一種中性普魯蘭酶及其在紅薯粉絲制作中的應(yīng)用

朱新文 ， 德青美朵 ， 王 婕 ， 邵羅楠 ， 姚 雁 ，沈 微 *，， 楊海泉 ， 陳獻(xiàn)忠 ， 樊 游

（1． 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 無錫 214122；2． 無錫先秦生物科技有限公司， 江蘇 無錫214073；3． 江南大學(xué) 中國(guó)高校工業(yè)微生物資源數(shù)據(jù)平臺(tái)，江蘇 無錫 214122）

粉絲是我國(guó)特有的傳統(tǒng)美食，已有上千年的歷史[1-2]。 根據(jù)原料的不同，粉絲可以分為不同的種類，其中市場(chǎng)上最常見的是綠豆粉絲和薯類粉絲。 不同種類的淀粉對(duì)粉絲品質(zhì)的影響很大[3]，以綠豆淀粉為原料制作的粉絲質(zhì)量普遍優(yōu)于薯類淀粉粉絲。 金茂國(guó)等研究發(fā)現(xiàn)，綠豆淀粉含有較高比例的直鏈淀粉，尤其是其中較多的不溶性直鏈淀粉是綠豆粉絲質(zhì)量高的關(guān)鍵原因[3]。 薯類淀粉的原料來源豐富，價(jià)格低廉， 但薯類淀粉粉絲質(zhì)量明顯不如綠豆淀粉。按傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)薯類粉絲時(shí)一般需要添加明礬以防止粉絲間互相粘連、提高產(chǎn)品的耐煮性并降低斷條率。 由于長(zhǎng)期攝入明礬可能對(duì)人體健康帶來危害， 為此科研工作者研究了黃原膠、 復(fù)合磷酸鹽、CMC 纖維素、海藻酸鈉等多種明礬替代物[4-8]，這些明礬替代物在一定程度上解決了由明礬帶來的食品安全問題，但其用量較大，一般要達(dá)到粉絲淀粉總量的0.3%以上，這增加了粉絲的生產(chǎn)成本也可能帶來新的食品安全隱患。 普魯蘭酶專一性水解淀粉中的α-1，6-糖苷鍵， 可以將支鏈淀粉水解為直鏈淀粉。 理論上講，用普魯蘭酶處理淀粉可以提高其直鏈淀粉的含量，但這種方法在實(shí)際應(yīng)用時(shí)存在兩方面的困難。 一是淀粉分子在低溫下一般以結(jié)晶的顆粒狀存在，在淀粉的水懸液中大部分分子接觸不到酶，淀粉的酶解難以實(shí)現(xiàn)。 二是淀粉水懸液在高溫糊化時(shí)形成很高的粘度，而高濃度的水懸液幾乎可以變成固體狀，酶解同樣無法實(shí)現(xiàn)。 劉程玲等[9]用普魯蘭酶直接水解淀粉水懸液，使紅薯淀粉中直鏈淀粉的含量提高了8.57%。 這種方法的缺點(diǎn)是普魯蘭酶與淀粉水懸液需要在55 ℃下?lián)u瓶反應(yīng)15 h，生產(chǎn)時(shí)需要專門的設(shè)備并且動(dòng)力消耗較大。 本課題組在前期研究中建立了一種以普魯蘭酶水解芡糊的酶法粉絲制作方法[10]，反應(yīng)時(shí)間只有30 min，在完全不添加明礬及其它添加劑的情況下，制作出的成品粉絲在斷條率等質(zhì)量指標(biāo)上與添加明礬制得的粉絲基本一致。 針對(duì)這一工藝，本課題組還開發(fā)了一種來源于嗜熱脂肪地芽孢桿菌的普魯蘭酶GsP[11]，研究表明，這種中性耐熱型普魯蘭酶在粉絲制作中的使用量明顯小于目前商品化的耐酸性普魯蘭酶[12]。酶本身是一種蛋白質(zhì)，加熱變性后與其他蛋白質(zhì)并沒有本質(zhì)的差異，其水解產(chǎn)生的直鏈淀粉也是淀粉的正常成分，因此從食品安全考慮，用普魯蘭酶水解芡糊是一種比較理想的無明礬粉絲制作方法。 本課題組在江蘇省東海農(nóng)村進(jìn)行酶法粉絲技術(shù)應(yīng)用試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，以GsP 或商品化普魯蘭酶水解芡糊制作粉絲的方法在應(yīng)用于純淀粉為原料的工藝中時(shí)均能獲得穩(wěn)定的結(jié)果，但以未經(jīng)提純的淀粉質(zhì)原料制作粉絲時(shí)則結(jié)果很不穩(wěn)定，重要原因之一是以這些材料制作的芡糊的pH 有比較大的波動(dòng)，導(dǎo)致普魯蘭酶的作用效果不穩(wěn)定。 對(duì)此，本課題組對(duì)前期收藏的地芽孢桿菌屬的菌株進(jìn)行篩選，獲得了一株編號(hào)為 XQ3665 的地表地芽孢桿菌（Geobacillussubterraneus）， 這株菌所產(chǎn)普魯蘭酶具有較為寬泛的pH 適應(yīng)范圍， 有可能在一定程度上解決以非純淀粉原料制作粉絲時(shí)遇到的問題。 作者研究了這種普魯蘭酶在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中的表達(dá)以及重組酶在以紅薯面為原料的粉絲制作中的應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 地表地芽孢桿菌XQ3665 菌株：從無錫先秦生物科技有限公司菌種庫(kù)中篩選得到，已進(jìn)一步在江南大學(xué)中國(guó)高校工業(yè)微生物資源數(shù)據(jù)平臺(tái)進(jìn)行正式保藏，保藏編號(hào)為CICIM B6904；大腸桿菌表達(dá)載體pLac03： 由作者所在課題組保藏[11]；枯草芽孢桿菌表達(dá)載體pUP43：由無錫先秦生物科技有限公司提供，是一種以P43 啟動(dòng)子控制外源基因表達(dá)的大腸桿菌-芽孢桿菌穿梭型表達(dá)載體，其在芽孢桿菌中的復(fù)制原點(diǎn)和卡那霉素抗性基因均來源于質(zhì)粒pUB110， 該質(zhì)粒已保藏在江南大學(xué)中國(guó)高校工業(yè)微生物資源數(shù)據(jù)平臺(tái)，保藏編號(hào)為CICIMB6941。

1.1.2 工具酶及主要試劑 聚合酶ExTaq 以及限制性內(nèi)切酶EcoRI、XbaI 等： 大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒：北京博大泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒及DNA 片段膠回收試劑盒：康寧生命科學(xué)（ 吳江） 有限公司產(chǎn)品；普魯蘭糖：Sigma 公司產(chǎn)品；蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量：賽默飛世爾（中國(guó)）有限公司產(chǎn)品；預(yù)染蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)PageRulerTM 26616、氨芐青霉素鈉、卡那霉素、IPTG、SDS-PAGE 電泳預(yù)制膠： 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；其它試劑： 國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；紅薯粉（紅薯面）：本課題組在江蘇省東?？h農(nóng)村收購(gòu)。

1.1.3 引物合成及測(cè)序 根據(jù)地表地芽孢桿菌KCTC3922 的 基 因 組 序 列 （NCBI 登 錄 號(hào) ：CP014342.1）設(shè)計(jì)擴(kuò)增普魯蘭酶基因的引物：

Pxw01：5′-AATTACCGGAATTCTTATGCTTCAC ATTCACCGAAC-3′

Pxw02：5′ -AATTACCGTCTAGATTAGCGGGCA TTGATCGCTT C-3′

Pxw03：5′ -AATTACCGACTAGTAGGAGGAAT CTTATGCTTCACATTCACCGAAC-3′

Pxw04：5′ -AATTACCGGGATCCTTAGCGGGCA TTGATCGCTT C-3′

引物中帶下劃線部分為內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，帶方框部分為引物自帶的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列。

引物由上海賽百盛基因技術(shù)服務(wù)有限公司合成，測(cè)序由蘇州泓迅生物科技有限公司完成。

1.1.4 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基：10 g/L 蛋白胨，10 g/L NaCl，5 g/L 酵母粉，加入1.5%的瓊脂粉為固體培養(yǎng)基， 使用時(shí)均補(bǔ)加氨芐青霉素至終質(zhì)量濃度為100 μg/mL。 發(fā)酵培養(yǎng)基為TB 培養(yǎng)基，北京吉美生物科技有限公司產(chǎn)品，用于大腸桿菌發(fā)酵時(shí)補(bǔ)加終質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的氨芐青霉素和終質(zhì)量濃度為0.5 mmol/L 的IPTG，用于枯草芽孢桿菌發(fā)酵時(shí)添加 15 μg/mL 卡那霉素。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pLac03-pul3665 的構(gòu)建 提取地表地芽孢桿菌XQ3665 的基因組DNA， 以Pxw01、Pxw02 為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分離后回收，與pMD-18TSimple 連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 感受態(tài)細(xì)胞， 在含有氨芐青霉素的LB 平板上挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證后測(cè)序。 選取重組質(zhì)粒用EcoRI、XbaI 酶切， 分離其中的插入片段與經(jīng)同樣酶切的表達(dá)載體pLac03 連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞， 挑取轉(zhuǎn)化子并提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為pLac03-pul3665。

1.2.2 重組質(zhì)粒pUP43-pul3665 與重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建 以重組質(zhì)粒pLac03-pul3665 為模板，以 Pxw03、Pxw04 為引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增， 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離并回收后用SpeI 和BamHI 酶切， 并與經(jīng)同樣酶切的載體pUP43 連接，連接物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞， 在含氨芐青霉素的平板上挑選轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒后酶切鑒定，驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為pUP43-pul3665。

采用 Spizizen 法[13]將質(zhì)粒 pUP43-pul3665 和空質(zhì)粒pUP43 分別轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌1A717。 在含有15 μg/mL 卡那霉素的LB 平板上檢出轉(zhuǎn)化子。 挑取轉(zhuǎn)化子劃線分離后提取質(zhì)粒。 由于芽孢桿菌中提取的質(zhì)粒電泳條帶模糊，所以將從重組芽孢桿菌中提取的質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109， 在含氨芐青霉素的LB 平板上檢出轉(zhuǎn)化子， 挑取轉(zhuǎn)化子后再?gòu)拇竽c桿菌中提取質(zhì)粒酶切鑒定。 從芽孢桿菌中提取質(zhì)粒的方法同文獻(xiàn)[14]。

1.2.3 重組普魯蘭酶的誘導(dǎo)表達(dá) 重組大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)方法如下：取重組菌株于LB 平板劃線，取單菌落于 20 mL LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)10 h。按照1%的接種體積分?jǐn)?shù)接種50 mL TB 培養(yǎng)基， 搖瓶培養(yǎng)至 OD600為 0.6~0.8 時(shí)加入IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，在 37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng) 48 h。取培養(yǎng)液于 8 000 r/min 離心 10 min，按文獻(xiàn)[9]方法，收集細(xì)胞內(nèi)、周質(zhì)空間和胞外成分檢測(cè)酶活。

重組枯草芽孢桿菌誘導(dǎo)方法如下：接種重組菌單菌落于 20 mL LB 液體培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)12 h。按2%接種體積分?jǐn)?shù)接種TB 液體培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min 搖瓶培養(yǎng)， 每隔 8 小時(shí)取樣，取部分樣品檢測(cè)OD600。 其余樣品8 000 r/min 離心10 min，取上清液直接檢測(cè)酶活。沉淀細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液懸浮后超聲波破細(xì)胞檢測(cè)胞內(nèi)酶活，芽孢桿菌發(fā)酵試驗(yàn)均做3 個(gè)平行樣。

1.2.4 重組普魯蘭酶的純化及酶活測(cè)定 取胞外粗酶液 5 mL， 經(jīng) 0.22 μm 濾膜過濾后用 Hitrap Desalting 柱脫鹽，緩沖液為 pH 7.0、0.02 mol/L 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，收集脫鹽后的酶液。

用HiTrap QFF 陰離子交換柱進(jìn)行第一次純化，平衡及上樣緩沖液為pH 7.0、0.02 mol/L 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，用含1 mol/L NaCl 的pH 7.0、0.02 mol/L 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，收集酶液檢測(cè)酶活力。

用HiTrap Butyl HP 疏水柱對(duì)上一步純化得到的酶液進(jìn)行疏水柱層析。 用pH 7.0、0.02 mol/L 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫， 收集酶液檢測(cè)酶活并用SDS-PAGE 電泳檢測(cè)蛋白質(zhì)純度。

考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定純酶的蛋白質(zhì)含量，用于計(jì)算酶的比活力。 普魯蘭酶酶活測(cè)定方法同文獻(xiàn)[15]。

1.2.5 重組普魯蘭酶酶學(xué)性質(zhì)的研究 最適溫度的測(cè)定：將酶液置于40~70 ℃反應(yīng)，測(cè)定不同溫度對(duì)酶活性的影響。 以最高酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活性。

最適pH 的測(cè)定： 配制 pH 為5~8 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液， 測(cè)定不同pH 對(duì)酶活性的影響。以最高酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活性。

重組酶溫度耐受性的測(cè)定：將純酶分別放置于50、55、60 ℃金屬浴，間隔 1 h 取樣。 以未進(jìn)行熱處理酶液的酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活性。

酶學(xué)性質(zhì)分析均做3 個(gè)平行樣。

1.2.6 重組普魯蘭酶對(duì)普魯蘭糖的降解 配制10 g/L的葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖標(biāo)準(zhǔn)樣及普魯蘭糖，取10 g/L 的普魯蘭多糖溶液與過量普魯蘭酶反應(yīng)，將完全降解產(chǎn)物及標(biāo)準(zhǔn)樣品用0.22 μm 的濾膜過濾處理，進(jìn)行 HPLC 檢測(cè)。 色譜條件：Bio-Rad Aminex HPX-87H column（300 mm×7.8 mm），流動(dòng)相為5 mmol/L 的 H2SO4，超聲波脫氣，流量為 0.5 mL/min，柱溫65 ℃。檢測(cè)器為HITA-CHI 高效液相色譜儀示差折光檢測(cè)器。

1.2.7 紅薯粉絲傳統(tǒng)制作方法

1）制芡糊 取紅薯粉100 g，用100 mL 溫水懸浮，在55 ℃水浴鍋中保溫5 min，一次性沖入700 mL沸水，并劇烈攪拌制成芡糊。

2）和面 芡糊中加入4 g 食鹽及900 g 紅薯粉手工和面，揉成面團(tuán)后用保鮮膜覆蓋，在20 ℃恒溫箱中放置30 min。

3）制絲、煮絲 取一普通水鍋加入約5 L 以上的自來水，將水煮沸。 將面團(tuán)放入粉絲機(jī)中壓制成絲，壓出的絲直接進(jìn)入沸水中，一般煮制1~2 min 后撈出，轉(zhuǎn)移到一盛有涼水的鍋中冷卻。

4）理絲、晾干：將冷卻的粉絲撈出后掛在竹竿上，手工將并條的粉絲分開，在陰涼通風(fēng)處晾干即為成品粉絲。

明礬粉絲制作時(shí)是在制芡糊階段在紅薯粉懸液制成后加入相當(dāng)于粉絲中淀粉總質(zhì)量0.1%的明礬，待明礬充分溶解后進(jìn)入后續(xù)階段。 酶法粉絲制作是在芡糊制成后加入一定量的酶液，混合后在55℃保溫30 min。 粉絲制作時(shí)所述普魯蘭酶酶活均為55 ℃、pH 6.5 條件下檢測(cè)的酶活。 粉絲機(jī)為永康市博寧工貿(mào)有限公司產(chǎn)品，型號(hào)為HN-2006。

1.2.8 粉絲斷條率計(jì)算 準(zhǔn)確截取10 cm 長(zhǎng)，無損傷的成品粉絲100 根， 平均放在5 個(gè)盛有500 mL去離子水的沸水杯中，微沸騰煮沸20 min。

1.2.9 膨潤(rùn)度和煮沸損失率計(jì)算 取無損傷的粉絲若干，截成5 cm 長(zhǎng)，在65 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，稱取 5~6 g （m1），投入一裝有 300 mL 已煮沸的去離子的水燒杯中，持續(xù)微沸騰煮沸20 min，過程中不斷加水以保持水量基本恒定。 完成后將燒杯放入冰水混合物中迅速冷卻， 冷卻至約30 ℃時(shí)取出粉絲，用新華濾紙吸干表面水分，稱濕質(zhì)量（m2）。 將上述粉絲放入65 ℃烘箱中烘至恒質(zhì)量（m3）。

膨潤(rùn)度（%）=m2/m3×100%

煮沸損失率（%）=（m1-m3）/m1×100%

膨潤(rùn)度、煮沸損失率和斷條率試驗(yàn)均做兩個(gè)平行樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 普魯蘭酶基因pul3665 在大腸桿菌中的表達(dá)

提取地表地芽孢桿菌XQ3665 的基因組DNA作為模板，用引物 Pxw01、Pxw02 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示目的條帶大小約為2.2 kb， 與基因組序列（NCBI 登錄號(hào)：CP014342.1）中預(yù)測(cè)的普魯蘭酶基因大小一致。PCR 產(chǎn)物純化后與pMD-18TSimple 連接，連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，任選4 個(gè)轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒后測(cè)序，結(jié)果顯示，4 個(gè)轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒中插入片段的序列完全一致。 將上述測(cè)序結(jié)果提交NCBI 用Blast 軟件進(jìn)行序列搜索比對(duì)，結(jié)果顯示，該插入片段的序列與地表地芽胞桿菌KCTC3922 基因組序列（NCBI 登錄號(hào)：CP014342.1）中一段推測(cè)為普魯蘭酶的基因的同源性最高為99%，所克隆基因命名為pul3665 用于進(jìn)一步研究。

上述載體分別用EcoRI 和XbaI 酶切后分離其中2.2 kb 的插入片段， 與經(jīng)同樣酶切的表達(dá)載體pLac03 連接， 連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109， 任取4個(gè)轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒后用EcoRI 和XbaI 酶切電泳，結(jié)果顯示4 個(gè)轉(zhuǎn)化子所含質(zhì)粒雙酶切后均獲得2.6 kb 和2.2 kb 的兩個(gè)片段， 符合重組質(zhì)粒pLac03-pul3665 應(yīng)有特征（圖 1（a））。 圖 1（b）是其中一個(gè)轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒的酶切電泳圖，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子命名為大腸 桿 菌 JM109/pLac03 -pul3665， 簡(jiǎn) 稱 JM109/pLac03-pul3665，用于重組酶的表達(dá)。

圖1 重組質(zhì)粒pLac03-pul3665 結(jié)構(gòu)與酶切圖譜Fig. 1 Map and restriction analysis of pLac03-pul3665

將重組菌JM109/pLac03-pul3665 和含空質(zhì)粒的重組菌JM109/pLac03 分別接種TB 培養(yǎng)基培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá)， 取不同的細(xì)胞成分檢測(cè)普魯蘭酶酶活。 結(jié)果顯示，含空質(zhì)粒的對(duì)照菌JM109/pLac03 細(xì)胞各組分中均未檢測(cè)到普魯蘭酶酶活。 重組菌JM109/pLac03-pul3665 的各組分中均有明顯的普魯蘭酶酶活，其中發(fā)酵液中的酶活大約為6.8 U/mL，周質(zhì)和胞質(zhì)酶活分別為8.5 U/mL 和33.6 U/mL。 可見，基因pul3665 編碼的蛋白質(zhì)確實(shí)為普魯蘭酶，為便于敘述該蛋白質(zhì)命名PUL3665。表達(dá)載體pLac03本身并沒有信號(hào)肽編碼區(qū)， 而pul3665 表達(dá)產(chǎn)物大量分泌到周質(zhì)和發(fā)酵液中，顯然是在PUL3665 自身信號(hào)肽控制下完成的。普魯蘭酶PUL3665 的蛋白質(zhì)序列與來源于嗜熱脂肪地芽孢桿菌的普魯蘭酶GsP的同源性高達(dá)83%，顯然是同一類型的分子。 用信號(hào)肽分析軟件SignalP 對(duì)兩者進(jìn)行分析， 均未發(fā)現(xiàn)明顯的信號(hào)肽，這兩種分子很可能都是通過雙精氨酸途徑向細(xì)胞外分泌，對(duì)此我們?cè)谟嘘P(guān)GsP 蛋白的研究中進(jìn)行了比較詳細(xì)的論述[11]， 作者主要研究PUL3665 的應(yīng)用性能，對(duì)此不再贅述。

2.2 重組酶PUL3665 的純化

由于發(fā)酵液中雜蛋白質(zhì)相對(duì)較少，因此取發(fā)酵液濃縮后進(jìn)行蛋白質(zhì)純化。 重組菌的表達(dá)情況及純化結(jié)果見圖2。由圖2 的1、2 泳道比較可見，JM109/pLac03-pul3665 發(fā)酵液相比對(duì)照菌有一條明顯的差異表達(dá)條帶，用軟件Image Lab4.0 分析，這一差異條帶代表的相對(duì)分子質(zhì)量約81 000， 與根據(jù)pul3665 基因序列推測(cè)的蛋白質(zhì)的理論相對(duì)分子質(zhì)量81 100 一致，結(jié)合酶活分析可以進(jìn)一步確認(rèn)重組菌JM109/pLac03-pul3665 表達(dá)產(chǎn)物為普魯蘭酶PUL3665。 進(jìn)一步用離子交換層析及疏水柱層析純化酶液，結(jié)果見圖 2 中 3、4、5 泳道。 泳道 3 是經(jīng)過離子交換層析的結(jié)果，可見雖然蛋白質(zhì)得到了一定的純化但仍有雜帶，4、5 泳道對(duì)應(yīng)的是疏水柱純化后兩個(gè)收集管中的蛋白質(zhì)的條帶， 均為單一條帶，可見經(jīng)過兩次純化后獲得了電泳純的重組酶PUL3665。 國(guó)內(nèi)外對(duì)地芽孢桿菌屬部分菌株來源的普魯蘭酶已有一定的報(bào)道[11，16-17]，但目前尚未見有關(guān)地表地芽孢桿菌普魯蘭酶重組表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)的研究報(bào)道，因此取泳道4 對(duì)應(yīng)的收集管中的蛋白質(zhì)進(jìn)行純酶酶學(xué)性質(zhì)研究。

2.3 重組酶PUL3665 酶學(xué)性質(zhì)分析

在緩沖液pH 6.5 的條件下測(cè)定溫度對(duì)重組酶PUL3665 酶活力的影響，結(jié)果見圖3。當(dāng)反應(yīng)溫度由40 ℃升至55 ℃，重組酶的相對(duì)酶活逐漸升高。60 ℃時(shí)，PUL3665 酶活明顯低于55 ℃時(shí)的酶活。 當(dāng)溫度高于60 ℃后，相對(duì)酶活迅速下降。

圖2 重組酶PUL3665 表達(dá)及純化結(jié)果Fig. 2 SDS-PAGE analysis of expression and purification of the PUL3665

圖3 溫度對(duì)PUL3665 酶活的影響Fig. 3 Effects of temperature on the activity of PUL3665

在反應(yīng)溫度為55 ℃時(shí)測(cè)定pH 對(duì)酶活的影響，結(jié)果見圖 4。PUL3665 的最適 pH 為 6.5，但在 pH 為5.5~7.5 范圍內(nèi)時(shí)，重組酶的相對(duì)酶活均在最高酶活的80%以上。 結(jié)合最適溫度檢測(cè)結(jié)果，PUL3665 的最適反應(yīng)條件為55 ℃、pH 6.5， 進(jìn)一步結(jié)合所用樣品純酶蛋白質(zhì)質(zhì)量的測(cè)定結(jié)果可計(jì)算得到PUL3665 純酶在最適條件下的比酶活為32 U/mg。對(duì)比文獻(xiàn)對(duì) GsP 的研究[11]，GsP 和 PUL3665 的最適pH 均為 6.5， 但 GsP 對(duì) pH 變化很敏感， 在 pH 5.5和pH 7.5 條件下其酶活只有最高酶活的60%左右。GsP 的最適溫度為65 ℃， 純酶比酶活為38 U/mg?？梢奊sP 的熱穩(wěn)定性和比酶活優(yōu)于PUL3665，而PUL3665 的pH 適應(yīng)性優(yōu)于前者。

圖4 pH 對(duì)PUL3665 酶活的影響Fig. 4 Effects of pH on the activity of PUL3665

在最適pH 條件下， 測(cè)定PUL3665 的熱穩(wěn)定性，結(jié)果見圖5。 50 ℃保溫5 h，相對(duì)酶活力可保持80%。 55 ℃保溫1 h， 相對(duì)酶活力可保持約80%以上，保溫2 h，相對(duì)酶活力可保持60%。 重組酶在60 ℃失活較快， 但保溫1 h 仍可保持50%以上的酶活。

圖5 PUL3665 的熱穩(wěn)定性Fig. 5 Thermal stability of PUL3665

2.4 重組酶PUL3665 對(duì)普魯蘭糖的降解

取過量普魯蘭酶作用于1%的普魯蘭多糖，其降解產(chǎn)物經(jīng)HPLC 分析結(jié)果見圖6。對(duì)照1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖、麥芽二糖及麥芽三糖的響應(yīng)值，只有在麥芽三糖處與標(biāo)準(zhǔn)的響應(yīng)值相當(dāng)。 普魯蘭酶的降解產(chǎn)物中只有麥芽三糖。 普魯蘭糖是一種多個(gè)麥芽三糖通過α-1，6-糖苷鍵連接而成的多糖， 對(duì)圖6 分析可知，PUL3665 不水解普魯蘭糖中麥芽三糖內(nèi)部的α-1，4-糖苷鍵。 可溶性淀粉是一種葡萄糖，主要通過α-1，4-糖苷鍵連接而成的多糖， 與碘反應(yīng)呈藍(lán)色。 進(jìn)一步將PUL3665 與1%的可溶性淀粉混合后長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)，結(jié)果顯示反應(yīng)液的藍(lán)值沒有明顯的變化，可見PUL3665 不降解α-1，4-糖苷鍵。上述實(shí)驗(yàn)可見， 普魯蘭酶PUL3665 只特異性水解α-1，6-糖苷鍵，為Ⅰ型普魯蘭酶。

圖6 PUL3665 降解普魯蘭多糖的產(chǎn)物分析Fig. 6 Products of PUL3665 decomposition of pullulan

2.5 普魯蘭酶基因pul3665 在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)

從PUL3665 酶學(xué)性質(zhì)的分析可見，PUL3665 是一種具有比較寬泛pH 適應(yīng)性的I 型普魯蘭酶，比較適合于粉絲制作工藝。 枯草芽孢桿菌是一種公認(rèn)為食品安全的微生物，相對(duì)于大腸桿菌具有更強(qiáng)的向細(xì)胞外分泌外源蛋白質(zhì)的能力，顯然更適合于表達(dá)用于粉絲制作的外源蛋白質(zhì)。 我們進(jìn)一步以淀粉酶基因缺失的枯草芽孢桿菌1A717 菌株為宿主對(duì)PUL3665 進(jìn)行異源表達(dá)。

以載體 pLac03-pul3665 為模板， 以 Pwx03、Pxw04 為 引物進(jìn) 行 PCR 擴(kuò) 增， 獲 得 2.2 kb 的pul3665 基因，用SpeI 和BamHI 酶切后與經(jīng)同樣酶切的枯草芽孢桿菌表達(dá)載體pUP43 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM109。 圖 7（a）是其中 2 個(gè)轉(zhuǎn)化子所含質(zhì)粒的酶切圖譜，圖7（b）是重組質(zhì)粒pUP43-pul3665 結(jié)構(gòu)圖。 由圖 7 可見，這兩個(gè)質(zhì)粒用 SpeI 和 BamHI 酶切后獲得兩個(gè)條帶， 一條約2.2 kb 與插入片段基因pul3665 一致， 另一條約 7.0 kb 的條帶與 pUP43 空質(zhì)粒一致，均符合pUP43-pul3665 應(yīng)有特征。 大量提取重組質(zhì)粒pUP43-pul3665 轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌1A717， 在含卡那霉素的LB 平板上檢出轉(zhuǎn)化子，任取10 個(gè)轉(zhuǎn)化子劃線分離后提取質(zhì)粒并將所提取的質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109， 再一次從大腸桿菌轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒酶切電泳。 結(jié)果顯示，從上述10 個(gè)枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子中提取后又轉(zhuǎn)回大腸桿菌的質(zhì)粒的酶切電泳條帶與圖7（a）中的條帶完全一致，可見上述10 個(gè)轉(zhuǎn)化子都是pUP43-pul3665 的轉(zhuǎn)化子。 取上述10 個(gè)枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，酶活檢測(cè)顯示，在TB 培養(yǎng)基中10 個(gè)轉(zhuǎn)化子均有較高的酶活。含空質(zhì)粒pUP43 的重組菌則只有很微弱的酶活，這可能是枯草芽孢桿菌自身普魯蘭酶基因表達(dá)產(chǎn)物[17]。 取其中一株編號(hào)為XWB08 的重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子命名為B. subtilis 1A717/pUP43-pul3665 XWB08，簡(jiǎn)稱XWB08，用于后續(xù)研究。

圖7 重組質(zhì)粒pUP43-pul3665 結(jié)構(gòu)與酶切圖譜Fig. 7 Map and restriction analysis of pUP43-pul3665

在TB 培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖8。重組菌XWB08 發(fā)酵至48 h 時(shí)酶活達(dá)到最高值，為113 U/mL，以后迅速下降，這可能源于宿主菌自身蛋白酶對(duì)外源蛋白質(zhì)的降解[19-20]。 進(jìn)一步取發(fā)酵液適當(dāng)稀釋后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，結(jié)果見圖9。相對(duì)于含pUP43 空質(zhì)粒的對(duì)照菌，含重組質(zhì)粒的菌株XWB08 在相對(duì)分子質(zhì)量81 000 附近有一明顯的差異表達(dá)條帶，該條帶相對(duì)分子質(zhì)量與PUL3665 理論相對(duì)分子質(zhì)量一致，結(jié)合酶活測(cè)定結(jié)果可以認(rèn)定為枯草芽孢桿菌表達(dá)的PUL3665 分子。

取各個(gè)發(fā)酵時(shí)間段的重組菌細(xì)胞，超聲波破碎后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)酶活，結(jié)果顯示，重組菌細(xì)胞內(nèi)均未檢測(cè)到酶活。 同樣條件下，取細(xì)胞破碎液進(jìn)行SDSPAGE 電泳，結(jié)果顯示含XWB08 和含空質(zhì)粒的對(duì)照菌的蛋白質(zhì)條帶在81 000 附近未發(fā)現(xiàn)明顯的差異表達(dá)條帶。 酶活檢測(cè)和SDS-PAGE 電泳結(jié)果均顯示， 基因pul3665 在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物可以全部分泌到細(xì)胞外。 這個(gè)結(jié)果與pul3665 在大腸桿菌中的表達(dá)的情況基本一致，只是PUL3665 在枯草芽孢桿菌中的分泌效率更高，可以全部分泌到細(xì)胞外。 與pLac03 一樣，表達(dá)載體pUP43 本身也沒有信號(hào)肽編碼區(qū)，pul3665 表達(dá)產(chǎn)物在芽孢桿菌中的高效分泌顯然是依靠自身結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)的。

圖8 重組菌B. subtilis 1A717/pUP43-pul3665 XWB08發(fā)酵進(jìn)程Fig. 8 Fermentation process of B. subtilis 1A717/pUP43-pul3665 XWB08

圖 9 重組菌 B. subtilis 1A717/pUP43-pul3665 XWB08 胞外蛋白質(zhì)Fig. 9 SDS-PAGE analysis of extracellular protein of B. subtilis 1A717/pUP43-pul3665 XWB08

2.6 普魯蘭酶PUL3665 在紅薯粉絲制作中的應(yīng)用

將XWB08 表達(dá)的普魯蘭酶用超濾機(jī)進(jìn)行濃縮，獲得的濃縮酶液的酶活為1 055 U/mL，用于紅薯粉絲的制作。 由表1 可見，按傳統(tǒng)方法進(jìn)行粉絲制作時(shí)，如果不添加普魯蘭酶或明礬，在煮絲階段粉絲間會(huì)發(fā)生比較嚴(yán)重的并條，給后續(xù)理絲工作帶來很大困難， 所制得的粉絲幾乎都帶有表面損傷，難以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。 在制芡糊階段按每克芡糊紅薯粉使用1 U 的PUL3665，則煮絲階段的并條現(xiàn)象明顯減少， 但由此制得的粉絲的斷條率約為15%，未能達(dá)到粉絲行業(yè)斷條率10%以下的質(zhì)量要求。 如果加入2 U 的PUL3665 處理芡糊則并條和斷條現(xiàn)象均進(jìn)一步減少，粉絲斷條率降至10 %以下，可以獲得質(zhì)量合格的粉絲。 繼續(xù)提高酶的用量，產(chǎn)品質(zhì)量不再有明顯提高，但也沒有明顯的負(fù)面影響。 考慮生產(chǎn)成本，用PUL3665 制作粉絲時(shí)，酶的用量以2 U 為比較合適。 表2 是本課題組前期工作中獲得的另一種中性普魯蘭酶GsP[10-11]用于粉絲制作的情況。由表2 可見，GsP 用于粉絲制作時(shí)， 使用效果與PUL3665 基本一致，其最適用量也是每克芡糊紅薯粉加酶2 U 為合適。 表3 所列是采用目前市場(chǎng)上可以購(gòu)買得到的一種耐酸性普魯蘭酶X 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從這個(gè)結(jié)果可知，用市售普魯蘭酶X 處理芡糊也能制作出質(zhì)量合格的粉絲， 但存在兩個(gè)方面的問題。首先是酶的用量比較大，每克芡糊紅薯粉的酶用量為10 U。市售普魯蘭酶是針對(duì)制糖工藝開發(fā)的酸性普魯蘭酶，這種酶在中性條件下不穩(wěn)定，這可能是酶的用量大的原因。 根據(jù)本課題組了解，這種普魯蘭酶來源于 Bacillus deramificans， 其最適 pH 為4.0， 在其最適條件下酶活可以達(dá)到3 800 U/mL，而在pH 6.5 條件下這種酶的酶活只有320 U/mL，這與文獻(xiàn)報(bào)道的這種酶的性質(zhì)基本一致[15]。 第二個(gè)問題是酶的用量需要嚴(yán)格控制，酶的用量低于5 U 或高于20 U 都有可能出現(xiàn)嚴(yán)重并條或爛糊現(xiàn)象。 過量使用普魯蘭酶X 導(dǎo)致出現(xiàn)爛糊現(xiàn)象可能與這種普魯蘭酶中的淀粉酶有一定的關(guān)系。 目前市售普魯蘭酶一般是用重組地衣芽孢桿菌生產(chǎn)的，而地衣芽孢桿菌本身是耐高溫α-淀粉酶的生產(chǎn)菌，因此普魯蘭酶產(chǎn)品中很可能有α-淀粉酶。 對(duì)此，作者將1%的可溶性淀粉和上述3 種普魯蘭酶混合后進(jìn)行保溫，結(jié)果顯示，PUL3665 或GsP 和淀粉混合后，混合液與碘反應(yīng)后始終顯示藍(lán)色，而普魯蘭酶X 與淀粉的混合液與碘反應(yīng)的顏色初期為藍(lán)色，大約15 min后變?yōu)闇\黃色，顯示淀粉已經(jīng)被降解。 可見，普魯蘭酶X 中混雜的淀粉酶活性有可能對(duì)淀粉進(jìn)行過度降解，因此這種酶在粉絲制作中使用時(shí)需要嚴(yán)格控制用量。

紅薯粉是一種未經(jīng)純化的初級(jí)農(nóng)產(chǎn)品，由于紅薯品種、加工方法等的不同其品質(zhì)差異很大，其中之一是以紅薯粉制成的芡糊的pH 波動(dòng)范圍比較大。 本課題組在江蘇省東?？h農(nóng)村調(diào)查的情況看，紅薯粉制成的芡糊的pH 一般在6.0~7.0 之間，但有些農(nóng)戶家的紅薯粉可以達(dá)到pH 5.5 甚至更低，這可能對(duì)酶的作用產(chǎn)生較大的影響，表4—5 是一種pH 5.5 的編號(hào)為2 號(hào)的紅薯面用于制作粉絲時(shí)普魯蘭酶 PUL3665 和 GsP 的作用效果。 比較表 4、表 1 可見， 以2 號(hào)紅薯粉為原料制作粉絲時(shí)，PUL3665 的作用效果與其作用于1 號(hào)紅薯粉的效果相當(dāng)。 比較表5 和表2 可見， 以2 號(hào)紅薯粉為原料制作粉絲時(shí)，GsP 的作用效果與作用于1 號(hào)紅薯粉的效果有明顯差異，前者需要按照每克芡糊淀粉4 U 的量添加酶處理2 號(hào)紅薯粉芡糊才能獲得斷條率在10%以下的成品粉絲。 這個(gè)差異顯然與兩種普魯蘭酶對(duì)pH 變化的適應(yīng)性差異有關(guān)。 GsP 對(duì)pH 變化高度敏感，pH 5.5 時(shí)其酶活只有最適條件pH 6.5 時(shí)酶活的60%， 而 PUL3665 則對(duì) pH 變化相對(duì)不敏感，在pH 5.5~7.5 的范圍內(nèi)其酶活均在最高酶活的80%以上。

表1 PUL3665 不同添加量對(duì)紅薯粉絲質(zhì)量的影響Table 1 Effects of PUL3665 on the quality of sweet potato flourvermicelli

表2 GsP 不同添加量對(duì)紅薯粉絲質(zhì)量的影響Table 2 Effects of GsP on the quality of sweet potato flour vermicelli

表3 普魯蘭酶X 不同添加量對(duì)紅薯粉絲質(zhì)量的影響Table 3 Effects of pullulanase X on the quality of sweet potato flourvermicelli

表4 PUL3665 不同添加量對(duì)紅薯粉絲質(zhì)量的影響Table 4 Effects of PUL3665 on the quality of sweet potato flourvermicelli

表5 GsP 不同添加量對(duì)紅薯粉絲質(zhì)量的影響Table 5 Effects of GsPon the quality of sweet potato flourvermicelli

3 結(jié) 語

作者克隆了地表地芽孢桿菌XQ3665 的普魯蘭酶基因pul3665 并實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)， 獲得了重組酶PUL3665。 PUL3665 是一種 I 型普魯蘭酶，最適溫度為55 ℃，比酶活32 U/mg。 與本課題組前期研究過的另一種地芽孢桿菌來源的普魯蘭酶GsP 相比，PUL3665 最重要的特點(diǎn)是其具有較為寬泛的pH 適應(yīng)范圍，在pH 5.5~7.5 范圍內(nèi)其酶活均在最高酶活的80%以上。 這一特點(diǎn)使這種酶在原料成分復(fù)雜、品質(zhì)變化較大的紅薯粉為原料的粉絲制作中表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)。 目前，粉絲的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝的主要應(yīng)用場(chǎng)所是農(nóng)村小作坊，其原料大多從農(nóng)戶家中收購(gòu)，產(chǎn)品品質(zhì)變化大，而由于條件所限也很難對(duì)原料性質(zhì)進(jìn)行分析和質(zhì)量控制，因此很難根據(jù)原料的變化對(duì)酶的使用量和使用方法進(jìn)行調(diào)整。 針對(duì)這種情況，酶的使用效果的穩(wěn)定性就成為影響其將來市場(chǎng)推廣的重要因素。作者選擇了pH 為6.5 和5.5 的1 號(hào)和2 號(hào)兩種紅薯粉進(jìn)行粉絲制作的試驗(yàn)， 初步研究結(jié)果顯示，PUL3665 的最適用量均為每克芡糊粉2 U，而用GsP 的最適用量則前者為2 U 后者為4 U， 初步證明在紅薯粉絲制作中PUL3665 使用效果更為穩(wěn)定。

構(gòu)建的重組菌B. subtilis 1A717/pUP43-pul3665 XW08 在未經(jīng)優(yōu)化的搖瓶發(fā)酵條件下發(fā)酵后最高酶活為113 U/mL，重組酶全部分泌到發(fā)酵液中，便于產(chǎn)品的提取。 XW08 的發(fā)酵液經(jīng)超濾獲得的濃縮酶液的活力為1 055 U/mL。 在紅薯粉絲制作中，酶的用量為每克芡糊粉2 U。 芡糊粉一般占粉絲紅薯粉總量的10%，即每千克粉絲中酶的用量為200 U，相當(dāng)于濃縮酶液0.19 mL，即添加量為0.019%，這個(gè)添加量遠(yuǎn)低于明礬或目前已見報(bào)道的其它明礬替代物的添加量，如果考慮酶液中絕大部分為水，則實(shí)際干物質(zhì)的添加量更小。 酶是一種蛋白質(zhì)，一般來講在加熱變性后與普通蛋白質(zhì)并沒有不同。 普魯蘭酶水解芡糊的產(chǎn)物為直鏈淀粉，蛋白質(zhì)和直鏈淀粉都是紅薯粉的正常成分， 因此從食品安全角度考慮，普魯蘭酶水解芡糊是一種值得重視的粉絲制作方法。

綜上所述，PUL3665 有希望開發(fā)成一種用量小、使用效果穩(wěn)定的新型明礬替代物。