連花柴芩可溶性粉的毒理學(xué)研究

李曉，王學(xué)方，范毅，張麗先，陳娟，吳春麗,曹靜亞

(1.河南省生物技術(shù)開發(fā)中心，鄭州 450002；2.河南省科高植物天然產(chǎn)物開發(fā)工程技術(shù)有限公司，鄭州 450002；3.河南中亞神鵬醫(yī)藥科技有限公司，鄭州 450061；4.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，鄭州 450001)

連花柴芩可溶性粉是由《溫病條辨》中的“銀翹散”和《傷寒雜病論》中的“小柴胡湯”兩個經(jīng)典方加減組方而成，結(jié)合銀翹散辛涼透表、清熱解毒[1]和小柴胡湯和解少陽、和胃降逆、扶正祛邪的功效[2]，臨床擬用于風熱犯肺所致的雞發(fā)熱、咳嗽、口渴喜飲、食欲減退等證。方中連翹[3]、山銀花[4]為君藥，辛涼解表、疏散表邪；柴胡[5]和解退熱，升舉陽氣；黃芩[6,7]清熱燥濕，瀉火解毒，兩藥配伍，清解半表半里之邪，使郁熱外達為臣藥；紫蘇葉祛風解表、行氣和胃，甘草補脾益氣、祛痰止咳、調(diào)和諸藥共為佐使。現(xiàn)代藥理研究表明本方具有明顯的抗炎解熱、止咳祛痰與調(diào)節(jié)免疫的功效[8]。本研究旨在探討連花柴芩可溶性粉對小鼠急性毒性試驗的安全性，對連續(xù)30 d給藥的大鼠長期毒性試驗中大鼠的一般癥狀、體重、攝食量、血液學(xué)、血液生化學(xué)、臟器系數(shù)以及組織病理學(xué)的影響[9-14]。研究其可能引起的不良反應(yīng)和毒性特征，判斷連花柴芩可溶性粉的毒性靶器官或靶組織，以期為臨床用藥的安全性提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 受試藥物 連花柴芩可溶性粉，河南中亞神鵬醫(yī)藥科技有限公司提供，批號20170617，經(jīng)河南省獸藥監(jiān)察所檢驗符合規(guī)定。

1.2 試驗動物 SPF級昆明小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量范圍18±2 g，SPF級SD大鼠，雌雄各半，給藥時動物體重范圍為180(g)±20%，購自河南省實驗動物中心，許可證號SCXK(豫)2010-0002。普通環(huán)境飼養(yǎng)，自由攝食、進水。

1.3 主要試劑 谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總蛋白(TP)、血糖(GLU)、總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)和肌酐(CRE)試劑盒購自艾美捷科技有限公司。蘇木素染色液、伊紅染色液、中性樹膠、苦味酸均購自Sigma公司。

1.4 主要儀器 ABX-PENTRA-80全自動血細胞分析儀，法國HORIBA公司；C2000-4型血凝儀，北京普利生儀器有限公司；XSP-24 N型生物顯微鏡，南京江南光電集團股份有限公司；TDL80-2B低速臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器總廠；BT-2000PLUS全自動生化分析儀，意大利BT公司；DSI 905電解質(zhì)分析儀，上海迅達醫(yī)療儀器有限公司；FA1004 N電子天平，上海精密科學(xué)儀器公司天平儀器廠；YD-12P型全自動生物組織脫水機，浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠；YD-6L型全自動生物組織冷凍包埋機，浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠；YD-B型智能型生物組織烤片機，浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠；LEICA RM2235型生物組織切片機，德國LEICA公司；DM-BA300數(shù)碼生物顯微鏡，廈門麥克奧迪公司。

2 方 法

2.1 小鼠急性毒性實驗 預(yù)實驗以連花柴芩可溶性粉藥液的粘滯度能勉強通過小鼠用12號灌胃針頭的濃度0.625 g·mL-1為最大給藥濃度，以小鼠單次最大灌胃容量20 mL·kg-1計算，灌胃2次，最高劑量組設(shè)為25.0 g·kg-1。24只小鼠，雌雄各半，隨機分4組，以最大給藥容積24 h內(nèi)分2次給藥，共給藥1 d，試驗期間小鼠健康活潑，無一死亡。

正式試驗取健康小鼠40只，雌雄各半，隨機分為4組，每組10只。以預(yù)實驗的最高劑量組25.0 g·kg-1，設(shè)為試驗高劑量組，按劑量等比級數(shù)1∶0.5，依次得到試驗中劑量組12.5 g·kg-1和試驗低劑量組6.25 g·kg-1，空白對照組灌服無菌蒸餾水，各組均按20 mL·kg-1單次灌胃容量，每天灌胃2次(間隔時間<3 h)，共給藥1 d，常規(guī)飼養(yǎng)2周，記錄各組小鼠的死亡情況，中毒情況，中毒發(fā)生時間，持續(xù)時間等，對死亡動物及時進行剖檢，記錄病變情況。

2.2 大鼠長期毒性試驗

2.2.1 動物的分組與給藥

2.2.1.1 動物分組 為保持體重測定方法和給藥時體重標準的一致性，根據(jù)檢疫期末日體重分組。選取雌雄各40只體重相近且符合試驗要求的大鼠，使用EXCEL軟件將大鼠按性別、體重隨機分為4組，即試驗高、中、低劑量組與空白對照組，每組20只，同時采用SPSS18.0軟件分析各組大鼠體重差異，保證試驗前各組大鼠體重無顯著差異。

2.2.1.2 劑量設(shè)計與給藥 小鼠急性毒性試驗結(jié)果顯示，供試品在小鼠的最大給藥劑量為25.0 g·kg-1。因此，本試驗高劑量按最大給藥劑量設(shè)定，3個劑量組分別為，高劑量組25.0 g·kg-1、中劑量組12.5 g·kg-1、低劑量組6.25 g·kg-1，并加設(shè)空白對照組。按20 mL·kg-1灌胃給藥，每日2次(間隔時間<3 h)，每周給藥7 d，連續(xù)30 d。在末次給藥后24 h處死所有動物，進行實驗室檢測和病理形態(tài)與組織學(xué)檢查。

2.2.2 試驗觀察

2.2.2.1 一般狀況觀察 試驗期間，每天觀察記錄試驗動物的大體反應(yīng)、活動狀況、毛色、糞便，記錄動物的異常表現(xiàn)及死亡情況。

2.2.2.2 體重測定 動物入室當日與給藥前各測定體重一次，給藥期均每周測定一次。其中，稱重當日稱重后給藥，解剖日提前測定體重。

2.2.2.3 攝食量測定 為保證攝食量測定的規(guī)范性和完整性，攝食量測定的日期規(guī)定在體重測定日期。(給予量-剩余量)/進食動物數(shù)/測定周期，即每天每只動物平均攝食量。

2.2.3 指標檢測 末次給藥24 h后，稱重，采血，血液用于血液學(xué)和血液生化指標測定，然后處死大鼠，迅速解剖，觀察主要臟器有無病變，并對大鼠主要臟器稱重并計算其臟器系數(shù)；病理解剖對心、肝、腎、脾、肺等肉眼觀察及組織病理學(xué)檢查。

2.2.3.1 血液學(xué)指標 測定前一日撤除飼料，禁食過夜。檢測日麻醉動物、解剖，由腹主動脈取血2 mL，加入EDTA-K2+常規(guī)管中。檢測血液學(xué)指標：紅細胞計數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、白細胞計數(shù)(WBC)、中性粒細胞(NEU)、淋巴細胞(LYM)、單核細胞(MONO)、嗜酸性粒細胞(EOS)、嗜堿性粒細胞(BASO)的分類計數(shù)。

2.2.3.2 血液生化指標的檢測 檢測指標：測定前一日撤取飼料，禁食過夜。檢測日麻醉動物、解剖，從腹主動脈取血約5 mL，分離血清。檢測血液生化指標：谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總蛋白(TP)、血糖(GLU)、總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、血清白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)和肌酐(CRE)。

2.2.3.3 組織病理學(xué)檢查 于試驗結(jié)束進行剖檢。剖檢試驗大鼠的同時，稱取大鼠體重及各主要臟器(包括心、肝、脾、肺、腎、腦、睪丸、卵巢子宮)重量，做好記錄，計算各臟器的相對重量(臟/體比值)。對高劑量組和對照組的心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、睪丸及卵巢進行組織病理學(xué)檢查。當判斷某個臟器由藥物引起病理變化時，追加檢測中、低劑量組相應(yīng)臟器的組織學(xué)變化。

2.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 體重測定、攝食量、臟器重、血液學(xué)檢測、血液生化學(xué)檢測的數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進行統(tǒng)計分析(One-way ANOVA法檢驗，組間用LSD法兩兩比較，檢驗水準α=0.05)；病理檢查根據(jù)鏡檢記錄進行分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 小鼠急性毒性試驗 試驗期間小鼠無死亡，精神狀態(tài)、運動、飲食欲無異常變化。

給藥當天除試驗高劑量組見個別小鼠活動減少，其余各組小鼠毛色光滑，糞便、攝食、活動均未見異常；自給藥后第2 d開始各組小鼠活動、體重增長、糞便等均未見異常，與空白對照組比較無明顯差異，且14 d內(nèi)無死亡及其他異常發(fā)生。各組處死后剖檢，試驗高、中、低劑量組各小鼠主要臟器 (心、肝、脾、胃、肺、腎等)經(jīng)觀察未見異常改變。

3.2 大鼠長期毒性試驗

3.2.1 一般癥狀 試驗期間，沒有發(fā)現(xiàn)明顯與受試物相關(guān)的動物異?；顒印Ｋ袆┝拷M動物的飲食、飲水、糞便等均正常。未發(fā)生因給予受試物作用引起大鼠瀕死和死亡的毒性反應(yīng)。

3.2.2 體重 大鼠連續(xù)灌胃給藥30 d，各試驗組雌、雄動物的體重及增值與空白對照組動物比較，均未見顯著性差異，結(jié)果見表1、表2。

表1 雌性大鼠體重測定表Tab 1 Body weight measurement of female rats

表2 雄性大鼠體重測定表Tab 2 Body weight measurement of male rats

3.2.3 攝食量 雌性動物給藥第3周和4周，試驗高劑量組與空白對照組相比有下降趨勢(P<0.05)；雄性動物給藥第2周，試驗高劑量組與空白對照組相比有下降趨勢(P<0.05)，其他各組各時段均未見顯著性差異，結(jié)果見表3、表4。

表3 雌性大鼠攝食量測定表Tab 3 Determination of food intake of female rats

表4 雄性大鼠攝食量測定表Table 4 Determination of food intake of male rats

3.2.4 血液學(xué) 雌性動物試驗高劑量組與空白對照組相比LYM有降低趨勢，MONO、BASO、EOS有增加趨勢(P<0.01或P<0.05)；試驗中劑量組與空白對照組相比LYM有降低趨勢，MONO、BASO有增加趨勢(P<0.01或P<0.05)；試驗低劑量組與空白對照組相比MONO、BASO有增加趨勢(P<0.01或P<0.05)。結(jié)果見表5。

表5 雌性大鼠血液學(xué)檢測表Tab 5 Hematology test table of female rats

雄性動物試驗高劑量組與空白對照組相比NEU有增加趨勢(P<0.05)；其他指標均未出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果表6。

表6 雄性大鼠血液學(xué)檢測表Tab 6 Hematology test of male rats

3.2.5 血液生化學(xué) 雌性動物試驗高劑量組與空白對照組比較ALB、GLU均有增加趨勢(P<0.01或P<0.05)；試驗中劑量組與空白對照組比較ALB、GLU均有增加趨勢(P<0.01)；試驗低劑量組與空白對照組比較CHO有降低趨勢(P<0.01)，BUN有增加趨勢(P<0.01)。結(jié)果見表7。

表7 雌性大鼠血液生化學(xué)檢測表Tab 7 Biochemical examination of blood of female rats

雄性動物試驗高劑量組與空白對照組比較ALT、GLU有降低趨勢(P<0.05)，ALB、BUN有增加趨勢(P<0.01)；試驗中劑量組與空白對照組比較GLU有降低趨勢(P<0.05)，試驗低劑量組與空白對照組比較GLU有降低趨勢(P<0.01)。其他指標均未出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果見表8。

表8 雄性大鼠血液生化學(xué)檢測表Tab 8 Biochemical examination of blood of male rats

3.2.6 臟器系數(shù) 大鼠連續(xù)給藥30 d，雌性動物試驗低劑量組的脾臟臟器系數(shù)較對照組有增加趨勢(P<0.05)。其他指標均未出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果見表9、表10。

表9 雌性大鼠絕對/相對臟器系數(shù)表Tab 9 Absolute / relative organ coefficient of female rats

表10 雄性大鼠絕對/相對臟器系數(shù)表Tab 10 Absolute/relative organ coefficient of male rats

3.2.7 病理解剖及組織病理學(xué) 給藥30 d，各組剖檢后肉眼觀察動物的心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、腦、睪丸、附睪、子宮、卵巢等，未見異常變化。對主要臟器肝、腎、脾、胃腸、睪丸及卵巢進行組織病理學(xué)檢查也未見與受試物毒性作用相關(guān)的組織病理學(xué)變化。組織病理學(xué)圖片見附圖(圖1-圖18)。

圖1 空白對照組大鼠：肝臟H&E 染色,40×Fig 1 Rats in blank control group:Liver H &Estaining,40×

圖2 試驗高劑量組大鼠：肝臟H&E 染色,40×Fig 2 Rats in the high dose group:Liver H &Estaining,40×

圖4 試驗高劑量組大鼠：心臟H&E 染色,40×Fig 4 Rats in the high dose group:heart H &Estaining,40×

圖5 空白對照組大鼠：脾臟H&E 染色,10×Fig 5 Rats in blank control group:spleen H &Estaining,10×

圖6 試驗高劑量組大鼠：脾臟H&E 染色,10×Fig 6 Rats in the high dose group:spleen H &Estaining,10×

圖7 空白對照組大鼠：肺臟H&E 染色,40×Fig 7 Rats in blank control group:lung H &Estaining,40×

圖8 試驗高劑量組大鼠：肺臟H&E 染色,40×Fig 8 Rats in the high dose group:lung H &Estaining,40×

圖9 空白對照組大鼠：腎臟H&E 染色,40×Fig 9 Rats in blank control group:kidney H &Estaining,40×

圖10 試驗高劑量組大鼠：腎臟 H&E 染色,40×Fig 10 Rats in the high dose group:kidney H &Estaining,40×

圖11 空白對照組大鼠：空腸H&E 染色,40×Fig 11 Rats in blank control group:jejunum H &Estaining,40 ×

圖12 試驗高劑量組大鼠：空腸H&E 染色,40×Fig 12 Rats in the high dose group:jejunum H &Estaining,40×

圖13 空白對照組大鼠：胃H&E 染色,40×Fig 13 Rats in the blank control group:stomach H &Estaining,40×

圖14 試驗高劑量組大鼠：胃H&E 染色,40×Fig 14 Rats in the high dose group:stomach H &Estaining,40×

圖15 空白對照組大鼠：卵巢H&E 染色,40×Fig 15 Rats in the blank control group:ovary H &Estaining,40×

圖16 試驗高劑量組大鼠：卵巢H&E 染色,40×Fig 16 Rats in the high dose group:ovary H &Estaining,40×

圖17 空白對照組大鼠：睪丸H&E 染色,40×Fig 17 Rats in the blank control group:testis H &Estaining,40×

圖18 試驗高劑量組大鼠：睪丸H&E 染色,40×Fig 18 Rats in the high dose group:testis H &Estaining,40×

4 討論與結(jié)論

4.1 小鼠急性毒性試驗 急性毒性試驗是對動物進行1次給藥或在24 h內(nèi)進行2 ～ 3次給藥，通過觀察動物的中毒癥狀及死亡情況等指標來判斷毒性反應(yīng)的性質(zhì)和程度，評價藥物的毒性大小的試驗。

急性毒性預(yù)實驗以連花柴芩可溶性粉藥液的粘滯度能勉強通過小鼠用12號灌胃針頭的濃度0.625 g·mL-1為最大給藥濃度，以小鼠單次最大灌胃容量20 mL·kg-1計算，灌胃2次，最高劑量組設(shè)為25.0 g·kg-1灌服給藥仍不引起小鼠死亡。因受小鼠給藥容積與藥物濃度的限制，無法測定LD50。因此，正式實驗條件下，連花柴芩可溶性粉以最大給藥濃度對小鼠灌胃給藥，給藥量達25.0 g·kg-1，小鼠全部存活，未出現(xiàn)明顯的急性毒性反應(yīng)，無法測出LD50，說明口服連花柴芩可溶性粉LD50>25.0 g·kg-1。按照毒理學(xué)急性毒性劑量分級表，口服LD50>5000 mg·kg-1時為實際無毒，綜上連花柴芩可溶性粉口服給藥具有較好的安全性。

4.2 大鼠長期毒性試驗 長期毒性試驗是通過臨床表現(xiàn)、血液學(xué)、血清生化、病理組織切片來考察灌胃藥物對大鼠持續(xù)給藥的毒性。在長期毒性實驗的攝食量檢查結(jié)果中，雖然在雌雄動物給藥組與對照組出現(xiàn)了統(tǒng)計學(xué)差異，但在體重及增重差異比較中，給藥組各階段體重與對照組相比未見顯著性差異，認為攝食量的變化沒有毒性評價意義；在血液學(xué)及血液生化學(xué)分析中顯示的多種統(tǒng)計學(xué)差異，是SD大鼠血液及血液生化學(xué)正常標準范圍內(nèi)的變化，因此同樣認為沒有臨床評價意義；在臟器指數(shù)檢測中，雌性動物藥組脾臟相對臟器系數(shù)較對照組有增加趨勢，但是并沒有呈濃度依賴性。在血液生化學(xué)及組織病理學(xué)檢測中未出現(xiàn)相關(guān)變化，并且沒有濃度依賴性及性別依賴性變化，因此認為此變化與受試物的毒性無相關(guān)聯(lián)系。

毛東有等[15]研究表明，連翹酯苷為連翹主要成分之一，對小鼠腹腔注射的急性毒性試驗的LD50為1976.5 mg·kg-1，95%可信限為1863.7～2096.1 mg·kg-1。根據(jù)化學(xué)物急性毒性(LD50)劑量分級表，連翹酯苷分級為低毒。朱江波等[16]研究表明，連翹酯苷不止對實驗動物本身，對胚胎、胎兒和致畸性也均無明顯毒性。由此可見，連翹酯苷為連翹的主要成分，連翹作為連花柴芩可溶性粉的主要成分，在以往的實驗中證實了其低毒安全的特性。佟繼銘等[17]研究了大鼠長期口服黃芩莖葉總黃酮產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及其嚴重程度，結(jié)果，大鼠用藥90 d時2.0 g·kg-1總黃酮組大鼠RBC高于羧甲基纖維素鈉對照組，停藥14 d恢復(fù)正常。其它組大鼠的各項指標均無異常改變，也未發(fā)現(xiàn)遲發(fā)性毒性反應(yīng)，說明黃芩莖葉總黃酮毒性較低。劉靜等[18]研究表明,長時間給予大鼠一定劑量的柴黃口服液，其一般指標、增重及飼料利用、臟器指數(shù)、血液學(xué)常規(guī)、血液生化學(xué)檢查及組織病理學(xué)等方面指標測定結(jié)果與對照組無顯著差異(P>0.05)。

試驗通過將連花柴芩可溶性粉對SD大鼠灌胃30 d重復(fù)給藥，觀察動物出現(xiàn)損害的靶組織或靶器官及劑量效應(yīng)關(guān)系，結(jié)果表明，所有檢測指標未出現(xiàn)因給予受試物而引起相關(guān)的毒性變化，且未發(fā)現(xiàn)連花柴芩可溶性粉的目標臟器。通過長期毒性試驗觀察、血液生理生化指標測定、剖檢和病理切片觀察，連花柴芩可溶性粉口服給藥無毒副作用劑量為25.0 g·kg-1·d-1，表明連花柴芩可溶性粉具有較好的安全性。

通過急性毒性，長期毒性研究，表明連花柴芩可溶性粉口服給藥不會對動物機體產(chǎn)生急、慢性毒副作用，具有較好的安全性，為其臨床應(yīng)用提供了參考依據(jù)。