yōu)化表達(dá)的內(nèi)在機(jī)制，以期更大程度地獲得目的蛋白質(zhì)，為TAT-SOD 的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)條件提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種與質(zhì)粒

-20 ℃低溫長時(shí)間保存表達(dá)TAT-SOD 菌株P(guān)ichia pastoris X33：福州大學(xué)生物工程研究所提供。

1.2 儀器設(shè)備與藥品

高速離心機(jī)Avanti TMJ-251：日立公司；紫外分光光度計(jì)型號(hào)U-1900：日本HITACHI 公司；蛋白質(zhì)電泳儀： 日本 ATTO 公司； 恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZHWY-200B）：上海智城分析儀器有限公司；Yeast Extract 和 Tryptone：OXOID 公司；鹽酸羥胺、對(duì)氨基苯磺酸、甲萘胺、冰醋酸、甘油、葡萄糖等：均為分析純， 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司； 黃嘌呤氧化酶：Roche Diagnlstics 公司。

1.3 培養(yǎng)基

種子液培養(yǎng)基YPD（組分g/L）：酵母膏10，蛋白胨20，葡萄糖10；搖瓶誘導(dǎo)培養(yǎng)基（組分g/L）：酵母膏10，蛋白胨 20，葡萄糖 10。 YPDM 培養(yǎng)基：體積分?jǐn)?shù)0.5%~3.0%甲醇；固體培養(yǎng)基在YPD 培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂粉。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 菌種的活化及培養(yǎng)方法 菌種活化步驟是將菌株涂布在含有Zeocin 的YPD 固體培養(yǎng)基上活化，在30 ℃條件生長24~36 h，將平板上的單菌落平板劃線或者在試管中斜面劃線，在30 ℃生長24~36 h 后在4 ℃冰箱保存。

搖瓶培養(yǎng)：4 ℃冰箱中取出保存菌株接種于100 mL YPD 種子液培養(yǎng)基三角瓶中培養(yǎng) （裝液量25 mL），同時(shí)加入體積分?jǐn)?shù)0.1% Zeocin，培養(yǎng)至一定濃度以體積分?jǐn)?shù)1.0%轉(zhuǎn)接于含有0.1%Zeocin 的YPDM 誘導(dǎo)培養(yǎng)基三角瓶，15 h 后用誘導(dǎo)劑甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，甲醇誘導(dǎo)每24 小時(shí)補(bǔ)加一次，誘導(dǎo)前后每24 小時(shí)取樣， 共培養(yǎng) 135~159 h。 搖瓶裝液量為100 mL（500 mL 三角瓶）［13］，于 30 ℃轉(zhuǎn)速 200 r/min搖床培養(yǎng)。

1.4.2 比色分析法測定菌體濃度 使用比色法測定菌體濃度， 以紫外分光光度計(jì)600 nm 波長處的光密度值 OD600表示［14］。 從斜面將接種體積分?jǐn)?shù)1.0%畢赤酵母于25 mL YPD 培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，每隔2 小時(shí)取樣，測量樣品菌體濃度OD600值，直至數(shù)值趨于穩(wěn)定為止。 共持續(xù)32 h，取樣16 次，以O(shè)D600為縱坐標(biāo)， 時(shí)間為橫坐標(biāo)作種子液培養(yǎng)基生長曲線。將OD600為15，搖瓶培養(yǎng)20 h 的種子液按接種體積分?jǐn)?shù)1.0%接種于YPD 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，確定誘導(dǎo)培養(yǎng)基生長曲線。 每次試驗(yàn)都有一次重復(fù)試驗(yàn)，其中每批試驗(yàn)的各個(gè)梯度都做了3 個(gè)平行。

1.4.3 超氧陰離子自由基清除法測定酶活及不同表達(dá)條件目的蛋白質(zhì)SDS-PAGE 分析 SOD 酶活測定：鹽酸羥胺法測定［15］。 通過黃嘌呤氧化酶對(duì)黃嘌呤的催化作用， 可以產(chǎn)生超氧陰離子自由基，同時(shí)使鹽酸羥胺氧化成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽在對(duì)氨基苯磺酸與甲萘胺的共同作用下表現(xiàn)紫紅色。 采用紫外分光光度計(jì)測定了530 nm 處的吸光度。 當(dāng)樣品中含有抑制超氧陰離子自由基生成的組分時(shí)，樣品中的亞硝酸鹽含量降低。 最后測量吸光值時(shí)，樣品的氧化活性越高其吸光值就越低。 因此，樣品抗氧化活性可以用分光光度法測定。

樣品酶活測定取離心發(fā)酵上清液（4 ℃、12 000 r/min，5 min）； 發(fā)酵液上清液的 SDS-PAGE 分析及目的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量確定的具體步驟參照文獻(xiàn)[15]。 采用SPSS 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，每組重復(fù)3 次，3 次測定結(jié)果的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于±10%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果做3 個(gè)平行，結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差±5%，否則不予使用。

1.4.4 目的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)測定 作者以Invitrogen 公司的畢赤酵母表達(dá)說明書為參考，先從平板上挑取重組菌株置于YPD 種子液培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)20 h 后， 按1.0%的接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接至100 mL 的YPDM 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 加入體積分?jǐn)?shù)1.0%甲醇誘導(dǎo)，30 ℃搖瓶培養(yǎng)， 每隔24 小時(shí)取樣并添加甲醇作為誘導(dǎo)劑， 在誘導(dǎo)4 d 后將發(fā)酵液收集， 進(jìn)一步離心后取上清液做SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)。

1.4.5 TAT-SOD 基因的熒光定量PCR 分析 采用UNIQ-10 柱Trizol 總RNA 提取試劑盒提取表達(dá)菌株總RNA, 使用第一鏈cDNA 合成試劑盒合成的cDNA 進(jìn)行定量PCR 試驗(yàn), 試驗(yàn)方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。 根據(jù)TAT-SOD 基因序列設(shè)計(jì)定量PCR的引物 SOD-F2 （5′-TCAACCCATTGTCCAGAAAG C-3′）和 SOD-R2（5′-GGTCACCAGACAAAGAGAT AACAGA-3′）。 定量 PCR 采用 ABI Stepone plus 型熒光定量 PCR 儀， 實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系為：0.4 μL 的引物F2（10 mmol/L），0.4 μL 的引物 R2（10 mmol/L），10 μL 的 SYBR Green qPCR Master Mix （2X），2 μL模板 cDNA，，加無菌水至 20 μL。 定量 PCR 擴(kuò)增程序按照標(biāo)準(zhǔn)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性5 s；60 ℃退火加延伸 30 s；45 個(gè)循環(huán)，其中融解曲線的程序溫度為 65~95 ℃。 實(shí)驗(yàn)所用試劑為SybrGreen SG Fast qPCRMaster Mix 購自 BBI 公司，相對(duì)表達(dá)量計(jì)算采用 2－△△CT法。

2 結(jié)果與討論

2.1 種子液的生長曲線

比色分析法測定菌體濃度從而制作生長曲線。從斜面將菌體接種于搖瓶培養(yǎng)后，每隔2 小時(shí)取樣測量菌體濃度，結(jié)果見圖1。 從圖1 可知，種子液在搖瓶培養(yǎng) 18~22 h 之間， 即 OD600在 10~21 范圍內(nèi)時(shí)，菌體生長處于指數(shù)期且濃度較高，比較合適接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

2.2 菌株在YPDM 誘導(dǎo)培養(yǎng)基的生長曲線

誘導(dǎo)時(shí)需要較強(qiáng)的菌體活力與一定菌體濃度，因此將 OD600為 15， 搖瓶培養(yǎng) 20 h 的 YPD 種子液按接種體積分?jǐn)?shù)1%接種于YPDM 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，并每隔2 小時(shí) 取樣，使用比色分析法測定菌體濃度得到生長曲線。 從圖2 可以看出， 菌體在培養(yǎng)10~16 h 為指數(shù)期，為得到一定菌體濃度與較高菌體活力，在培養(yǎng) 12~16 h（OD600為 5~17 范圍內(nèi)）時(shí)誘導(dǎo)較為合適。

圖1 種子液的生長曲線Fig. 1 Growth curve of seed broth

圖2 菌株在YPDM 培養(yǎng)基的生長曲線Fig. 2 Strains growth curve in YPDM medium

2.3 誘導(dǎo)劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)目的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響

在30 ℃搖床培養(yǎng)15 h 后， 每天加入不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)。 誘導(dǎo)劑體積分?jǐn)?shù)分別為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%。誘導(dǎo)開始及隨后的每24 小時(shí)取樣，測定樣品菌體濃度和酶活，并進(jìn)行上清液SDS-PAGE 分析，結(jié)果見圖 3。

圖3 不同體積分?jǐn)?shù)誘導(dǎo)劑的生長曲線、 酶活變化及SDS-PAGE 電泳圖Fig. 3 Effect of different inducer concentration on cell growth, enzyme production and SDS-PAGE result

從圖 3（a）和圖 3（b）可看出，當(dāng)誘導(dǎo)劑體積分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)，樣品的菌體濃度達(dá)到最高，酶活達(dá)到最高。經(jīng) SPSS 軟件分析，圖3（a）各梯度濃度菌體生長 159 h 時(shí) F 值為 178.90，圖 3（b）各梯度濃度酶活159 h 時(shí) F 值為 885.98，查表得 F0.01（3，4）=16.69，各組顯著差異（P<0.05）。由此可見，誘導(dǎo)劑甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌體濃度和SOD 酶活的影響顯著。誘導(dǎo)劑的每天補(bǔ)加量大于體積分?jǐn)?shù)1.0%時(shí)，前期菌體生長和蛋白質(zhì)表達(dá)差異不明顯，但后期酵母可能因甲醇中毒導(dǎo)致生長和表達(dá)蛋白質(zhì)受到抑制；每天補(bǔ)加量少于體積分?jǐn)?shù)1.0%時(shí)菌體生長較慢， 酶活也提高緩慢。因?yàn)楫叧嘟湍敢哉T導(dǎo)劑甲醇為其惟一碳源時(shí)，若甲醇體積分?jǐn)?shù)過低將限制菌體生長。 從圖3（b）可看出，每天補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)1.0%甲醇在誘導(dǎo)111 h 后增加不明顯。 圖 3（c）的 SDS-PAGE 結(jié)果也可以看出，試驗(yàn)中誘導(dǎo)劑體積分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)最佳，體積分?jǐn)?shù)過低限制菌體生長，影響目的蛋白質(zhì)的表達(dá)；在此體積分?jǐn)?shù)以上目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)逐漸下降，可能是由于畢赤酵母以甲醇為惟一碳源。 其代謝產(chǎn)物甲醛和過氧化氫的積累對(duì)畢赤酵母有毒害作用［16］，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)的誘導(dǎo)時(shí)間定為111 h， 每日加入體積分?jǐn)?shù)1.0%甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)。

2.4 發(fā)酵初始pH 值對(duì)目的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響

為了調(diào)整YPDM 誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH 值， 使用檸檬酸緩沖液和磷酸緩沖液將初始pH 值分別調(diào)為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。 將酵母于 30 ℃搖床培養(yǎng)，在15 h 后用體積分?jǐn)?shù)1.0%甲醇持續(xù)進(jìn)行誘導(dǎo)159 h，誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后每 24 小時(shí)取樣測定樣品， 培養(yǎng)基pH 變化見表1，最終菌體濃度、酶活和SDS-PAGE電泳圖見圖4。

表1 不同 pH 值培養(yǎng)基在培養(yǎng)前后 pH 值的變化Table 1 The change of pH value in different pH medium before and after fermentation

圖4 不同初始pH 值的生長曲線、酶活變化及SDS-PAGE電泳圖Fig. 4 Effect of different initial pH value on cell growth,enzyme production and SDS-PAGE result

由表1 可知， 使用緩沖溶液可以將pH 值穩(wěn)定在一定范圍，說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定參考價(jià)值。 各梯度初始 pH 值得到159 h 酶活數(shù)據(jù)經(jīng) SPSS 軟件分析得 F 值為 946.64，查表 F0.01（4，5）=11.39，各組差異顯著（P<0.05）。 這表示不同初始pH 值對(duì)菌株酶活、目的蛋白質(zhì)表達(dá)水平有較大影響。比較圖4（b）中各梯度初始pH 所對(duì)應(yīng)表達(dá)酶活，在初始pH 值為5.0以下時(shí)酶活很低，pH 值為 7.0 時(shí)酶活最高。 從圖4（a） 可以看出，初始 pH 值小于 5.0 時(shí)菌株可以生長但比較緩慢，在pH 6.0～8.0 時(shí)生長較快，說明該菌株有較強(qiáng)的pH 適應(yīng)性。 圖4（c）也說明目的蛋白質(zhì)表達(dá)受不同初始pH 影響明顯，隨著pH 值的升高，電泳目的條帶也逐漸增粗，pH 值達(dá)到6.0～8.0 后，繼續(xù)提高pH 值對(duì)目的蛋白質(zhì)表達(dá)水平影響不大，初始pH 值達(dá)到7.0 后蛋白質(zhì)表達(dá)較好。 綜上可知，相比于菌體生長情況， 不同初始pH 范圍對(duì)酶活和蛋白質(zhì)表達(dá)有較大影響，因此以7.0 為最佳初始pH 值。

2.5 誘導(dǎo)溫度對(duì)目的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響

畢赤酵母通常在 30 ℃時(shí)利于外源蛋白質(zhì)表達(dá)，當(dāng)溫度高于 32 ℃時(shí)，酵母的外源蛋白質(zhì)表達(dá)受到較大影響。 在上述優(yōu)化條件基礎(chǔ)上確定誘導(dǎo)溫度，分別選取在 28、30、32 ℃共3 個(gè)溫度培養(yǎng)菌株，并使用體積分?jǐn)?shù)1%甲醇誘導(dǎo)111 h，測定最終菌體濃度（OD600）和酶活，結(jié)果見圖 5（a）和圖 5（b），培養(yǎng)上清液蛋白質(zhì)電泳圖見5（c）。

SPSS 軟件結(jié)果顯示，F(xiàn) =157.65，F(xiàn)0.01（2，3）=30.82，各組間差異有顯著性（P<0.05），表明溫度對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)有顯著影響。 當(dāng)誘導(dǎo)溫度為30 ℃時(shí)，酶活性和目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)水平最高。

從圖5（a）可以看出，在試驗(yàn)的 3 個(gè)溫度下，隨著溫度的升高，菌體生長加快，在 30 ℃和 32 ℃得到較高的菌體濃度，在30 ℃菌體生長最好。 從圖5（b）可以看出，在 30 ℃時(shí)，測得的酶活最高，在 32 ℃時(shí)酶活降低較多。 圖5（c）電泳結(jié)果說明，30 ℃時(shí)菌體外源蛋白質(zhì)表達(dá)最大。 雖然畢赤酵母在 28～32 ℃時(shí)菌體均迅速生長，但低的誘導(dǎo)溫度使菌體濃度和表達(dá)外源蛋白質(zhì)不足，高溫下外源蛋白質(zhì)表達(dá)受到抑制。 所以選取30 ℃作為TAT-SOD 表達(dá)菌株的生長溫度和最佳誘導(dǎo)表達(dá)溫度。

2.6 目的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)最終優(yōu)化條件測定

TAT-SOD 酵母菌株X33 搖瓶試驗(yàn)得到菌體濃度和SOD 酶活見圖6（a），上清液菌體樣品SDS-PAGE見圖 6（b）。 確定發(fā)酵條件為：經(jīng)過 20 h 搖瓶培養(yǎng)OD600為15 的YPD 種子液按接種體積分?jǐn)?shù)1.0%接種到Y(jié)PDM 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在優(yōu)化搖瓶發(fā)酵條件下（培養(yǎng)15 h 時(shí)誘導(dǎo)，誘導(dǎo)劑體積分?jǐn)?shù)1.0%，誘導(dǎo)溫度 30 ℃，初始 pH 值為 7.0），誘導(dǎo) 159 h 后收樣，發(fā)酵液上清液酶活水平為753 U/mL， 較初始提高5.1倍。

圖5 不同誘導(dǎo)溫度的生長曲線、 酶活變化及SDS-PAGE電泳圖Fig. 5 Effect of different inducing temperature on cell growth, enzyme production and SDS -PAGE result

圖6 搖瓶發(fā)酵酶活、 菌體生長曲線和樣品SDS-PAGE 電泳圖Fig. 6 The enzyme production, cell growth and SDSPAGE result of induced expression in shake flask fermentation

從圖6（a）可以看出，菌體生長隨著酶活分泌同步增加。在111 h 之后菌體生長與酶活變化不大，最終誘導(dǎo)159 h 搖瓶上清液酶活為753 U/mL。 從圖6（b）的電泳圖也可以清晰看到，電泳條帶隨誘導(dǎo)時(shí)間逐漸變粗，在誘導(dǎo)87 h 后電泳條帶不變，目的蛋白質(zhì)表達(dá)提高不明顯。 因此該菌株最佳搖瓶誘導(dǎo)時(shí)間為111 h，可以避免發(fā)酵后期染菌的風(fēng)險(xiǎn)。

2.7 pH 值對(duì)TAT-SOD 基因的轉(zhuǎn)錄水平的影響分析

誘導(dǎo)培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)酵母，研究隨著不同初始pH 變化TAT-SOD 基因的表達(dá)規(guī)律。熒光定量PCR選擇內(nèi)參基因actin 對(duì)目的基因相對(duì)定量的分析結(jié)果， 并 3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到 2－△△CT值進(jìn)行單因素方差分析。 定量PCR 結(jié)果顯示，在不同 pH 值培養(yǎng)下菌株中TAT-SOD 基因的誘導(dǎo)表達(dá)情況不相同。從圖7可知，以菌株在pH 4.0 時(shí)的樣品作為對(duì)照組，pH 在5.0 時(shí)表達(dá)mRNA 與對(duì)照組的差別不顯著。 而pH為 6.0、7.0、8.0 時(shí)表達(dá) mRNA 分別是對(duì)照組的2.4 倍、3.5 倍和 3.1 倍， 各組跟對(duì)照組有顯著差異（P<0.05），經(jīng) SPSS 軟件分析得 F 值為 657.32，查表 F0.01（4，5）=11.39。 并認(rèn)為有顯著的組間差異，這說明不同pH 環(huán)境對(duì)菌株的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平有顯著影響。

圖7 菌株在不同 pH 值培養(yǎng)下TAT-SOD 基因的相對(duì)表達(dá)量Fig. 7 Relative expression levels of TAT-SOD in Pichia pastoris grown at different initial pH value

圖7 可以看出，X33 菌株在不同 pH 條件下，TAT-SOD 基因隨著pH 值的升高均有一定倍數(shù)的上調(diào)表達(dá)。 其中在pH 7 時(shí)上調(diào)表達(dá)的倍數(shù)最高，是對(duì)照組 pH 4.0 上調(diào)倍數(shù)的 3.5 倍。 在 pH 8 下，基因的表達(dá)量比pH 7 時(shí)略低。在對(duì)照組pH 4.0 中，TATSOD 基因的表達(dá)量要比其它組顯著變低。 而不同初始pH 條件下基因表達(dá)趨勢(shì)與最終得到的酶活趨勢(shì)基本相符合。 這表明除了菌體生長濃度影響目的蛋白質(zhì)在發(fā)酵液中的表達(dá)水平， 不同pH 下基因轉(zhuǎn)錄水平差異也較大地影響了菌株的TAT-SOD 的表達(dá)程度。

3 結(jié) 語

作者采用經(jīng)低溫長時(shí)間保存的畢赤酵母表達(dá)菌株， 使含有TAT-SOD 基因的菌株在優(yōu)化搖瓶發(fā)酵條件下成功地胞外分泌表達(dá)TAT-SOD。分泌出目的蛋白質(zhì)可以改善大分子蛋白質(zhì)SOD 細(xì)胞膜通透性[17]，實(shí)現(xiàn)將外源SOD 輸送進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部協(xié)助相應(yīng)的生命活動(dòng)，清除胞內(nèi)外自由基，增加超氧化物歧化酶SOD 在臨床上的使用范圍。 可能是誘導(dǎo)表達(dá)TAT-SOD 可提高畢赤酵母的抗衰老能力，長期低溫保存的畢赤酵母在保藏過程中沒有出現(xiàn)退化現(xiàn)象，仍可保持較強(qiáng)的目的蛋白質(zhì)表達(dá)能力。

畢赤酵母表達(dá)外源蛋白質(zhì)的主要發(fā)酵條件包括誘導(dǎo)時(shí)間、甲醇體積分?jǐn)?shù)、pH 值、培養(yǎng)溫度等因素。優(yōu)化搖瓶發(fā)酵條件，誘導(dǎo)劑體積分?jǐn)?shù)1.0%，誘導(dǎo)溫度 30 ℃，YPDM 培養(yǎng)基， 初始 pH 值為 7.0 條件下，發(fā)酵上清液酶活水平為753 U/mL，未優(yōu)化酶活水平為148 U/mL， 較未優(yōu)化初始酶活提高5.1 倍；初始pH 值為7.0 時(shí)表達(dá)水平提高3.4 倍；后期經(jīng)過5 L 發(fā)酵罐發(fā)酵， 最終得到TAT-SOD 酶活達(dá)到14 934 U/mL，是搖瓶水平的19.8 倍，說明長期保藏的重組菌株仍適合表達(dá)。 熒光定量PCR 試驗(yàn)表明，在轉(zhuǎn)錄水平差異上， 不同pH 條件下目的蛋白質(zhì)表達(dá)水平受到基因轉(zhuǎn)錄水平和菌體生長的雙重影響，而且前者的影響強(qiáng)于后者。

研究發(fā)酵條件是提高外源蛋白質(zhì)在畢赤酵母表達(dá)水平的重要手段。 從本研究數(shù)據(jù)來看，TATSOD 的畢赤酵母表達(dá)菌株，經(jīng)長時(shí)間保存后仍可保持較強(qiáng)的活力； 而且誘導(dǎo)初始pH 值對(duì)目的蛋白質(zhì)的影響顯著。 這些結(jié)果為該菌株的工業(yè)生產(chǎn)提供更多數(shù)據(jù)，有助于降低生產(chǎn)成本，更大程度上獲得目的蛋白質(zhì)。