參術(shù)補(bǔ)鈣顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

趙建平，李艷玲，張春霞，王亞利，常鳳姣，李利紅

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，鄭州 450000)

缺鈣是動(dòng)物一種常見(jiàn)疾病，多發(fā)生在動(dòng)物的生長(zhǎng)階段和老年階段。嚴(yán)重影響了寵物和食品動(dòng)物的經(jīng)濟(jì)效益。缺鈣易導(dǎo)致寵物畸形和影響毛色的光澤度，也會(huì)影響食品動(dòng)物的肉的品質(zhì)。所以補(bǔ)鈣已經(jīng)成為畜牧業(yè)重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題。

動(dòng)物的補(bǔ)鈣產(chǎn)品雖然很多，但把中藥和補(bǔ)鈣相結(jié)合在一起的卻基本沒(méi)有。參術(shù)補(bǔ)鈣顆粒是中西藥復(fù)方制劑，由甘草、黨參、白術(shù)等五味中藥再加入維生素D3、碳酸鈣，以淀粉、蔗糖等輔料制備而成的，為淡黃色至棕黃色的顆粒，氣味微甜。在該產(chǎn)品中，中藥調(diào)理脾胃促進(jìn)食欲消化，西藥補(bǔ)鈣補(bǔ)充維生素D。其功效為益氣健脾、補(bǔ)充鈣質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)參術(shù)補(bǔ)鈣顆粒中甘草、白術(shù)、黨參三味藥進(jìn)行薄層鑒別來(lái)作為定性鑒別標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)對(duì)鈣和維生素D3用高效液相進(jìn)行含量測(cè)定來(lái)進(jìn)行定量控制，力求制定出能夠很好控制參術(shù)補(bǔ)鈣顆粒質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。

1 材 料

1.1 藥材 甘草、黨參、白術(shù)、山藥和茯苓均購(gòu)自北京同仁堂有限公司，經(jīng)鑒定甘草是豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)的干燥根和根莖；黨參是桔?？浦参稂h參(Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf.)的干燥根；白術(shù)是菊科植物黨參(Atractylodes macrocephala)的干燥根莖；山藥是薯蕷科植物薯蕷(Dioscorea opposita Thunb.) 的干燥根莖；茯苓是多孔菌科真菌茯苓(Poria cocos(Schw.)Wolf)的干燥菌核。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品 維生素D3(含量：不低于99%，批號(hào)：A06J9L65206,上海源葉生物)；碳酸鈣工作基準(zhǔn)試劑(含量：99.95%～100.05%)；甘草對(duì)照藥材(批號(hào)：161213-04，成都普思生物科技公司)；黨參對(duì)照藥材(批號(hào)：P23N9F75819，上海源葉生物)；白術(shù)對(duì)照藥材(批號(hào)：Z08A9B67489，上海源葉生物)；山藥對(duì)照藥材(批號(hào)：Y19A9H59254，上海源葉生物)；茯苓對(duì)照藥材(批號(hào)：P12J9F65406，上海源葉生物)

1.3 樣品 參術(shù)補(bǔ)鈣顆粒及陰性樣品均由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院制藥工程學(xué)院自制。

1.4 儀器 原子吸收分光光度計(jì)(型號(hào)WFX-120B,北京瑞利分析儀器有限公司)，Waters高效液相色譜儀(型號(hào)Alliance),電子天平(型號(hào)BSA224S,北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司).

1.5 試劑 正己烷(分析純)，甲醇(分析純)，鹽酸(分析純)，氧化鑭(分析純)。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層定性鑒別

2.1.1 甘草的薄層鑒別

2.1.1.1 供試品的制備 稱(chēng)取樣品5.00 g，加三氯甲烷40 mL，加熱回流1 h后過(guò)濾，藥渣揮盡三氯甲烷(沒(méi)刺激性氣味即可)，殘?jiān)蛹状?0 mL，加熱回流1 h后濾過(guò)，濾液蒸干用水30 mL溶解，用水飽和過(guò)的正丁醇振搖提取兩次，每次25 mL，正丁醇液蒸干，加甲醇0.5 mL溶解，作為供試品。

2.1.1.2 陰性對(duì)照的制備 取缺甘草的陰性樣品，同上述供試品的方法制備。

2.1.1.3 對(duì)照藥材的制備 同供試品的制備。

2.1.1.4 薄層鑒別 取上述樣品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以三氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇：水(15∶40∶22∶10)10 ℃以下放置的下層溶液作為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇，加熱5至10 min，置紫外365 nm下檢視(圖1)。

1、缺甘草陰性對(duì)照溶液；2-4二批、三批和四批供試品溶液；5、甘草對(duì)照藥材溶液1、Licorice deficiency negative control solution；2-4、Two,three and four batches of test solution；5、Glycyrrhiza reference solution圖1 甘草薄層鑒別色譜圖(紫外365 nm)Fig 1 TLC identification chromatogram of Glycyrrhiza uralensis Fisch

薄層鑒別結(jié)果顯示：在和甘草對(duì)照藥材相對(duì)應(yīng)的位置，樣品2、3、4均出現(xiàn)清晰斑點(diǎn)，并且甘草陰性對(duì)照溶液在該位置無(wú)斑點(diǎn)。因此該方法可以用來(lái)定性鑒別參術(shù)補(bǔ)鈣顆粒中的甘草。

2.1.2 黨參的薄層鑒別

2.1.2.1 供試品的制備 稱(chēng)取樣品5.00 g，加水30 mL、鹽酸3 mL，加熱回流1 h，放涼后濾過(guò)，濾液用二氯甲烷提取三次，每次20 mL，合并二氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為供試品溶液。

2.1.2.2 陰性樣品的制備 取缺黨參的陰性樣品，同供試品的方法制備。

2.1.2.3 對(duì)照藥材的制備 稱(chēng)取對(duì)照品0.50 g，加水10 mL、鹽酸1 mL，加熱回流1 h，放涼后濾過(guò)，濾液用三氯甲烷提取三次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)?.5 mL甲醇溶解，作為對(duì)照藥材溶液。

2.1.2.4 薄層鑒別 吸取上述溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸(20∶8∶0.5)為展開(kāi)劑中展開(kāi)，取出，晾干。噴10%硫酸乙醇，105 ℃加熱至樣點(diǎn)清晰顯現(xiàn)(圖2)。

1、黨參對(duì)照品溶液；2、缺黨參陰性對(duì)照溶液；3-5二批、三批和四批供試品溶液1、Dangshen reference solution；2、Negative control solution of Codonopsis pilosula；3-5、Two,three and four batches of test solution圖2 黨參薄層鑒別色譜圖譜Fig 2 TLC chromatogram of Codonopsis pilosula

薄層鑒別結(jié)果顯示：在和黨參對(duì)照藥材相對(duì)應(yīng)的位置，樣品2、3、4均出現(xiàn)清晰斑點(diǎn)，并且黨參陰性對(duì)照溶液在該位置無(wú)斑點(diǎn)。因此該方法可以用來(lái)定性鑒別參術(shù)補(bǔ)鈣顆粒中的黨參。

2.1.3 白術(shù)的薄層鑒別

2.1.3.1 供試品的制備 稱(chēng)取樣品3.00 g，加水飽和過(guò)的正丁醇40 mL,超聲30 min后過(guò)濾，濾液用水洗滌兩次，每次20 mL，棄去水液，蒸干，殘?jiān)? mL丙酮溶解。

2.1.3.2 陰性對(duì)照的制備 取缺白術(shù)的陰性樣品，同法制備陰性對(duì)照

2.1.3.3 對(duì)照品的制備 取白術(shù)的對(duì)照藥材，按照供試品的前處理方法制備。

2.1.3.4 薄層鑒別 吸取上述樣品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷：丙酮(19∶1)作為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。置紫外365 nm下檢視(圖3)。

1、缺白術(shù)陰性對(duì)照溶液；2-4二批、三批和四批供試品溶液；5、白術(shù)對(duì)照藥材溶液1、Negative control solution of Atractylodes macrocephala；2-4、Two,three and four batches of test solution；5、Atractylodes macrocephala reference solution圖3 白術(shù)薄層鑒別色譜圖譜(紫外365 nm)Fig 3 TLC chromatogram of Atractylodes macrocephala (UV 365 nm)

薄層鑒別結(jié)果顯示：在和白術(shù)對(duì)照藥材相對(duì)應(yīng)的位置，樣品2、3、4均出現(xiàn)清晰斑點(diǎn)，并且白術(shù)陰性對(duì)照溶液在該位置無(wú)斑點(diǎn)。因此該方法可以用來(lái)定性鑒別參術(shù)補(bǔ)鈣顆粒中的白術(shù)。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 鈣的含量測(cè)定

2.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱(chēng)取碳酸鈣基準(zhǔn)試劑60 mg于100 mL容量瓶，加10 mL水潤(rùn)濕，再用5 mL稀鹽酸溶解后加水至刻度，搖勻，從中精密量取25 mL于100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取1.0、1.5、2.0、2、3.0 mL分別置于25 mL量瓶中，各加鑭試液1 mL，加水至刻度后，搖勻，即得一系列不同濃度的對(duì)照品溶液。

2.2.1.2 供試品溶液和陰性對(duì)照溶液的制備 將參術(shù)補(bǔ)鈣顆粒粉碎，陰性對(duì)照品(參術(shù)補(bǔ)鈣顆粒缺鈣)研細(xì)，過(guò)60目篩，精密稱(chēng)定0.5 g或0.3 g置100 mL容量瓶中，加10 mL水潤(rùn)濕，再用5 mL稀鹽酸溶解，加水至刻度，搖勻，過(guò)濾，從續(xù)濾液中精密量取2 mL置于25 mL容量瓶中，加1 mL鑭試液，加水至刻度，搖勻，得供試品溶液和陰性對(duì)照溶液。

2.2.1.3 空白對(duì)照溶液的制備 于100 mL容量瓶中加10 mL水，再加5 mL稀鹽酸后加水至刻度，搖勻，從中精密量取2 mL置于25 mL容量瓶中，加鑭試液1 mL，加水至刻度，搖勻，即得。

2.2.1.4 測(cè)定法 用火焰原子吸收分光光度計(jì)按照原子吸收分光光度法第一法標(biāo)準(zhǔn)曲線法在422.7 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定，即得。

2.2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 由上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備得到6、9、12、15、18 μg/mL一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再加上空白對(duì)照溶液，用原子吸收分光光度法，每個(gè)濃度平行測(cè)定3次，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.0177x+0.1072，r=0.999836，鈣在0～18 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖4 鈣標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 4 Calcium standard curve

2.2.1.6 精密度的測(cè)定 取供試品溶液4的2號(hào)，連續(xù)測(cè)定6次，考察方法的精密度，RSD為2.75%。

2.2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批的參術(shù)補(bǔ)鈣顆粒6份，按供試品溶液的制備方法處理，測(cè)定樣品中鈣的含量，結(jié)果平均含量為11.79 mg/g，RSD為2.13%。

2.2.1.8 樣品中鈣含量的測(cè)定 分別取8個(gè)批次的參術(shù)補(bǔ)鈣顆粒，按照2.2.1.2項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品溶液，每個(gè)批次平行處理兩份。按照2.2.1.4項(xiàng)下測(cè)定方法分別測(cè)定可得樣品中鈣含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 鈣標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)Tab 1 Calcium standard curve data

根據(jù)測(cè)定結(jié)果，取8個(gè)批次平均含量的80%做為定量限，參術(shù)補(bǔ)鈣顆粒中所含鈣的含量定為8.76 mg/g。

2.2.2 維生素D3的含量測(cè)定

2.2.2.1 色譜條件 流動(dòng)相：甲醇∶水(98∶2)；色譜柱：WAT054275 C18柱；檢測(cè)波長(zhǎng)：264 nm。

2.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱(chēng)取VD3標(biāo)準(zhǔn)品5 mg于5 mL容量瓶中，加正己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，得C=1.0 mg/mL的VD3標(biāo)準(zhǔn)貯備液。從中精密量取1 mL置于蒸發(fā)皿中，使溶劑揮干，用甲醇溶解殘?jiān)D(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中并稀釋至刻度搖勻，得C=100 μg/mL的VD3標(biāo)準(zhǔn)工作液，從中精密量取1 mL置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得C=10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.2.2.3 原料藥溶液的制備 精密稱(chēng)取VD3原料藥1 g于具塞錐形瓶中，加25 mL正己烷，超聲提取30 min，過(guò)濾至25 mL容量瓶中，用正己烷補(bǔ)足至刻度，搖勻，從中精密量取1 mL至蒸發(fā)皿中揮干，用甲醇溶解殘?jiān)D(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中并稀釋至刻度，搖勻。

2.2.2.4 供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液的制備 稱(chēng)取陰性對(duì)照品(參術(shù)補(bǔ)鈣顆粒缺VD3)20 g，樣品50 g，分別置于具塞錐形瓶中，加正己烷150 mL，超聲提取30 min，過(guò)濾至蒸發(fā)皿中，濾液揮干后用甲醇溶解殘?jiān)D(zhuǎn)移至5 mL容量瓶并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2.5 測(cè)定法 分別吸取VD3標(biāo)準(zhǔn)品、原料藥、陰性對(duì)照品及供試品溶液，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾上機(jī)檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)品和原料藥進(jìn)樣10 μL，陰性及樣品進(jìn)樣20 μL，測(cè)定，記錄峰面積，即得。

圖5 維生素D3標(biāo)準(zhǔn)品Fig 5 Vitamin D3 standard

圖6 參術(shù)補(bǔ)鈣顆粒維生素D3陰性Figure 6 Vitamin D3 of Shenzhu Calcium Supplem Granule was negative

圖7 參術(shù)補(bǔ)鈣顆粒樣品中維生素D3Fig 7 Vitamin D3 in Shenzhu Calcium Supplem Granule

2.2.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取上述C=100 μg/mL的VD3標(biāo)準(zhǔn)工作液，依次稀釋得到50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，6個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣分別進(jìn)樣10 uL，每個(gè)平行進(jìn)兩針，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=36300x-9110，r=0.999997，維生素D3在3.125～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2.7 精密度的測(cè)定 取上述濃度為25 μg/mL對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，考察進(jìn)樣精密度，RSD為2.20%。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 稱(chēng)取同一批的參術(shù)補(bǔ)鈣顆粒樣品6份，按照供試品品溶液的制備方法處理，測(cè)定樣品中VD3的含量，結(jié)果平均含量為0.03067 μg/g，RSD為3.37%。

2.2.9 回收率的測(cè)定 稱(chēng)取同一批次已知含量的參術(shù)補(bǔ)鈣顆粒(粉碎過(guò)60目篩)6份，每份50 g，然后分別按樣品中維生素D3含量的大約80%、100%、120%的量加入維生素D3標(biāo)準(zhǔn)品，再按照供試品溶液的制備方法處理，進(jìn)樣20 μL，測(cè)峰面積。結(jié)果平均回收率為94.83%，RSD為2.77%。

表3 維生素D3回收率的測(cè)定Tab 3 Determination of recovery rate of vitamin D3

2.2.10 樣品中維生素D3的含量測(cè)定 分別稱(chēng)取8個(gè)不同批次的參術(shù)補(bǔ)鈣顆粒，按照2.2.4項(xiàng)下制備供試品溶液的方法來(lái)處理，每個(gè)批次平行處理兩份。按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，分別進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，并計(jì)算供試品中維生素D3含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同批次參術(shù)補(bǔ)鈣顆粒中鈣的含量Tab 2 Contents of calcium in different batches of Shenzhu Calcium Supplem Granule

表4 不同批次參術(shù)補(bǔ)鈣顆粒中維生素D3的含量Tab 4 Contents of vitamin D3 in different batches of Shenzhu Calcium Supplem Granule

根據(jù)測(cè)定結(jié)果，取8個(gè)批次平均含量的80%做為定量限，參術(shù)補(bǔ)鈣顆粒中所含維生素D3的含量定為0.0248 μg/g。

3 討論與結(jié)論

鈣的含量測(cè)定方法很多，傳統(tǒng)的EDTA絡(luò)合滴定法樣品用量大，前處理耗時(shí)長(zhǎng)，終點(diǎn)不易判斷，操作誤差大并且靈敏度不高；高錳酸鉀氧化還原滴定法得到的結(jié)果較準(zhǔn)確，終點(diǎn)變化很明顯便于觀察，但操作過(guò)程中需要進(jìn)行沉淀過(guò)濾，較為繁瑣[5]；還有離子色譜法、分光光度法?；鹧嬖游辗y(cè)定范圍寬[6]、操作簡(jiǎn)便、選擇性好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，所以實(shí)驗(yàn)中也選用了具有高靈敏度的火焰原子吸收法[7]。該方法操作簡(jiǎn)便，樣品無(wú)需經(jīng)過(guò)消化處理，能測(cè)出低含量的鈣且得到結(jié)果的重現(xiàn)性較好，可以用來(lái)檢驗(yàn)多批次的樣品[8]，可用于藥物中鈣的質(zhì)量控制。

雖然已有不少文獻(xiàn)中都采用HPLC法測(cè)定保健品以及制劑中維生素D3含量的方法[9-12]，但多用正相色譜檢測(cè)且樣品前期處理較為復(fù)雜。本課題建立了參術(shù)補(bǔ)鈣顆粒中維生素D3含量測(cè)定的反相高效液相色譜法，樣品制備方法簡(jiǎn)單，直接用溶劑超聲提取，免去了堿液皂化和反復(fù)提取的繁瑣過(guò)程，降低了樣品中維生素D3的損失。在檢測(cè)過(guò)程中采用95%的甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)峰的保留時(shí)間太長(zhǎng)；調(diào)整為純甲醇時(shí)，出峰時(shí)間提前但目標(biāo)峰與其前面的雜峰無(wú)法完全分離；采用98%的甲醇時(shí)，目標(biāo)峰可與雜峰完全分離，保留時(shí)間也比用95%甲醇時(shí)短。經(jīng)過(guò)方法學(xué)考察，精密度、重現(xiàn)性、回收率均良好，可用于參術(shù)補(bǔ)鈣顆粒中維生素D3的質(zhì)量控制。

該實(shí)驗(yàn)建立的參術(shù)補(bǔ)鈣顆粒中定性鑒別和定量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于參術(shù)補(bǔ)鈣顆粒的質(zhì)量控制。