食管癌腫瘤標(biāo)志物的研究進(jìn)展

張麗亞，賈培君，尚晉文，張成娟

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院、河南省腫瘤醫(yī)院生物樣本中心，河南 鄭州 450008)

食管癌是惡性程度較高的消化系統(tǒng)腫瘤之一,分為食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinomas,ESCC)與食管腺癌,2018年全球癌癥數(shù)據(jù)最新統(tǒng)計(jì)顯示,全球食管癌新發(fā)病例約為57.2萬例,在36種惡性腫瘤中占3.2%,排第7位，死亡病例約為50.8萬例,占5.3%,排第6位[1]。我國亦是食管癌的高發(fā)地區(qū)，2015年的研究分析顯示，食管癌的發(fā)病率占全部惡性腫瘤的第6位，死亡率占第4位[2]。早期食管癌癥狀不明顯，且無特異性診斷方法,因此，大部分患者確診時(shí)已屬中晚期，根治性治療手段有限，臨床上預(yù)后較差[3]。

腫瘤標(biāo)志物是指存在于特定的惡性腫瘤細(xì)胞,或由惡性腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生,或腫瘤對(duì)宿主的刺激產(chǎn)生,并能反映腫瘤發(fā)生、發(fā)展和監(jiān)測(cè)腫瘤對(duì)治療反應(yīng)的一類物質(zhì)。臨床上尋找有效的腫瘤標(biāo)志物,對(duì)食管癌患者提高生存率降低死亡率等具有十分重要的意義。本文就近年來報(bào)道的食管癌腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行總結(jié)，分別從DNA、RNA和蛋白質(zhì)等方面進(jìn)行闡述。

1 DNA類腫瘤標(biāo)志物

1.1 DNA甲基化DNA甲基化是一種常見表觀遺傳過程，在不影響基因組DNA序列本身的情況下，通過DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用在含胞嘧啶、鳥嘌呤的二核苷酸的胞嘧啶上添加一個(gè)甲基基團(tuán)，可導(dǎo)致基因表達(dá)的抑制[3]。DNA甲基化在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)階段都發(fā)揮著重要的作用，單個(gè)或多個(gè)基因的甲基化可作為分子生物標(biāo)志物，用于惡性腫瘤的分類、早期診斷、治療監(jiān)測(cè)以及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)。

Tang等[4]通過焦磷酸測(cè)序法發(fā)現(xiàn)ESCC腫瘤組織中成對(duì)盒基因1(paired box gene 1,PAX1)、性別決定區(qū)域Y-box-1(sex determining region Y-box-1,SOX1)和鋅指蛋白582(zinc finger protein582,ZNF582)的DNA甲基化水平均高于配對(duì)的癌旁組織和正常組織，提示檢測(cè)PAX1、SOX1、ZNF582基因的甲基化狀態(tài)可能是一種有前途的ESCC篩查和診斷的生物標(biāo)志物。Kurimoto等[5]對(duì)78例經(jīng)手術(shù)切除的ESCC患者采用定量甲基化特異性PCR(quantitative methylation specific PCR,qMSP)評(píng)價(jià)PAX5的甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示ESCC腫瘤組織平均qMSP值較鄰近正常組織高，高qMSP值者無復(fù)發(fā)生存率較低，并且PAX5敲除細(xì)胞的增殖和對(duì)順鉑的耐藥性明顯增加，提示PAX5基因甲基化預(yù)示ESCC患者較差的生存結(jié)局和順鉑敏感性，可作為惡性腫瘤治療方案選擇的有效輔助工具。Chen等[6]采用MSP檢測(cè)135例ESCC組織中性多聚甲醛固定石蠟包埋組織的轉(zhuǎn)錄因子叉頭框F2(Forkhead box F2,FOXF2)啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXF2啟動(dòng)子甲基化可以獨(dú)立預(yù)測(cè)ESCC患者的總體生存率，提示FOXF2啟動(dòng)子甲基化可能是一種有用的ESCC患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。

1.2 融合基因融合基因是由2個(gè)先前獨(dú)立的親本基因形成的雜交基因。以往，基因融合被視為惡性腫瘤中常見的驅(qū)動(dòng)突變，與血液、淋巴和骨髓組織有關(guān)，但在實(shí)體腫瘤中也扮演著越來越重要的角色，并且可以作為診斷和治療的分子靶點(diǎn)。Jiang等[7]通過全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在ESCC中發(fā)現(xiàn)了一種新的融合基因人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)-E和HLA-B，這將成為ESCC診斷的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，為更好了解ESCC的腫瘤發(fā)生機(jī)制提供新的思路。Blum等[8]通過綜合RNA測(cè)序評(píng)估了55例預(yù)治療食管腺癌和49例巴雷特食管內(nèi)鏡檢查患者的非惡性活檢組織的基因融合情況，發(fā)現(xiàn)21個(gè)新的候選食管腺癌相關(guān)融合基因，選擇2個(gè)候選融合體進(jìn)行PCR和Sanger測(cè)序驗(yàn)證，觀察到核糖體蛋白S6激酶β1(RPS6KB1)-泡膜蛋白1(vacuole membrane protein 1，VMP1)基因融合在大約10%的食管腺癌病例中反復(fù)發(fā)生，并且RPS6KB1-VMP1融合的食管腺癌患者總體生存期明顯較差。RPS6KB1-VMP1是一種通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)過程促進(jìn)食管腺癌的基因融合，為其分子發(fā)病機(jī)制提供了新的見解。

1.3 單核苷酸多態(tài)性單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP作為第3代遺傳標(biāo)記，具有分布廣泛、數(shù)量多、遺傳特性穩(wěn)定和易于快速、規(guī)?；Y查的特點(diǎn)，既是闡明腫瘤易感性的分子基礎(chǔ)，揭示腫瘤異質(zhì)性的根本原因，也可作為鑒別易感人群和靶向治療的分子標(biāo)志[9]。Vashist等[10]從190例單純行食管癌全切除的患者外周血白細(xì)胞中提取基因組DNA并分析臨床數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)T393C-SNP是食管癌患者復(fù)發(fā)和生存的一個(gè)強(qiáng)有力的獨(dú)立預(yù)后因素。因此，T393C GNAS1多態(tài)性作為食管癌獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物，術(shù)前確定GNAS1基因型可將患者分為不同的風(fēng)險(xiǎn)狀況，并可能有助于定制治療和隨訪方案。Yang等[11]對(duì)中國寧夏地區(qū)80例惡性腫瘤患者和200例非惡性腫瘤對(duì)照采用PCR直接測(cè)序法鑒定了p21Waf1/Cip1基因3種變異(codon31、IVS2+16、SNP309)，并分析了3種SNP的單倍型和單個(gè)SNP與食管癌的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)密碼子31Ser等位基因純合性，無論是單獨(dú)或與其他2個(gè)SNP結(jié)合，可能與食管癌的發(fā)展有關(guān)。見表1。

表1 DNA類腫瘤標(biāo)志物

2 RNA類腫瘤標(biāo)志物

2.1 長鏈非編碼RNA長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是長度大于200個(gè)核苷酸的不能翻譯成蛋白的功能性RNA,參與基因組印記、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N調(diào)控過程。許多l(xiāng)ncRNA在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)失調(diào)，在腫瘤發(fā)生和腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用,可作為一種新的腫瘤標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。

一個(gè)典型例子就是由HOXC位點(diǎn)表達(dá)的同源異型盒基因轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA,HOTAIR)。Lv等[12]通過原位雜交和定量逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(quantitative reverse transcriptase PCR,qRT-PCR)檢測(cè)HOTAIR的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)ESCC組織中HOTAIR表達(dá)明顯增高，HOTAIR在ESCC患者中的高表達(dá)水平與臨床分期、TNM分級(jí)、組織學(xué)分化程度呈正相關(guān)。因此，HOTAIR是ESCC預(yù)后的一種潛在的腫瘤標(biāo)志物，其失調(diào)可能在ESCC進(jìn)展中起重要作用。Bao等[13]采用qRT-PCR檢測(cè)147例ESCC患者發(fā)現(xiàn)ESCC組織中FOXD2相鄰的反鏈RNA1(FOXD2-AS1)表達(dá)高于鄰近非腫瘤組織，而且Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，ESCC患者中FOXD2-AS1高表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)。因此，F(xiàn)OXD2-AS1可能作為ESCC患者判斷預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。

2.2 嵌合RNA嵌合RNA由2個(gè)或2個(gè)以上基因的外顯子組成，并具有編碼新蛋白改變細(xì)胞表型的潛力。嵌合RNA不僅可以在DNA水平上通過染色體重排產(chǎn)生，還可以在RNA水平上通過基因間剪接產(chǎn)生。嵌合RNA可以發(fā)揮新的細(xì)胞復(fù)雜性能，與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展存在著密切關(guān)系，可作為腫瘤診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。

Zhang等[14]分析了32個(gè)復(fù)發(fā)性惡性腫瘤嵌合RNA在ESCC及其細(xì)胞株中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)GOLM1-MAK10是ESCC中的一種惡性腫瘤富集嵌合RNA，而且原位雜交顯示，嵌合體的表達(dá)主要局限于患者的腫瘤細(xì)胞，在正常受試者的非腫瘤性食管組織中幾乎檢測(cè)不到?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)為ESCC的分子機(jī)制研究提供了新的思路，并為食管癌未來的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)。Lin等[15]使用qRT-PCR檢測(cè)唾液外泌體GOLM1-NAA35嵌合RNA，并分析其診斷準(zhǔn)確性、治療反應(yīng)的縱向監(jiān)測(cè)和無進(jìn)展生存期的預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示體外GOLM1-NAA35嵌合RNA在ESCC細(xì)胞和裸鼠ESCC異種移植中均可檢測(cè)到，GOLM1-NAA35嵌合RNA水平反映體內(nèi)腫瘤負(fù)荷。因此，唾液外泌體GOLM1-NAA35嵌合RNA是一種有效的非侵入性生物標(biāo)志物，可方便、可靠地評(píng)估治療反應(yīng)、復(fù)發(fā)和早期檢測(cè)。

2.3 微小RNA微小RNA(microRNA,miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，其參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控。MiRNA表達(dá)的改變也會(huì)改變癌基因和抑癌因子的表達(dá)，影響了包括ESCC在內(nèi)的胃腸道腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、能動(dòng)性和侵襲性[16]。多種miRNA表達(dá)譜可能提供有用的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

Wang等[17]通過qRT-PCR檢測(cè)新鮮ESCC組織中miR-3651的表達(dá)水平,統(tǒng)計(jì)并分析miR-3651表達(dá)與臨床特征和預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示，腫瘤組織中miR-3651的表達(dá)較癌旁組織明顯下調(diào)，miR-3651的表達(dá)與ESCC的腫瘤浸潤程度呈負(fù)相關(guān)。MiR-3651可能在惡性腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，并可作為ESCC患者的預(yù)后標(biāo)志物。Jiang等[18]的研究結(jié)果顯示食管癌患者血清中miR-218的表達(dá)明顯低于健康人,分化較差、晚期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者血清中miR-218的表達(dá)更低，因此，血清miR-218可能是食管癌患者早期檢測(cè)和臨床評(píng)價(jià)的潛在生物標(biāo)志物。Kurashige等[19]采用RT-PCR檢測(cè)71例ESCC患者和39例健康對(duì)照者血清miR-21水平后發(fā)現(xiàn)，ESCC患者血清miR-21明顯高于健康對(duì)照者，術(shù)后樣本與術(shù)前樣本相比，血清miR-21水平顯著降低。此外，miR-21水平在對(duì)化療有反應(yīng)的ESCC患者中顯著降低(P=0.003)，而在無反應(yīng)的ESCC患者中無顯著變化。因此，血清miR-21被認(rèn)為是診斷ESCC的一種新的生物標(biāo)志物，也可以作為ESCC患者化療期間的反應(yīng)標(biāo)志物。見表2。

表2 RNA類腫瘤標(biāo)志物

3 蛋白質(zhì)類腫瘤標(biāo)志物

Numb蛋白在細(xì)胞分裂過程中的不對(duì)稱分離決定了細(xì)胞的結(jié)局,其具有多種功能，涉及發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)和腫瘤生物學(xué)等多個(gè)研究領(lǐng)域。Liu等[20]通過對(duì)212例患者的組織芯片分析發(fā)現(xiàn),與對(duì)應(yīng)的非腫瘤組織相比,ESCC組織中的Numb蛋白明顯上調(diào)。Kaplan-Meier生存分析提示,高表達(dá)的Numb蛋白與高腫瘤復(fù)發(fā)率(P=0.015)和低整體術(shù)后生存(P=0.016)顯著相關(guān)。因此，Numb蛋白有潛力作為一種新的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

CD59是一種膜結(jié)合的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，可以通過脂質(zhì)筏上的Src激酶?jìng)鬟f信號(hào)，從而發(fā)揮與補(bǔ)體無關(guān)的作用。Zhou等[21]發(fā)現(xiàn)CD59的表達(dá)水平與食管癌細(xì)胞系和臨床標(biāo)本的耐輻射性呈正相關(guān)。在接受放療的ESCC患者中高表達(dá)的CD59提示較差的總生存率和無病生存率。CD59表達(dá)的遺傳改變調(diào)節(jié)了食管癌細(xì)胞對(duì)電離輻射的敏感性。因此，CD59可能是預(yù)測(cè)ESCC對(duì)放療的敏感性的潛在生物標(biāo)記。

血管生成素樣蛋白2(angiopoietin-like protein,ANGPTL2)介導(dǎo)慢性炎癥，腫瘤細(xì)胞來源的ANGPTL2促進(jìn)腫瘤侵襲和血管生成。ANGPTL2在腫瘤細(xì)胞中的過表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展有關(guān)，在肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和胃癌中均有發(fā)現(xiàn)。Ide等[22]研究發(fā)現(xiàn)ANGPTL2低表達(dá)降低了食管癌細(xì)胞系的增殖、侵襲和遷移能力，高分化的ESCC組織中ANGPTL2表達(dá)明顯升高，ANGPTL2高表達(dá)患者的總生存率和無病生存率明顯低于低表達(dá)患者。因此，ANGPTL2可作為食管癌診斷和預(yù)后的一種新的生物標(biāo)志物。

自身抗體是指針對(duì)自身組織、器官、細(xì)胞及細(xì)胞成分的抗體。抗腫瘤相關(guān)抗原的自身抗體已在多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)，并可作為早期惡性腫瘤診斷的生物標(biāo)志物。Chen等[23]收集149例ESCC患者和98例健康對(duì)照者，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定發(fā)現(xiàn)早期ESCC患者血清中針對(duì)成束蛋白的自身抗體水平明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)。這提示成束蛋白自身抗體可能是一種潛在的ESCC早期檢測(cè)的生物標(biāo)志物。Ye等[24]的研究發(fā)現(xiàn)叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(forkhead/winged helix transcription factor,FOXP3)循環(huán)IgG自身抗體可能是早期診斷食管癌的潛在生物標(biāo)志物。某些自身抗體聯(lián)合檢測(cè)，可以在獲得較高水平的特異性的同時(shí)獲得更高的敏感性[25]。見表3。

表3 蛋白質(zhì)類腫瘤標(biāo)志物

4 結(jié)語

腫瘤標(biāo)志物對(duì)食管癌患者的診斷治療和判斷預(yù)后有一定的幫助，但是許多標(biāo)志物仍處于實(shí)驗(yàn)探索階段，具有一定的局限性，缺乏高敏感性和特異性，有些檢測(cè)方法繁瑣且昂貴不適合于臨床大規(guī)模應(yīng)用。另外，部分研究樣本量較小，結(jié)果說服力不強(qiáng)。然而腫瘤標(biāo)志物在早期診斷中簡單易行且相對(duì)無創(chuàng)的優(yōu)點(diǎn)還是十分明確的。相信未來隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，腫瘤標(biāo)志物敏感性和特異性均會(huì)得到提高，其將會(huì)成為越來越重要的輔助檢測(cè)手段，而且多個(gè)腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)可以提高敏感性和特異性，更好為食管癌患者的診斷治療和判斷預(yù)后提供指導(dǎo)意義。