負載胃泌素-生存素-熱休克蛋白融合蛋白樹突狀細胞在體內(nèi)外抗腫瘤活性研究

洪建明，占景華，蔡明勇

(福建醫(yī)科大學附屬漳州市醫(yī)院普通外科，福建 漳州 363000)

胃癌居全球惡性腫瘤相關(guān)死亡原因第2位，占全部惡性腫瘤死亡的10.4%[1]，在我國其發(fā)病率也呈上升趨勢。近年來，免疫治療作為一種通過激活機體免疫系統(tǒng)來特異性清除腫瘤細胞的新方法正逐步應(yīng)用到胃癌的治療中。腫瘤研究領(lǐng)域的學者越來越多把目光集中在免疫治療上，但是如今的免疫治療也存在諸多問題[2]。生存素作為凋亡蛋白家族抑制劑的成員之一，在人類許多種惡性腫瘤中過表達，陽性表達的生存素與分化相關(guān)，通過核糖核酸干擾后可導致胃癌細胞增殖和遷移降低[3]。更進一步研究發(fā)現(xiàn)，生存素導致細胞周期靜止，這表明生存素在胃癌中起重要作用，并且使用生存素沉默核糖核酸可能成為惡性腫瘤治療的有效方法[4]。至今，已有很多學者利用生存素及其異構(gòu)體的表位作為基礎(chǔ)載體研究出不同的基因疫苗或肽疫苗，并在抗腫瘤中取得成果，故我們通過聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)方法將胃泌素抗原表位-生存素抗原表位基因及類熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)蛋白基因連接在原核表達載體中，經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷誘導表達胃泌素-生存素-熱休克蛋白(Gas-Sur-Hsp70L1)融合蛋白。我們通過Western Blot法鑒定Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白的性質(zhì)，應(yīng)用體外的細胞實驗和體內(nèi)的動物實驗了解Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白的免疫激活活性以及對小鼠體內(nèi)腫瘤細胞生長的影響。

1 資料與方法

1.1 Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白和相關(guān)對照蛋白的原核表達與純化從高胃泌素血癥患者胃竇組織樣品中克隆胃泌素互補脫氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid，cDNA)全長，以此為模板PCR擴增編碼前胃液素第1～14位氨基酸殘基組成的編碼片段；從胃癌患者胃組織樣品中克隆生存素cDNA全長，以此為模板PCR擴增編碼生存素第32～54位氨基酸殘基組成的編碼片段；從健康志愿者外周血細胞培養(yǎng)的樹突狀細胞中克隆HSP cDNA全長。

通過酶切連接構(gòu)建pET28a-Hsp70L1、pET28a-Gas1-14-Hsp70L1、pET28a-Sur32-54-Hsp70L1、pET28a-Gas1-14-Sur32-54-Hsp70L1質(zhì)粒。重組表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，在LB培養(yǎng)基中用異丙基硫代半乳糖苷誘導表達，Western Blot法檢測表達蛋白；表達蛋白的N端均帶有6×His標簽，包涵體蛋白通過變性、復性；依次用Ni+金屬離子鰲合層析、離子交換層析進行純化，純化產(chǎn)物透析至磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)中凍存待用；銀染SDS-PAGE分析融合蛋白純度；鱟試劑測定法分析細菌脂多糖污染。

1.2 Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白對樹突狀細胞成熟的促進作用研究將培養(yǎng)第7天的小鼠非成熟樹突狀細胞，經(jīng)10 μg/mL Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白作用48 h后，流式細胞儀檢測樹突狀細胞表型：樹突狀細胞表面CD40、CD80、CD86、Iab等表面分子的表達情況。

1.3 Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白在小鼠體內(nèi)抗腫瘤活性研究在C57BL/6小鼠近尾根部右側(cè)背下部皮下肌注胃癌細胞，接種成功標準為注射局部出現(xiàn)直徑7 mm左右的皮丘。實驗分組：將50只帶瘤小鼠隨機均分為5組，每組10只小鼠。1)空白對照組：接種腫瘤后不予任何處理；2)陰性對照組：第1、4、7、14天在小鼠后腿部近淋巴結(jié)處皮下注射200 μL的PBS；3)1 μg Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白組：第1、4、7、14天于小鼠后腿部靠近淋巴結(jié)處皮下注射200 μL的5 g/L Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白；4) 10 μg Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白組：第1、4、7、14天于小鼠后腿部靠近淋巴結(jié)處皮下注射Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白200 μL的50 g/L Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白；5) 100 μg Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白組：第1、4、7、14天于小鼠后腿部靠近淋巴結(jié)處皮下注射Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白200 μL的500 g/L Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白，給藥后每3 d測量腫瘤體積。腫瘤體積按公式V=1/2ab2(a=瘤長，b=瘤寬)計算。

2 結(jié)果

2.1 Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白的鑒定Western Blot結(jié)果顯示本實驗所得Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白與抗生存素單克隆抗體結(jié)合。生存素的特異性在Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白中同樣存在。

2.2 Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白對人樹突狀細胞表面CD86表達的影響流式細胞術(shù)檢測提示通過引入Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白后我們觀察到樹突狀細胞表面CD86分子得到明顯表達，表達上調(diào)達到52.93%，這與對照細胞明顯不同，說明該融合蛋白能促進樹突狀細胞的活化成熟與表達。結(jié)果還顯示，融合蛋白中的脂多糖雜質(zhì)也可以促進CD86分子的表達，表達上調(diào)率為27.77%。上述對比提示Gas-Sur-Hsp70L1蛋白對CD86分子的上調(diào)起主要作用，前者比后者多38.60%。

2.3 Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白在小鼠體內(nèi)的抗腫瘤活性陰性對照組、空白對照組、1 μg Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白組、10 μg Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白組、100 μg Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白組腫瘤體積分別為(12.67±6.31)、(14.39±6.47)、(12.16±4.81)、(4.94±5.51)、(6.64±3.81)cm3。10 μg Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白組、100 μg Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白組腫瘤體積均高于陰性對照組和空白對照組(P均<0.05)。1、10、100 μg Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白均可以抑制小鼠體內(nèi)腫瘤生長，抑制率分別為0.04%、61.01%、47.59%。從實驗結(jié)果可以看出10 μg Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白具有最明顯有效抑制小鼠體內(nèi)腫瘤生長的作用。

3 討論

在眾多實驗中外源性腫瘤抗原通常只能通過體內(nèi)免疫誘導體液免疫反應(yīng)，然而細胞免疫反應(yīng)在腫瘤免疫中起主要作用[5-6]。因此，大多數(shù)腫瘤免疫領(lǐng)域的學者致力于尋找探索一種有效的方法或介質(zhì)可以把外源性腫瘤抗原或肽疫苗引入到細胞免疫途徑中。許多研究[7]表明，外源性主要組織相容性復合體-I(major histocompatibility complex-I，MHC-I)類腫瘤抗原表位可以通過HSP將其引導入細胞免疫中并發(fā)揮作用，激活細胞毒性T淋巴細胞攻擊、殺滅相應(yīng)的腫瘤細胞。本實驗中連接HSP70L1和生存素的部分MHC-I類抗原表位制成融合蛋白，進而誘導機體進行抗腫瘤免疫作用。

本實驗我們通過從人的濃縮白細胞中提取未成熟的樹突狀細胞，并在體外用Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白作用于此樹突狀細胞,通過檢測樹突狀細胞表面分子CD86的表達情況發(fā)現(xiàn)，Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白在促進樹突狀細胞表面分子CD86的表達方面起主要作用。這提示Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白對于樹突狀細胞的成熟起著促進作用，從而起著抗腫瘤免疫的作用。負載不同劑量Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白的樹突狀細胞注射荷瘤小鼠后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，劑量為10 μg的Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白對小鼠的腫瘤生長的抑制作用最明顯。這提示并不是Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白劑量越大抑瘤效果越好，最佳抑制腫瘤生長的劑量還需進一步研究。

如今腫瘤抗原的選擇是抗腫瘤免疫研究的熱點之一，將外源性腫瘤抗原引入細胞免疫途徑成為關(guān)鍵步驟[8]。本實驗設(shè)計并合成了一種Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白，發(fā)現(xiàn)其可以促進樹突狀細胞活化、成熟等。我們還發(fā)現(xiàn)Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了特異性的抗腫瘤作用，目前已經(jīng)有研究證實Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白用于腫瘤的免疫治療是可行的[9]。我們也初步發(fā)現(xiàn)并證明了Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白的免疫激活作用和抗腫瘤作用[10-12]?？傊?，Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白可能具有一定的抗腫瘤活性。