新型非甾體抗炎藥物阿司匹林丁香酚酯的研究進展

賈希希，李劍勇

(中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所,農業(yè)農村部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室,甘肅省工程重點實驗室，甘肅 蘭州 730050)

炎癥是機體在生理或病理條件下應對內部或外部刺激所產(chǎn)生的綜合性指征，許多生理過程或疾病發(fā)生發(fā)展中都有炎癥的參與。目前為止，大量的抗炎癥藥物被開發(fā)并被用于臨床治療?？寡姿幵谂R床上根據(jù)其結構的不同可分為甾體類和非甾體類抗炎藥(Nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAID)。阿司匹林(Aspirin)是水楊酸鹽之后第一個被使用的非甾體抗炎藥[1]，其通過不可逆的阻斷環(huán)氧化酶(Cyclo-oxygenase，COX)，即前列腺素H合酶的活性來干擾機體合成環(huán)狀前列腺素-血栓素A2(Thromboxane A2,TXA2)，進而產(chǎn)生抗炎、抗血小板凝集、解熱和鎮(zhèn)痛的作用[2-3]。與此同時，阿司匹林也會導致具有正常保護作用的前列腺素功能改變，產(chǎn)生一些副作用，包括胃潰瘍、腎功能衰竭、血小板功能受損，導致出血并發(fā)癥等副作用[4]。

丁香酚(Eugenol)是一種萜烯類化合物，具有抗炎、解熱、抗真菌、抗氧化、抗腫瘤，麻醉和鎮(zhèn)痛活性等多種藥理活性，但是Eugenol在外界環(huán)境中所表現(xiàn)出的不穩(wěn)定性及不良氣味限制了其臨床應用[5-13]。

為了更好利用Aspirin和Eugenol的抗炎等藥理活性，并且降低二者產(chǎn)生的不良副作用，中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所研究人員利用藥物的結構拼合原理，合成了一種新型藥用化合物阿司匹林丁香酚酯(Aspirin eugenol ester,AEE)[14]，研究表明：AEE在保持Aspirin和Eugenol藥理活性的基礎上，屏蔽Aspirin的羧基，能降低Aspirin進入體內時對胃腸道的刺激等副作用，克服Eugenol的刺激性氣味和不穩(wěn)定性。目前已經(jīng)完成的AEE藥效學、毒理學、藥理學及藥代動力學的評價，研究結果表明其具備良好的成藥性。

1 AEE化學結構與理化性質

作為一種嵌合的非甾體類抗炎藥物，AEE是由Aspirin的羧基結構和Eugenol的酚羥基結合而成的，這使得AEE抗炎活性增強，藥物作用時間更加持久，本品為白色無味結晶狀固體，其結構如圖1所示。

圖1 AEE的結構式Fig 1 Structure of AEE

2 AEE毒理學研究

2.1 急性毒性 趙曉樂等人[15]的大鼠口服AEE急性毒性研究表明，AEE的半數(shù)致死量(LD50)為5.95 g/kg,其置信范圍是5.30～6.68 g/kg，大鼠分別灌服4.03、5.00、6.20、7.69、9.53 g/kg的AEE；2 h后，7.69和9.53 g/kg劑量組的大鼠精神萎靡，4 h后5.00和6.20 g/kg劑量組的一些大鼠出現(xiàn)了倦怠蜷縮、呼吸頻率加快，并且伴有食欲減退和飲水減少，20 h后6.20、7.69 g/kg和9.53 g/kg劑量組的大鼠出現(xiàn)了死亡的情況，48 h后4.03和5.00 g/kg劑量組的大鼠也發(fā)生了死亡的情況。大鼠灌服劑量為5.00 g/kg以上的AEE時，病理學分析體內各臟器組織，其中腎臟、肝臟和胃腸道等器官表現(xiàn)出明顯的病理損傷?？梢酝茢啵I臟、肝臟和胃腸道是AEE毒性作用的主要靶器官。

2.2 連續(xù)口服15 d毒性 大鼠灌胃給予劑量為50、1000和2000 mg/kg/d的AEE 15 d后，結果顯示50 mg/kg/d的AEE對受試大鼠無毒性,反復暴露于1000 mg/kg/d或2000 mg/kg/d的AEE后，在雄性和雌性大鼠中均觀察到血糖、天冬氨酸轉氨酶、堿性磷酸酶，丙氨酸轉氨酶和總膽紅素的水平發(fā)生了明顯變化，且成劑量依賴性[16]。李劍勇等人通過鼠傷寒沙門氏菌誘變試驗(Ames)和小鼠骨髓微核試驗的兩種標準遺傳毒性試驗評估了AEE的遺傳毒性。結果表明，AEE在體內或體外均無遺傳毒性[17]。

2.3 慢性毒性 趙曉樂等人將大鼠分為低(4.5 mg/kg/d)、中(18.0 mg/kg/d)、高(683.0 mg/kg/d)三個劑量組灌服AEE，與溶媒對照組各項指標進行比較。結果顯示，低劑量組的大鼠與溶媒對照組比較無明顯差異；中劑量組大鼠的極個別指標與溶媒對照組有明顯差異；高劑量組中的大鼠體重、臟器系數(shù)和血液指標與溶媒對照組有明顯的差異。AEE長期給藥的安全劑量大于18 mg/kg/d，肝臟和腎臟是AEE毒性作用的主要靶器官[18]。

2.4 生殖毒性[19]AEE的生殖毒性研究表明，親代大鼠灌服劑量為498 mg/kg/d的AEE時，雄性大鼠的生殖指標如睪丸和附睪系數(shù)相比于正常對照組較高，并且影響了胎鼠的生長和發(fā)育；在該條件下，AEE的灌服劑量為31.1 mg/kg/d時，可作為大鼠生殖毒性的最小無損害作用劑量；灌服劑量為124.5 mg/kg/d時，可作為大鼠生殖毒性的最大無損害作用劑量。

3 AEE代謝研究

3.1 體內外的代謝研究 沈友明等人[20]在體外采用犬肝微粒體代謝的研究方法，鑒定出AEE的5種主要代謝產(chǎn)物，分別為水楊酸(Salicylic acid，SA)和Eugenol及Eugenol的3種代謝物。犬的體內代謝研究表明，SA在尿液和血漿均以較高濃度存在。推測SA是AEE在犬體內的主要代謝產(chǎn)物，并可能是AEE的主要活性物質。水楊酸在體內分別發(fā)生Ⅰ相代謝生成了龍膽酸，Ⅱ相代謝生成了水楊酰甘氨酸、水楊酸酚基葡醛酸苷和水楊酸酰基葡醛酸酯。Eugenol在體內也分別發(fā)生了Ⅰ相代謝，生成了二氫丁香酚、3-(4-羥基-3-甲氧苯基)-丙烷-1,2-二醇、3-(4-羥基-3-甲氧苯基)-丙醇、異丁香酚、3-(4-羥基-3-甲氧苯基)-丙烯基-1,2-環(huán)氧乙烷、3-(4-羥基-3-甲氧苯基)-丙酸等代謝物，Ⅱ相代謝生成丁香酚磺酸鈉和丁香酚-β-D-葡萄糖苷酸。

大鼠體內的代謝質量平衡研究表明，AEE的各種代謝物主要通過尿液進行排泄，通過灌胃給予20 mg/kg的AEE，大鼠尿液中以Aspirin為母核結構的代謝產(chǎn)物平均回收率72.26%，以Eugenol為母核結構的代謝產(chǎn)物平均回收率為87.27%[21]。

3.2 藥代動力學研究 健康大鼠空腹灌服20 mg/kg的AEE，其藥代動力學研究結果顯示：AEE及其代謝物Aspirin在血漿中均無法檢出；另一代謝物Eugenol體內血藥濃度較低未達到定量限。表明了大鼠灌服給藥AEE后在體內代謝較為迅速，主要由SA和Eugenol在體內發(fā)揮其藥理活性[22]，其在大鼠體內的藥代動力學參數(shù)如表1。

表1 AEE口服給藥20 mg/kg后大鼠體內SA主要藥代動力學參數(shù)(n=12)Tab 1 The pharmacokinetic parameters of SA in rats after oral administration of AEE at 20 mg/kg(n=12)

健康比格犬口服20 mg/kg的AEE后，因為AEE在體內代謝迅速，其在血漿中濃度較低；在血漿中幾乎無法檢出Aspirin，能檢出濃度較低的Eugenol；SA在血漿中的濃度較高，有著較長的半衰期和較大的藥時曲線下面積，其藥代動力學參數(shù)[23]如表2。

表2 AEE口服給藥20 mg/kg后犬體內SA主要藥代動力學參數(shù) (n=6)Tab 2 The pharmacokinetic parameters of SA in dogs after oral administration of AEE at 20 mg/kg(n=6)

4 AEE高效解熱研究

葉得河等人[24]采用大鼠皮下注射10 mL/kg生理鹽水作為對照組；注射15%酵母混懸液10 mL/kg建立發(fā)熱模型，將其分為AEE(0.32、0.48、0.65 g/kg)、Aspirin(0.27 g/kg)和Eugenol(0.24 g/kg)三個口服給藥組及口服0.5% CMC-Na的發(fā)熱組。記錄口服給藥后2、4、6 h后的大鼠體溫，并于6 h后采集大鼠血液及腦組織，利用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定發(fā)熱大鼠腹中隔區(qū)和血漿中的精氨加壓素(AVP)，以及下丘腦中和血漿中的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的含量。結果顯示AEE給藥組的大鼠發(fā)熱狀況得到了明顯的緩解，并且體溫顯著降低，且降溫效果隨著劑量增加明顯增強。并且相較于等摩爾的Aspirin和Eugenol，其解熱速度更快，作用時間更持久。發(fā)熱組中下丘腦及血漿中cAMP的含量與腹中隔區(qū)、血漿中AVP含量較對照組高，與發(fā)熱組相比，給藥組腹中隔區(qū)中AVP含量明顯下降，而血漿中的AVP明顯升高，下丘腦中的cAMP的含量明顯降低，血漿中的cAMP含量變化不明顯。AEE的解熱作用機制可能是通過改變下丘腦中cAMP及腹中隔區(qū)、血漿中AVP含量而發(fā)揮作用。

5 AEE抗炎、抗血栓研究

馬寧等人[25]將健康大鼠分為AEE、Aspirin、Eugenol及Aspirin和Eugenol聯(lián)合給藥等4個給藥組，以羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)作為空白對照組。研究AEE對炎癥和血栓形成相關的5種蛋白的影響，包括環(huán)氧化酶1(COX-1)、環(huán)氧化酶2(COX-2)、C反應蛋白(C reactive protein,CRP)、凝血酶原(FII)和花生四烯酸5-脂氧合酶(Arachidonic acid 5-lipoxygenase,ALOX5)。健康大鼠灌胃給藥7 d后，采集血樣，利用ELISA測定蛋白質濃度。結果顯示，與CMC-Na組和Aspirin組相比，AEE組的關鍵內源性生物活性酶濃度明顯降低(P<0.01)。對5種蛋白質的藥效強度比較中，AEE組均強于Aspirin組和Eugenol組。從化學-蛋白質相互作用的角度看，AEE具有良好的抗炎、抗血栓作用，并且較Eugenol和Aspirin作用更強。申棟帥等人[26-28]對AEE的抗血栓藥理活性研究表明，AEE通過抑制TXA2的產(chǎn)生來抑制血小板的聚集，同時降低胞內鈣離子濃度，最終對細胞外信號調節(jié)激酶(ERK2)的活性產(chǎn)生抑制，繼而又抑制蛋白激酶/細胞沉默調節(jié)蛋白1(AMPK/Sirt 1)通路，導致CD40配體(CD40L)表達降低，從而抑制ATP釋放及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路和c-Jun氨基末端激酶(JNK1)磷酸化。

6 AEE抗動脈粥樣硬化研究

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是一個涉及多種細胞類型和細胞因子的一種主動脈慢性炎癥性疾病[29]，其主要的病理性變化是動脈部分脂質沉積并伴有平滑肌細胞和纖維基質增生，而后逐漸發(fā)展形成動脈粥樣硬化斑塊[30-33]，它是導致冠狀動脈疾病、外周動脈疾病和中風和疾病的重要原因[34]。鑒于大量動物實驗模型中的數(shù)據(jù)表明炎癥細胞在動脈粥樣硬化及其并發(fā)癥中所起的重要作用，使用抗炎藥物治療動脈粥樣硬化等心血管疾病可能是一個有吸引力的策略[35]。

6.1 AEE抗動脈粥樣硬化的代謝組學研究 馬寧等人[36-38]應用基于UPLC-Q-TOF/MS的研究方法，對高脂飲食(High-fat diet,HFD)誘導的金黃地鼠動脈粥樣硬化模型的血漿和尿液進行代謝組學評價，研究AEE抗動脈粥樣硬化的作用機制。同時觀察大鼠體重增長、血生化指標、動脈粥樣硬化指數(shù)(Atherosclerosis index,AI)及主動脈、胃、肝組織病理學變化。結果表明，AEE能顯著降低HFD誘導的金黃地鼠體重增加，減少肝細胞過多的脂肪堆積，使紊亂的血生化正常，改善主動脈病變以及顯著影響血漿和尿液的代謝狀況。HFD誘導的金黃地鼠模型給予AEE干預后，代謝組學研究表明，與甘油磷脂代謝、核黃素代謝、氨基酸代謝、能量代謝、泛酸和輔酶A生物合成等相關的整體代謝紊亂得到改善。

6.2 AEE預防血栓的研究 生物信息學分析及差異蛋白的生物學功能的探討，揭示了AEE對角叉菜膠誘導的大鼠尾部血栓的蛋白表達影響，表明AEE主要通過改善三羧酸循環(huán)(Tricarboxylic acid cycle,TCA)、檸檬酸代謝(Citrate metabolic process)等能量代謝過程來抑制血栓的形成和發(fā)展。AEE預防血栓的蛋白質組學結果顯示，其主要通過調節(jié)缺氧誘導因子(Hypoxia inducible factors,HIF-1)、促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase,MAPK)、以及Hippo等信號通路和抑制血小板激活、改善凝血級聯(lián)反應和補體等發(fā)揮了預防血栓形成的作用[39]。

6.3 AEE抗高脂血癥研究 Karam等人研究表明，大鼠連續(xù)6周灌服日劑量為54 mg/kg BW的AEE可顯著降低高脂飲食大鼠的總膽固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)和低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)的水平，減緩體重增加速度[40,41]

7 AEE抗血管內皮氧化研究

7.1 AEE抗血管內皮氧化損傷的藥效學研究 通過H2O2誘導人臍靜脈內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)建立了體外的HUVECs氧化損傷模型，及HFD飼喂大鼠誘導的動脈粥樣硬化模型。結果表明模型組與正常組相比，AEE對HUVECs氧化損傷模型和大鼠動脈粥樣硬化模型起到了干預作用，顯示出良好的抗血管內皮氧化損傷的藥理活性。

7.2 AEE對氧化損傷血管內皮細胞線粒體-溶酶體軸的調節(jié)研究 黃美州等人[42]將HUVECs分為AEE預孵育處理組和未處理組后分別給予H2O2。在AEE預先孵育的HUVECs中，顯示了H2O2誘導的丙二醛(MDA)水平降低,AEE預處理HUVECs可提高谷胱甘肽/氧化性谷胱甘肽(GSH/GSSG)比值及超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性，降低了H2O2對抗氧化系統(tǒng)的損傷。AEE能夠有效地降低H2O2誘導的溶酶體和線粒體功能損傷，從而使下降的線粒體膜電位得到提升，線粒體中的細胞色素C(Cytochrome C)釋放減少，細胞及線粒體內的活性氧(ROS)積累降低。AEE干預后，失衡的細胞抗凋亡和促凋亡機制得到了顯著改善。AEE預孵育組細胞內Bcl2表達量顯著高于H2O2處理組。過表達或抑制Bcl2的實驗結果表明：在AEE抗細胞氧化損傷中的調節(jié)機制中，Bcl2發(fā)揮著關鍵作用。

7.3 AEE對氧化損傷血管內皮細胞NO黏附分子表達的影響 黃美州等人[43]將HUVECs用H2O2處理后，顯著擾亂細胞內的一氧化氮(NO)調節(jié)系統(tǒng)，其主要包括較正常組細胞NO的產(chǎn)生量顯著提高，誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的表達及活性顯著升高，內皮型一氧化氮合酶(eNOS)的活性顯著下降。HUVECs在經(jīng)過H2O2處理后核因子E-2-相關因2(Nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)的表達顯著下調。H2O2誘導的HUVECs在經(jīng)AEE處理后，其NO調節(jié)系統(tǒng)失調的現(xiàn)象得到顯著改善。HUVECs的Nrf2通過基因干預手段過表達或抑制后，進一步驗證了Nrf2在AEE預防H2O2誘導的NO調節(jié)系統(tǒng)失調中的重要作用。氧化損傷血管內皮細胞上的相關黏附分子發(fā)生了顯著地變化，其中血管細胞黏附因子1(VCAM-1)和E-選擇素(E-selectin)在損傷的血管內皮細胞上的表達顯著地升高，而且體內和體外血管內皮氧化損傷模型由AEE干預后，損傷的血管內皮細胞上E-selectin的表達顯著下調。體外的細胞粘附試驗結果表明：AEE能夠有效地降低氧化損傷的HUVECs對巨噬細胞(THP-1)的黏附。

7.4 AEE對氧化損傷血管內皮細胞代謝組學的影響 黃美州等人[44]通過比較未處理的HUVECs與加入H2O2或AEE的HUVECs代謝產(chǎn)物水平的差異，通過相關生物學數(shù)據(jù)庫對三個處理組的HUVECs代謝物進行多元統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)了8種差異細胞代謝物。在細胞上清液中發(fā)現(xiàn)3種差異代謝物，分別涉及到細胞的氨基酸代謝、能量代謝、輔因子和維生素的代謝，它們在細胞的損傷修復調控、抗氧化和能量供應中發(fā)揮著重要作用。由此證明了AEE保護血管內皮細胞的作用，主要是通過增強抗氧化和血管修復能力來抑制巨噬細胞與內皮細胞的粘附來實現(xiàn)的。AEE對粘附分子的抑制作用與血管內皮細胞代謝的改善和血管內皮細胞氧化應激的降低有關。

8 展 望

AEE作為一種新型非甾體抗炎藥，已經(jīng)證實具有良好的抗炎、抗血栓、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、解熱和鎮(zhèn)痛等藥理活性。除了目前已經(jīng)揭示的AEE具有抗動脈粥樣硬化、抗血栓，抗血管內皮氧化等藥物作用機制外，其更多的藥理活性及相關作用機制如iNOS和Nrf2在AEE對血管內皮細胞氧化損傷保護作用中的相互關系，AEE對血管內皮氧化損傷的代謝組學研究中，其如何調控可能干預的代謝通路及抗氧化應激中線粒體和溶酶體的相互調控作用仍需進一步的研究和揭示。AEE已被初步證實具有抗高脂血癥的作用，但其如何起到抗高脂血癥的機制還有待進一步研究。AEE口服后在胃腸道的吸收和轉運機制也有待揭示。了解AEE在胃腸道內的吸收與轉運機制，有助于對AEE口服給藥的全面的認識，為AEE的臨床應用提供理論依據(jù)。