基于宏基因組技術(shù)分析傳統(tǒng)酸筍中微生物多樣性

陳曉東 ， 朱志勇 ， 張 韞 ， 吳昌明 ， 郭起榮 *2，

（1. 國際竹藤中心 國家林業(yè)局竹藤科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)開放實驗室，北京100102；2. 南京林業(yè)大學(xué) 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京210037）

酸筍是以鮮筍為原料，經(jīng)過天然混合菌群發(fā)酵而成的一種傳統(tǒng)食材，因為其良好貯藏特性和獨(dú)特的風(fēng)味，受到廣大消費(fèi)者的喜愛。 早在《詩經(jīng)》中就有“加豆之實，筍菹魚醢”的記載。 筍菹即酸筍。 現(xiàn)今，如我國西南地區(qū)的螺螄粉、多民族酸食，酸筍皆為其常見配料。 閩、贛、黔、湘、鄂、川、渝等地的侗、苗、瑤和漢族人，四季皆喜食酸筍。 酸筍中的乳酸菌不僅具有益生功能[1-2]，而且還能產(chǎn)生豐富的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)、有機(jī)酸、細(xì)菌素等，食用品質(zhì)大為提高[3-4]。隨著人們生活水平的提高，諸如高血壓、高血脂、糖尿病、 心腦血管疾病等常見疾病愈發(fā)引起社會關(guān)注。 竹筍作為森林蔬菜之一，其肉質(zhì)鮮嫩，營養(yǎng)豐富，富含膳食纖維、多種氨基酸和維生素，同時含有鐵、磷、鎂、鈣等礦質(zhì)元素[5]，已然成為人們重要的副食品之一。 研究表明，竹筍采后易木質(zhì)化，食性銳減。 有些種類常溫下貯藏2~3 d 后便失去鮮嫩口感[6]，竹筍保鮮貯藏加工成為其大規(guī)模生產(chǎn)和流通的關(guān)鍵瓶頸。 而酸筍容易保存，且風(fēng)味更佳。 Bekele A Z等研究發(fā)現(xiàn)，酸筍的膳食纖維具有改善并調(diào)節(jié)小鼠胃腸道菌群、潤腸通便的保健功能[7]。 Singh 等研究發(fā)現(xiàn)，酸筍還具有抗氧化的功能[8]。 此外，微生物在酸筍發(fā)酵過程中發(fā)生一系列變化，因此分析微生物對酸筍質(zhì)量及風(fēng)味的形成有重要意義。 目前，W Romi 等利用16S rRNA 對印度傳統(tǒng)酸筍菌微生物動態(tài)進(jìn)行了檢測[9]，Buddhiman T 等發(fā)現(xiàn) L. brevis、L. plantarum、L. fallax 是酸筍美食 Soibum 的主要微生物[10]。 我國酸筍多集中于營養(yǎng)成分、口感、風(fēng)味等研究[11]，傳統(tǒng)培養(yǎng)法和16S rRNA 基因分析僅提供了關(guān)于微生物組成的有限信息[12]，大量的微生物種類、功能不明確，缺乏對酸筍微生物宏基因組系統(tǒng)深入的解析。 近年來，宏基因組測序技術(shù)的不斷進(jìn)步，為解析環(huán)境中復(fù)雜的微生物體系提供了一種便捷、有效的方法，在發(fā)酵食品如泡菜、黃酒、紅茶、酸粥等領(lǐng)域得以應(yīng)用[13-16]。 作者采集廣西6 個傳統(tǒng)產(chǎn)地的酸筍， 對其微生物進(jìn)行Illumina Hiseq 宏基因組測序和分析， 為更全面掌握酸筍微生物種類、特征及酸筍品質(zhì)創(chuàng)新、加工業(yè)發(fā)展提供重要的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品以及來源

2017 年8 月，取樣于廣西的桂林、柳州、來賓、百色、南寧、貴港6 個地區(qū)，見圖1。選擇當(dāng)?shù)厮峁S做得道地的農(nóng)戶， 泡制酸筍的材料為麻竹筍（Dendrocalamuslatiflorus Munro）。 在酸筍壇中用 5 mL 無菌移液器從筍壇的上、中、下部位各取10 mL發(fā)酵液， 總量30 mL 置于50 mL 無菌離心管中混合，重復(fù)3 次，樣品置于液氮條件下保存，運(yùn)回實驗室待測，采集地情況見表1。

天根植物基因組提取試劑盒、緩沖液GA：購自天根生化科技（北京）有限公司；PBS 緩沖液：購自江蘇綠葉生物科技有限公司。

高速低溫離心機(jī)ALLSHENG ICEN 24：購自杭州奧盛公司；Qubit 2.0 DNA 檢測試劑盒： 購自Life公司；DYY-11 電泳儀： 購自北京市六一儀器廠；Illumina Hiseq 測序儀：購自美國Illumina Hiseq 公司。

1.2 宏基因組DNA 提取

圖1 酸筍樣品采集地點(diǎn)Fig. 1 Collection sites of fermented bamboo shoots

表1 酸筍樣品采集信息Table 1 Information of fermented bamboo shoots samples

將30 mL 酸筍發(fā)酵液樣品從液氮中取出，融化后置于50 mL 大離心管中， 于4 ℃高速離心機(jī)12 000 r/min 離心 10 min，棄上清液，再用 PBS 洗滌大離心管中沉淀物，將菌體收集在1.5 mL 的EP 管中，用于總DNA 提取。 采用天根植物基因組提取試劑盒[17]提取樣品中所有微生物的總 DNA。 經(jīng)0.8 g/dL 瓊脂糖凝膠電泳（電壓100 V，時間40 min）檢測無明顯降解、 無雜質(zhì)， 質(zhì)量合格樣品， 利用Qubit 對總DNA 質(zhì)量濃度進(jìn)行精確定量（DNA 質(zhì)量濃度≥30 ng/μL，DNA 質(zhì)量≥3 μg），保證達(dá)到二代測序文庫構(gòu)建要求。

1.3 文庫構(gòu)建及Illumina HiSeq 高通量測序

檢測合格的DNA 樣品用超聲波破碎儀隨機(jī)打斷成300 bp 的片段，經(jīng)末端修復(fù)、加A 尾、加測序接頭、凝膠法純化、PCR 擴(kuò)增等過程完成文庫構(gòu)建，同時使用Qubit 2.0 進(jìn)行初步定量，稀釋文庫至2 ng/μL，采用實時熒光核酸擴(kuò)增檢測系統(tǒng)（Q-PCR）方法對文庫的有效濃度進(jìn)行精確定量（文庫有效濃度＞3 nmol/L），以保證文庫質(zhì)量。 宏基因測序在北京源宜基因科技股份有限公司進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

先將HiSeq 原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，得到高質(zhì)量的有效讀長（reads）。 使用 MetaPhlAn2[18]軟件進(jìn)行微生物種類注釋，高通量解析酸筍微生物組成與數(shù)量。 其中，α 多樣性是指生境內(nèi)物種多樣性程度、豐富度（包含物種的多寡）和均勻度（樣品中各個種類的相對密度）兩個指標(biāo)，使用mothur 軟件[19]進(jìn)行分析。β 多樣性能反映時空尺度上物種的組成變化，分析不同地區(qū)樣品間（組間）的微生物組成差異，使用Jaccard 軟件[20]進(jìn)行分析。不同組分共有種越少，則β多樣性越大。 將Unigene 與KEGG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對統(tǒng)計（http：www.genome.jp/kegg）。

2 結(jié)果與分析

2.1 HiSeq 測序結(jié)果統(tǒng)計分析

桂林、柳州、來賓、百色、南寧、貴港等6 地麻竹酸筍發(fā)酵液宏基因組測序獲得的宏基因組數(shù)據(jù)見表2。其中平均讀長141.2 bp，有效讀長68.75 M，占原始read 的91.5%；有效堿基數(shù)9.697 G，占原始堿基數(shù)的85.9%。 相較于 16S 測序的序列讀長約200 bp，有效數(shù)據(jù)量在10~70 M 之間[21]，本次宏基因組測序共產(chǎn)生有效數(shù)據(jù)58.18 G （每個樣本平均為9.69 G），有較高的文庫覆蓋度，捕獲了樣品中更多微生物。

將有效讀長通過SOAPdenovo2[22]進(jìn)行迭代拼接（overlap），得到 66 157 個更長的片段（scaffold），將獲得的scaffold 使用MetaGeneMark[23]進(jìn)行基因預(yù)測，共測得75 681 個基因。將預(yù)測出來的基因序列使用CD-HIT[24]軟件進(jìn)行聚類 （參數(shù)為：95%相似度、90%覆蓋度）， 得到 54 416 個非冗余基因集（unigene），用于生物信息學(xué)分析。

表2 不同地區(qū)酸筍微生物宏基因組測序結(jié)果Table 2 Microbialmetagenomic sequencing results of different regions fermentedbamboo shoots

2.2 酸筍微生物群落結(jié)構(gòu)分析

通過MetaPhlAn 2 軟件對有效讀長進(jìn)行物種分類，MetaPhlAn 2 基于 17 000 個已有的基因組（13 500 原核生物，3 500 病毒，110 真核生物） 得到約一百萬個特異性的標(biāo)記， 分類水平達(dá)到種水平。從所采集的6 個地區(qū)18 個酸筍樣品中， 鑒定出156 種微生物，隸屬于 9 門 16 綱 30 目 63 科 92 屬。酸筍基因集中有71.9%可以在總界水平上進(jìn)行分類，其中細(xì)菌（Bacteria）占已分類基因的98.89%，其余1%來自真菌（Eukaryota）、古菌（Archaea）和病毒（Viruses）。

在門水平上，18 個樣品中共檢測到8 個門，見表3。 超過98.86%的細(xì)菌基因來自4 個主要的門類，分別為厚壁菌門（Firmicute）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria），其中硬壁菌門的比例高達(dá)86.10%；真菌基因主要為子囊菌門 （Ascomycota）， 比例僅為0.001%。 與 Romi.W 等[9]以 PCR-DGGE 結(jié)合 16S 測序為手段分析印度酸筍菌群結(jié)構(gòu)僅發(fā)現(xiàn)硬壁菌門和子囊菌門兩個門的微生物相比， 本研究結(jié)果顯示，微生物宏基因組的技術(shù)先進(jìn)性。

18 個樣品中共檢測出92 個屬，見圖2。 桂林、柳州、來賓、百色、貴港5 個產(chǎn)地的主要菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus），豐度為 81.06%～99.17%；南寧產(chǎn)地的酸筍主要菌屬還包含假單胞菌屬（Pseudomonas），豐度為32.24%；此外還包括片球菌屬（Pediococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、魏斯氏菌屬（Weissella）、乳球菌屬（Lactococcus）等具有益生功能的微生物，與泡菜[25]、酸菜[21]、酸粥[16]等傳統(tǒng)發(fā)酵食品的主要微生物大體相同，見表4。乳球菌屬對發(fā)酵乳的酸化和風(fēng)味的形成貢獻(xiàn)較大[26]，其對酸筍風(fēng)味的形成亦有重要的作用。 從屬的分類級別來看，本次宏基因組測序與16S 測序的鑒定結(jié)果水平相當(dāng)[26]，但在種水平上，宏基因組測序檢測出的微生物種類則更豐富。 本研究中18 個樣品中鑒定到植物乳桿菌（L. plantarum）等 12 種乳桿菌，見表 5。 而Romi.W[9]等在印度酸筍中僅發(fā)現(xiàn) L. brevis、L. plantarum 和L. lactis 3 種乳桿菌，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于本研究結(jié)果。 可能的原因是16S 測序大多數(shù)只能注釋到屬水平， 而宏基因組測序可直接注釋到種水平，還可以從基因和功能層次進(jìn)行更深入分析。 同時，6個產(chǎn)地酸筍微生物的種類和數(shù)量也存在著一定的差異，可能由于采樣地區(qū)的地理位置、氣候、農(nóng)戶制作酸筍工藝（發(fā)酵時長、發(fā)酵溫度、容器）等客觀因素引起。

表3 門水平上樣品中微生物的相對豐度Table 3 Relative abundance of microbial at phylum levels in each sample

圖2 屬水平上酸筍微生物菌群相對豐度Fig. 2 Microbial relative abundance on the genus level in thefermented bamboo shoot

表4 4 種傳統(tǒng)發(fā)酵食品的主要微生物Table 4 The main microbials of 4 traditional fermented foods

表5 不同地區(qū)酸筍乳酸桿菌的相對豐度Table 5 Relative abundance of Lactobacillus in different areas

2.3 酸筍微生物α 多樣性分析

α 多樣性是生境中微生物豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)[27]，本研究所得到微生物物種數(shù)、均勻度指數(shù)、shannon 指數(shù)等信息參見表 6。 Shannon 指數(shù)反映樣品微生物的豐富程度[28]。結(jié)果表明，貴港樣品中觀察到的微生物物種數(shù)多達(dá)77 種， 與其他地區(qū)具有顯著差異。 南寧地區(qū)樣品均勻度指數(shù)最高為0.69，表明該地區(qū)物種分布更均勻。

表6 不同樣品細(xì)菌的多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)及豐度Table 6 Bacterial diversity index，evenness index and abundance of different samples

2.4 酸筍微生物β 多樣性分析

2.4.1 群落距離分析 以檢測到微生物屬水平數(shù)量為指標(biāo)，采用Jaccard 方法，考慮物種組成、不考慮其豐度，計算樣品間的群落距離、生成距離矩陣，進(jìn)行距離熱圖分析，結(jié)果見圖3。 可以聚為3 類：桂林、 柳州、 來賓3 個產(chǎn)地酸筍微生物群落距離在0.44～0.57 之間，根據(jù)微生物相對豐度的分布的分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳桿菌含量均最多，說明這3 個產(chǎn)地細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更相似；百色、南寧2 個產(chǎn)地酸筍微生物群落距離為0.7，植物乳桿菌為豐度最高；而貴港產(chǎn)地酸筍與其他5 個產(chǎn)地群落距離大，布氏乳桿菌為主要菌種，說明貴港與其他5 個產(chǎn)地酸筍的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異更大。

2.4.2 酸筍微生物主成分分析 PCA 是一種非限制性排序的組間差異分析方法 （即只考慮物種組成）， 基于Jaccard 算法計算樣本中的物種距離，將原始復(fù)雜信息進(jìn)行降維排序，找出數(shù)據(jù)中最主要的元素或結(jié)構(gòu)，樣品組成越相近，反映在PCA 圖中的距離越近。結(jié)果見圖4。前三個主成分貢獻(xiàn)率分別是38.2%、29.3%、18.9%，累計貢獻(xiàn)率達(dá)86.4%，符合主成分分析要求。

圖3 不同產(chǎn)地酸筍微生物群落的距離熱圖Fig. 3 Heatmap of microbialcommunities distance of fermented bamboo shoot from different regions

PCA 結(jié)果表明，桂林、柳州、來賓3 個產(chǎn)地酸筍微生物群落結(jié)構(gòu)相似，可以聚為一類；百色、南寧2個產(chǎn)地酸筍微生物群落結(jié)構(gòu)相似，聚為一類；貴港與其他5 個產(chǎn)地酸筍的微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大，單獨(dú)聚為一類。 主成分分析結(jié)果與群落距離熱圖分析結(jié)果相一致，地理距離的差異可能是造成酸筍微生物群落結(jié)構(gòu)不同的主要因素，產(chǎn)地越近，群落結(jié)構(gòu)越相似。

2.5 功能基因KEGG 統(tǒng)計

將非冗余基因集與KEGG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比，共有 19 743 個 unigene 得到注釋。 其中 12 751 個unigene 參與微生物新陳代謝， 分屬385 類代謝通路。 其中發(fā)現(xiàn)了49 條碳水化合物代謝通路，主要包括糖酵解、磷酸戊糖代謝、三羧酸循環(huán)等代謝途徑，這些代謝途徑產(chǎn)生了大量的乙酸、蘋果酸、丁酸等有機(jī)酸豐富了酸筍的風(fēng)味；30 條代謝氨基酸代謝通路，其中包括蘇氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸3 種必需氨基酸的代謝途徑， 同時部分unigene 參與基因維生素及其他輔助因子的代謝，結(jié)果見圖5。有關(guān)生物系統(tǒng)，人類疾病，細(xì)胞移動，細(xì)胞對環(huán)境信息處理，遺傳信息的傳遞注釋基因數(shù)量相對較少。

圖4 酸筍微生物在屬水平的PCA 分析Fig. 4 PCA analysis of the bacteria of fermented bamboo shoot

3 討 論

酸筍與云南豆豉、四川泡菜、東北酸菜等傳統(tǒng)發(fā)酵食品相比，以其獨(dú)特的風(fēng)味、豐富的營養(yǎng)及益生功能受到人們的歡迎[29-30]。 目前，國內(nèi)外學(xué)者利用傳統(tǒng)培養(yǎng)法和16S 測序?qū)χ袊_灣、泰國、印度、印度尼西亞等地酸筍[31-34]研究表明，L.plantarum、L.buchneri、 L.brevis、 L.fermentum、 Enterococcus faecium 是這些酸筍中的主要微生物，這與本實驗結(jié)果具有共同性的同時也存在一定的差異。 除上述菌種以外，我國酸筍中還發(fā)現(xiàn)了L.rossiae、 L.pentosu、L. amylolyticus 等乳酸桿菌， 菌群種類更加豐富，是宏基因組技術(shù)發(fā)現(xiàn)更多還是其特有，還有待進(jìn)一步研究。 同時6 個產(chǎn)地酸筍微生物的種類和數(shù)量也存在一些差異， 可能是由于采樣地區(qū)的地理位置、環(huán)境氣候、制作方法等因素造成的。

圖5 功能基因KEGG 統(tǒng)計Fig. 5 KEGG analysis of functional genes

本研究結(jié)果表明， 酸筍中存在多種有益微生物， 如 L. plantarum 具有高產(chǎn)葉酸的功能[35]，Pediococcus pentosaceus 等具有提高免疫功能、Leuconos toccitreum 產(chǎn)生具有廣譜抑菌作用的細(xì)菌素[36]，Alistipes putredinis 可調(diào)節(jié)人體腸道菌群[37]、Prevotella 可降解淀粉、蛋白質(zhì)[38]。 同時，酸筍富含的膳食纖維是腸道菌群最好的養(yǎng)料，細(xì)菌消化纖維生成的短鏈脂肪酸能滋養(yǎng)腸屏障， 提高免疫機(jī)能，幫助預(yù)防炎癥，抵抗腫瘤發(fā)病風(fēng)險[7]。 酸筍的益生性表現(xiàn)在其中的乳酸桿菌代謝產(chǎn)生的諸如有機(jī)酸、過氧化氫、細(xì)菌素等物質(zhì)，具有促進(jìn)營養(yǎng)吸收、較強(qiáng)的抗氧化、抑制病菌等能力。

酸筍中少量的真菌、古菌、噬菌體病毒均為發(fā)酵食品中常見的微生物。 德巴利酵母科（Debaryomycetaceae）在冰葡萄酒釀造過程中，提高冰葡萄酒風(fēng)味和口感[39]；Halococcus 可產(chǎn)生多種胞內(nèi)、胞外多糖酶，如淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶[40]，這些酶在高鹽度的環(huán)境中顯示良好的活性；Siphoviridae、Myoviridae 噬菌體病毒與Lu Z[41]等在泡菜中分離出26 種不同的噬菌體研究結(jié)果一致。雖然這些微生物在提高風(fēng)味等方面具有一定的作用，但是在食用酸筍之前提倡加熱烹飪，利用高溫殺死酸筍中一些有害的細(xì)菌及病毒，保證食用安全。 發(fā)現(xiàn)酸筍發(fā)酵液中微生物存在多樣性，各菌群的功能尚有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 語

廣西傳統(tǒng)麻竹酸筍樣本中含有8 門16 綱30目63 科92 屬156 種的微生物，不同地區(qū)微生物群落組成略有不同，同時均伴生有其他種類的細(xì)菌或真菌，在屬水平上，乳桿菌屬豐度高達(dá)81%，片球菌屬、明串珠菌屬、魏斯氏菌屬、乳球菌屬豐度均不足1%，這些都是發(fā)酵體系中廣泛存在的乳酸菌。 植物乳桿菌等12 種乳酸桿菌是我國廣西產(chǎn)地酸筍微生物的主要菌種。 產(chǎn)地間微生物有地區(qū)差異，產(chǎn)地越近，微生物的群落結(jié)構(gòu)越相似。