超聲波法制備阿苯達唑包合物工藝研究

吳 蕾，劉紅云，張 莉，吳 昊，許世富

(安徽省獸藥飼料監(jiān)察所，合肥 230091)

阿苯達唑(Albendazole，以下簡稱ABZ)系苯并咪唑類衍生物，是一種人獸共用的廣譜抗蠕蟲藥，對多種寄生蟲具有高度活性。作為獸藥使用時，由于其在水中不溶[1]而限制了該品種新劑型的發(fā)展，目前一般以片劑或者預(yù)混劑形式應(yīng)用。β-環(huán)糊精(以下簡稱β-CD)具有內(nèi)疏水、外親水的特殊結(jié)構(gòu)，分子空腔大小適中、無毒，可容納客分子，從而相對提高難溶物質(zhì)的水溶性、穩(wěn)定性及生物利用度[2]，其性質(zhì)安全無毒，不引起免疫反應(yīng)，口服后可在腸道中參與機體代謝，體內(nèi)不累積，且生產(chǎn)成本低，是一種廣泛應(yīng)用于食品、制藥等領(lǐng)域的常見輔料[3-4]。本文以超聲波法制備阿苯達唑β-CD 包合物，采用L9(34) 正交試驗法，以包合率、包合物得率為綜合指標(biāo)對包合工藝進行優(yōu)選，通過相溶解度法研究考察包合物中主客體分子之間的包合物物質(zhì)的量之比，并考察包合物的溶解度、紫外光譜吸收、熔點等物理性質(zhì)，旨在為獸用新劑型的開發(fā)提供技術(shù)思路。

1 儀器與試藥

TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，KS4000控溫震蕩搖床(德國IKA)，KS500超聲波清洗器(寧波科生儀器廠)，D3000高效液相色譜儀(美國賽默飛)，WRR熔點儀(上海申光儀器儀表有限公司)，RCZ-8 W溶出度儀(天津天大天發(fā)科技有限公司)，VD23減壓干燥箱(德國BINDER)，IQ7000超純水儀(美國密理博公司)，BT125D電子天平(德國賽多利斯)，HJ-4A磁力攪拌器(常州國宇儀表廠)。阿苯達唑(河北美荷藥業(yè)有限公司)，β-環(huán)糊精(國藥集團試劑有效公司)，甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 高效液相檢測包合物中阿苯達唑含量方法的建立

2.1.1 檢測波長的選取 取ABZ對照品加4%乙酸甲醇(2 ∶50,V∶V,下同)溶解，在波長200～400 nm范圍內(nèi)掃描，ABZ在波長296 nm 處有最大吸收峰，空白輔料在此波長處無吸收，不干擾ABZ的測定，因此選定296 nm作為檢測波長。紫外吸收見圖1。

圖1 ABZ紫外吸收圖Fig 1 UV-absorption spectrum of ABZ

2.1.2 色譜條件 色譜柱為eclipse Plus C18 柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)，柱溫25 ℃，流動相為乙腈-甲醇-水(56 ∶28 ∶18,V∶V)，流速1 mL/min，檢測波長296 nm，進樣量10 μL，外標(biāo)法定量。ABZ標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖2。

圖2 ABZ對照品HPLC圖Fig 2 HPLC chromatograms of ABZ

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取ABZ對照品20 mg，用4%乙酸甲醇溶解并定容于50 mL量瓶中，得濃度為400 μg/mL的母液。分別從母液中移取1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mL 置100 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，得濃度分別為4.0、8.0、20.0、40.0、80.0 μg/mL的對照品溶液。精密吸取10 μL 上述溶液，進樣測定。由ABZ峰面積(Y)對質(zhì)量濃度(X)進行線性回歸，得回歸方程Y=0.8876X-0.8627，r=0.9992，表明ABZ在4.0～80.0 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度試驗 取質(zhì)量濃度為20.0 μg/mL ABZ對照品溶液，按照色譜條件重復(fù)進樣5次，得色譜圖按峰面積積分計算RSD為0.88%(n=5)。

2.1.5 供試品溶液的制備 精密稱取干燥包合物0.2 g至50 mL量瓶中，加入2 mL冰醋酸、10 mL甲醇，超聲20 min，放冷至室溫后甲醇定容至刻度，0.45 μm濾膜過濾，進樣。

2.1.6 回收率試驗 取適量ABZ-β-CD(按ABZ與β-CD物質(zhì)的量之比1∶1)加蒸餾水至刻度，共18份，分成3組，每組6份，每組分別加入不同量的ABZ對照品溶液配制成質(zhì)量濃度分別為3.42、10.16、40.63 μg/mL的低、中、高3種質(zhì)量濃度樣品溶液，渦旋混合均勻后按照前述供試品的制備方法進行處理后進樣10 μL，由測定的峰面積計算測得量，并分別計算回收率為95.23%、96.17%、100.02%，RSD為0.36%、0.48%、0.43%(n=6)。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.4”項下的溶液1份，室溫下放置，按照前述色譜條件分別在12、24、36、48、60、72 h 進樣分析，峰面積RSD為0.65%，表明供試品溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 重復(fù)性試驗 取同一樣品，按“2.1.5”制備5份供試品，按照色譜條件進樣分析，峰面積RSD為0.56%。

2.2 包合物制備方法研究

2.2.1 不同制備方法的比較

2.2.1.1 飽和溶液法 精密稱取一定量的ABZ至50 mL乙醇-丙酮(1∶1，V∶V)中，55 ℃恒溫攪拌，另稱取β-CD適量至50 mL蒸餾水中，55 ℃恒溫攪拌溶解，緩慢滴入前液，滴定完成后，溶液均相透明，恒溫55 ℃攪拌5 h，置4 ℃冰箱放置12 h,抽濾,用60 ℃的乙醇-丙酮(1∶1，V∶V)洗滌未包合的主藥，60 ℃減壓干燥，得包合物。平行制備3份，包合率為41.12%±0.35%，包合物得率為79.34%±0.75%(n=3)。

2.2.1.2 超聲波法 精密稱取β-CD適量，加入適量55 ℃的超純水中制成不同濃度的水溶液，精密稱取ABZ適量，加入50 mL乙醇-丙酮(1∶1,V∶V)，55 ℃恒溫攪拌使溶解，按規(guī)定比例將β-CD水溶液緩緩滴入ABZ溶液中。設(shè)置條件，超聲，冷至室溫，4 ℃冷藏12 h，抽濾，用60 ℃的乙醇-丙酮(1∶1，V∶V)洗滌，60 ℃減壓干燥，得包合物。平行制備3份，包合率為61.12%±0.35%，包合物收率為89.02%±0.75%(n=3)。

通過以上試驗比較發(fā)現(xiàn)，超聲波法制備的包合物包合率較高，故選擇超聲波法制備阿苯達唑包合物。

2.2.2 包合物制備工藝優(yōu)化

2.2.2.1 正交設(shè)計 根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果及參考文獻，初步判斷影響β-CD包合率的主要因素為主客分子的投料摩爾比(A)、超聲時間(B)及β-CD水溶液濃度(C)等[5]。本試驗以包合率、得率的綜合評分作為評價指標(biāo)，每個因素各取3個水平，采用L9(34)正交表進行正交試驗，因素水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平表Tab 1 The factor and level of orthogonal test

2.2.2.2 包合物的制備 精密稱取β-CD適量，加入適量50 ℃的超純水中制成不同濃度的水溶液，精密稱取ABZ適量，加入50 mL乙醇-丙酮(1∶1,V∶V)，60 ℃恒溫攪拌使溶解，按規(guī)定比例將β-CD緩緩滴入ABZ溶液中。設(shè)置條件，超聲，冷至室溫，4 ℃冷藏12 h，抽濾，用60 ℃的乙醇-丙酮(1∶1，V∶V)洗滌，60 ℃減壓干燥，得包合物。

2.2.2.3 包合率、包合物得率的測定 包合率、包合物得率的具體計算公式如下：

包合率= 包合物中ABZ量/ABZ投入量×100%

包合物得率=包合物質(zhì)量/(β-CD加入質(zhì)量+ABZ加入質(zhì)量)×100%

2.2.2.4 綜合評價 由參閱文獻所知，包合率是衡量包合效果的重要指標(biāo)[6]，包合率越高，包合效果越好，對穩(wěn)定性的提高起關(guān)鍵作用，故權(quán)重系數(shù)定為0.6；而得率在實際生產(chǎn)中具有重要意義，在投入量一定的情況下，得率越高，包合率越高，權(quán)重系數(shù)定為0.4。包合率max、得率max分別是試驗中各指標(biāo)的最大值，綜合評分按下列公式計算：

綜合評分=(包合率/包合率max)×0.6+(得率/得率max)×0.4

2.2.2.5 正交試驗結(jié)果及數(shù)據(jù)分析 按正交試驗方案，進行9組試驗，每組平行3次，計算相關(guān)指標(biāo)的平均值。正交試驗結(jié)果及直觀分析見表2。

表2 正交實驗結(jié)果Tab 2 The results of orthogonal test

根據(jù)正交試驗的結(jié)果及極差直觀分析可知，影響包合效果的順序為B >A >C，進一步方差分析可知，因素B對包合工藝有極顯著影響，因素A和C對包合工藝有顯著影響。因此，確定最佳包合工藝為A3B2C1，即ABZ與β-CD投料比為1∶2，超聲時間40 min，β-CD水溶液濃度8%為最優(yōu)包合條件。

2.2.2.6 工藝驗證試驗 按正交試驗篩選出的最佳工藝條件A3B2C1進行驗證，結(jié)果見表3，可看出正交試驗所確定的ABZ-β-CD 包合工藝穩(wěn)定。

表3 正交驗證試驗結(jié)果Tab 3 The verification results of orthogonal test

2.3 包合物的驗證

2.3.1 紫外光譜掃描 稱取適量ABZ-β-CD包合物、β-CD，分別溶于水中，在室溫下于200～800 nm進行掃描，結(jié)果見圖3。可以看出ABZ-β-CD包合物在290 nm附近有較強吸收，β-CD在200～800 nm基本無吸收，說明包合物已經(jīng)形成。

1：ABZ-β-CD包合物；2：β-CD圖3 紫外吸收比較圖Fig 3 UV spectrum

2.3.2 相溶解度的測定 精密稱量β-CD粉末適量，分別配制成濃度為2、4、8、10、14、16 mmol/L的β-CD水溶液，精密量取上述溶液各10 mL，至50 mL離心管中，分別加入過量的ABZ粉末，密封，超聲10 min，渦旋混合1 min，然后置于30 ℃恒溫振蕩器中振蕩72 h，靜置12 h，上清液經(jīng)0.46 μm濾膜過濾，以4%乙酸甲醇稀釋，按2.1項方法測定，以β-CD濃度(mmol/L)為橫坐標(biāo)，ABZ的濃度(μg/mL)為縱坐標(biāo)，繪制相溶解度圖(圖4)。結(jié)果顯示，ABZ的質(zhì)量濃度隨β-CD 質(zhì)量濃度的增加而呈非線性增加，其相溶解度圖為典型的Ap型[7]，表明ABZ-β-CD在該質(zhì)量濃度內(nèi)藥物與環(huán)糊精形成1∶n(n>1) 的包合物。

圖4 ABZ-β-CD相溶解圖Fig 4 Phase solubility diagram of ABZ-β-CD

2.3.3 包合物在水中表觀溶解度的測定 稱取ABZ-β-CD 包合物，置25 mL量瓶中，加水至刻度，25 ℃振蕩平衡48 h，形成ABZ-β-CD包合物的過飽和溶液。移取上述溶液，0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液測定，計算包合物質(zhì)量濃度和表觀溶解度。結(jié)果ABZ-β-CD包合物在水中的表觀溶解度為15 mg/mL，比阿苯達唑在水中溶解度至少提高20倍。

2.3.4 熔點測定 對ABZ、β-CD、ABZ-β-CD包合物以及ABZ和β-CD物理混合物進行熔點測定。結(jié)果顯示，ABZ熔點為209～212 ℃，β-CD熔點為193～196 ℃，ABZ-β-CD包合物熔點為229～235 ℃，ABZ和β-CD物理混合物熔點為205～220 ℃。由此可見，包合物熔點與ABZ、β-CD、物理混合物熔點明顯不同，這也可以說明包合物為新的物相。

3 討 論

3.1 檢測波長的確定 本實驗建立了HPLC檢測ABZ的分析方法，該方法簡便易行，專屬性強，回收率穩(wěn)定，出峰時間短，可用于包合物中ABZ的定量測定。阿苯達唑?qū)φ掌啡芤涸?00～400 nm 內(nèi)的紫外光譜掃描結(jié)果顯示，其最大吸收波長在296 nm，而β-CD在此波長處無吸收，不干擾測定。故本文將檢測波長定為296 nm。

3.2 主藥溶解介質(zhì)的確定 阿苯達唑水溶性極差，在丙酮、乙醇、氯仿中也僅是微溶。有文獻報道[8]將阿苯達唑溶于甲酸后再用乙醇溶解，但由于β-CD在酸性環(huán)境中會發(fā)生解離，會極大降低包合物的得率。許愛霞等[9]采用55 ℃的丙酮∶乙醇(1∶1,V∶V)混合溶劑作為主藥的溶解介質(zhì)。

3.3 制備方法的確定 包合物的制備方法一般有飽和水溶液法、研磨法、噴霧干燥法、冷凍干燥法等。方法的選擇需要考慮多個因素，如包合物的包合率、得率、方法的普適性、成本、放大效應(yīng)等。冷凍干燥、噴霧干燥、研磨法均需特殊的設(shè)備，飽和水溶液法攪拌時間過長，費時費力。超聲波法則較為簡便快速。有報道稱，超聲處理可以提供更高的物理作用力，利于包合過程的形成[10]。在2.2.1.1項中，本文參考文獻[8]采用逆向攪拌法考察飽和溶液法的實驗指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)飽和溶液法較為費時，滴加速度慢(平均1 mL/min)，含藥溶液50 mL滴加完成需1 h左右，且還需長時間攪拌，預(yù)實驗包合率也僅為41%，遠低于超聲波法，故在本試驗中采用設(shè)備簡便易得的超聲波法制備ABZ-β-CD包合物并采用正交設(shè)計優(yōu)化制備工藝。在后續(xù)研究中，將研究工業(yè)化生產(chǎn)適用方法如噴霧干燥或研磨法，進一步提高生產(chǎn)效率。

3.4 包合物的鑒定 本文在制備包含物后經(jīng)相溶解度研究、熔點測定、紫外吸收光譜的測定證明包合物形成了新的物象，而不是β-CD與ABZ的簡單混合。相溶解度研究證明，ABZ與β-CD相溶解度圖為典型的AP型，說明有可溶性的包合物形成，且包合比是1∶n。與正交試驗篩選出的主客體摩爾比1∶2吻合。