液相色譜-三重四極桿/線(xiàn)性離子阱復(fù)合質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)牛奶中莫昔克丁殘留

尹暉，王亦琳，葉妮，孫紅洋，孫雷，王鶴佳

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

莫昔克丁(Moxidectin)屬于米爾貝霉素類(lèi)抗生素，主要用于動(dòng)植物驅(qū)蟲(chóng)，具有廣譜高效的驅(qū)蟲(chóng)活性和安全性[1]，目前臨床上主要用于對(duì)牛[2-4]、羊[5-6]、豬、馬和犬[7-9]、貓[10]等寵物的寄生蟲(chóng)防治。莫昔克丁用藥量較少，對(duì)人畜和環(huán)境較為安全[11]，在動(dòng)物組織、脂肪和糞便中的主要?dú)埩粜问綖槟艨硕≡?。隨著莫昔克丁在獸醫(yī)臨床的廣泛應(yīng)用，隨之產(chǎn)生的獸藥殘留和耐藥性問(wèn)題日益受到關(guān)注[12]。歐盟、美國(guó)、日本規(guī)定莫西克丁在牛奶中的最大殘留限量(maximum residue limit,MRL)為40 μg/kg[13]，我國(guó)也規(guī)定了牛奶中莫昔克丁的MRL為40 μg/kg[14]。目前牛奶中莫昔克丁殘留檢測(cè)方法的報(bào)道較少[15-17]，其他動(dòng)物組織中的莫昔克丁殘留檢測(cè)方法多為液相色譜法[18-20]，我國(guó)也沒(méi)有牛奶中莫昔克丁殘留檢測(cè)方法的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，因此建立一個(gè)準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)方法，對(duì)動(dòng)物性食品中莫昔克丁殘留監(jiān)控具有重要參考意義。

三重四極桿/線(xiàn)性離子阱復(fù)合質(zhì)譜技術(shù)(QTRAP)在四極桿的高靈敏度基礎(chǔ)上，增加了線(xiàn)性離子阱增強(qiáng)子離子掃描的定性功能，可以同時(shí)得到用于定性定量的MRM譜圖和用于進(jìn)一步定性的EPI二級(jí)譜圖，大大提高了痕量藥物定性的準(zhǔn)確度[21]。本研究采用MRM-IDA-EPI模式，在檢測(cè)牛奶中莫昔克丁殘留時(shí)提供了殘留標(biāo)志物的EPI指紋圖，進(jìn)一步提高了定性的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 儀器和設(shè)備 Shimadzu 30A-QTRAP 6500液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，日本島津公司-美國(guó)AB SCIEX公司；XS105DU分析天平，Mettler Toledo公司；AE260電子天平，Mettler Toledo公司；Biofuge Strators高速冷凍離心機(jī)，賀利氏公司；SIR4渦旋混合器，IKA公司；氮吹儀，Jnc公司。

1.2 藥品和試劑 莫昔克丁，純度≥98.0%，購(gòu)自北京振翔科技有限公司；甲酸、乙腈為色譜純，均購(gòu)自MERCK公司；所用水為超純水。

1.3 對(duì)照溶液配制 精密稱(chēng)取莫昔克丁標(biāo)準(zhǔn)品適量，置于10 mL棕色量瓶中，用乙腈溶解并稀釋成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用乙腈稀釋成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，再用50%乙腈水溶液稀釋成100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱為BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)，流動(dòng)相A相為0.1%甲酸水溶液，B相為0.1%甲酸乙腈溶液，流動(dòng)相梯度洗脫條件見(jiàn)表1，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件Tab 1 Gradient elution conditions of mobile phase

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI+)，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)-信息依賴(lài)掃描-增強(qiáng)子離子掃描(MRM-IDA-EPI)方式采集，電噴霧電壓(IS)為5500 V，離子源溫度為550 ℃，氣簾氣(CUR)為25 psi，碰撞氣(CAD)為高等(High)，輔助氣(GS1)為50 psi，輔助氣(GS2)為50 psi；IDA參數(shù)：動(dòng)態(tài)背景扣除，從不排除之前的目標(biāo)離子，觸發(fā)閾值100 cps；EPI參數(shù)：掃描范圍為100～650m/z，掃描速度10000 Da/s，CE為35 eV，CES為15 eV。待測(cè)藥物定性定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)見(jiàn)表2。

表2 莫昔克丁定性定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)Tab 2 Qualitative ions,corresponding quota ions of Moxidectin and corresponding declustering potential(DP),collision energy(CE)

1.4.3 定性與定量 定性時(shí)試樣溶液中色譜峰的保留時(shí)間，應(yīng)與校正溶液的保留時(shí)間一致，容許偏差為±5%，試樣溶液中的離子豐度比應(yīng)與校正溶液的一致，容許偏差符合歐盟2002/657/EC決議要求。線(xiàn)性離子阱獲得增強(qiáng)離子掃描(EPI)譜圖，應(yīng)與校正溶液的EPI譜圖匹配。定量方法采用外標(biāo)法定量。

1.4.4 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制 精密量取莫昔克丁標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，用50%乙腈水溶液稀釋成濃度為1、2.5、5、10、20、40和80 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，從中各取1.0 mL，分別加入到空白牛奶試料經(jīng)提取、凈化和吹干后的殘余物中，充分溶解，過(guò)濾，過(guò)0.2 μm濾膜后，作為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)測(cè)定。按所得峰面積與相應(yīng)的對(duì)照溶液濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.4.5 樣品前處理過(guò)程 稱(chēng)取牛奶(2±0.02)g于50 mL離心管中，加乙腈6 mL，渦旋后中速水平振蕩5 min，10000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至另一50 mL離心管中，加水10 mL，混勻，備用，C18固相萃取柱依次用乙腈5 mL和洗滌溶液5 mL活化，取備用液9 mL過(guò)柱，用洗滌溶液5 mL淋洗，抽干，用乙腈5 mL洗脫，收集洗脫液于10 mL試管中，于50 ℃水浴氮?dú)獯蹈?。?0%乙腈水溶液1.0 mL溶解殘余物，充分溶解，過(guò)微孔濾膜后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.4.6 方法靈敏度確定 將適量莫昔克丁標(biāo)準(zhǔn)工作液加入到空白牛奶中，經(jīng)上述方法進(jìn)行前處理后，用UPLC-QTRAP檢測(cè)，觀察藥物特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比(S/N)和對(duì)應(yīng)藥物濃度，S/N>10者為方法的定量限。

1.4.7 準(zhǔn)確度和精密度的測(cè)定 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白牛奶試料中分別添加2、40、80 μg/kg三個(gè)不同濃度藥物進(jìn)行回收率試驗(yàn)，各濃度進(jìn)行5個(gè)樣品平行試驗(yàn)，重復(fù)3次，求批內(nèi)、批間RSD。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性分析 本研究使用MRM-IDA-EPI掃描模式，當(dāng)MRM通道采集的信號(hào)超過(guò)100 cps時(shí)觸發(fā)EPI增強(qiáng)離子掃描，在保留時(shí)間2.47 min左右獲得3個(gè)不同碰撞能量(20、35、50 eV)的EPI譜圖，得到更多子離子信息。將空白牛奶添加試樣和莫昔克丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的EPI譜圖進(jìn)行比對(duì)，得到10個(gè)匹配的子離子，表明本方法定性高度準(zhǔn)確。莫昔克丁基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白牛奶添加試樣的EPI譜圖見(jiàn)圖1-圖2。

圖1 莫昔克丁基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的EPI譜圖Fig 1 EPI(Enhanced Product Ion)of Moxidectin in matrix-matched standard solution

圖2 空白牛奶添加莫昔克丁試樣的EPI譜圖Fig 2 EPI(Enhanced Product Ion)of Moxidectin in milk spiked samples

2.2 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 按照上述系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到的回歸方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。從表中可以看出，牛奶中莫昔克丁在1～80 ng/mL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，R2大于0.990。

表3 牛奶中莫昔克丁基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Tab 3 Matrix-matched standard curve of Moxidectin in milk

2.3 方法靈敏度 按上述方法進(jìn)行處理，當(dāng)添加濃度為2 μg/kg時(shí)，測(cè)得莫昔克丁的S/N>10，說(shuō)明方法定量限為2 μg/kg。2 μg/kg空白牛奶添加試樣中莫昔克丁的特征離子質(zhì)量色譜圖見(jiàn)圖3。

1.莫昔克丁(640.4>498.2);2.莫昔克丁(640.4>528.2)1.Moxidectin(640.4>498.2);2.Moxidectin(640.4>528.2)圖3 空白牛奶添加試樣溶液中得到的特征離子質(zhì)量色譜圖(2 μg/kg)Fig 3 Qualitative ions of Moxidectin in milk(2 μg/kg)

2.4 方法精確度 在空白牛奶中添加低、中、高三個(gè)不同濃度的莫昔克丁進(jìn)行回收率試驗(yàn)，結(jié)果匯總見(jiàn)表4。可以看出，空白牛奶中莫昔克丁在2～80 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)的回收率為76.8%～115%，批內(nèi)、批間RSD均<15%。

表4 空白牛奶中莫昔克丁添加回收試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 Recoveries of Moxidectin in milk spiked samples

3 討論與結(jié)論

3.1 提取和凈化 本方法稱(chēng)取牛奶樣品2 g，加入3倍體積的乙腈6 mL進(jìn)行提取，然后通過(guò)高速離心去除蛋白質(zhì)等大量雜質(zhì)的干擾，有效地提取莫昔克丁藥物殘留。固相萃取法是常見(jiàn)的凈化方式，莫昔克丁可采用反相C8[15]或C18固相萃取柱凈化，經(jīng)過(guò)比較試驗(yàn)，本研究采用C18固相萃取柱凈化，可以有效吸附脂肪及其他雜質(zhì)，去除牛奶樣品中的大部分基質(zhì)干擾。在不影響回收率的情況下盡可能減少過(guò)柱體積，取一半備用液過(guò)柱，不僅能夠有效降低基質(zhì)效應(yīng)，還能節(jié)約過(guò)柱時(shí)間，為實(shí)際應(yīng)用中大批量樣品檢測(cè)提供了便捷。

3.2 定性分析 根據(jù)歐盟2002/657/EC要求，要確證莫昔克丁至少需要3個(gè)識(shí)別點(diǎn)(IP)，因此在大多數(shù)檢測(cè)方法中，采用MRM掃描模式，選定母離子及對(duì)應(yīng)的兩個(gè)響應(yīng)較強(qiáng)的子離子作為定性定量依據(jù)，母離子是1個(gè)IP點(diǎn)，兩個(gè)子離子分別是1.5個(gè)IP點(diǎn)，共4個(gè)IP點(diǎn)，足以達(dá)到檢測(cè)方法要求。本研究中，采用QTRAP質(zhì)譜儀特有的MRM-IDA-EPI掃描模式，當(dāng)MRM通道采集的信號(hào)超過(guò)100 cps時(shí)觸發(fā)EPI增強(qiáng)離子掃描，在保留時(shí)間左右獲得更多子離子的信息，得到莫昔克丁的特征性EPI譜圖，將空白牛奶添加試樣和莫昔克丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的EPI譜圖進(jìn)行比對(duì)后，得到母離子和10個(gè)匹配的子離子，共16個(gè)IP，極大地提高了定性的準(zhǔn)確度。

本方法利用液相色譜-三重四極桿/線(xiàn)性離子阱復(fù)合質(zhì)譜技術(shù)建立了牛奶中莫昔克丁的殘留檢測(cè)方法，定性、定量準(zhǔn)確，前處理方法簡(jiǎn)捷，由于EPI譜圖具有很強(qiáng)的特異性，極大提高了定性的準(zhǔn)確度，可以作為牛奶中莫昔克丁殘留檢測(cè)的確證方法，為動(dòng)物性食品中獸藥殘留監(jiān)控工作提供了重要的技術(shù)支持。