阿苯達唑及其亞砜在鯽魚體內(nèi)的藥動學及殘留消除

奚照壽， 袁華根， 丁麗軍

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院，江蘇泰州 225300)

阿苯達唑(albendazole，簡稱ALB)為苯并咪唑類抗寄生蟲藥，廣泛用于畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖中體內(nèi)外寄生蟲的防治。因此，有關(guān)阿苯達唑在食品動物的藥動學研究也較多，但大多集中于家畜體內(nèi)，國內(nèi)外對于阿苯達唑在魚體內(nèi)的藥動學及殘留研究尚未見報道。由于缺乏應用阿苯達唑防治魚類寄生蟲病的藥動學數(shù)據(jù)與資料，目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應用阿苯達唑時，主要是參考該藥在畜禽上的應用經(jīng)驗。本研究擬研究口服給藥后，阿苯達唑及其亞砜在鯽魚體內(nèi)的藥動學，并通過多次給藥研究阿苯達唑在鯽魚肌肉中的殘留消除規(guī)律，以期為指導水產(chǎn)養(yǎng)殖中阿苯達唑的合理用藥及殘留監(jiān)控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

體質(zhì)量(150±20)g/尾鯽魚，購自某漁場。飼養(yǎng)于大小為2.2 m×1.9 m×0.8 m魚池中，使用經(jīng)曝氣的自來水，水深 0.3 m，每池30尾，每周投食3次。所有鯽魚試驗前預養(yǎng)2周，試驗期間不投食。

1.2 藥品與試劑

阿苯達唑?qū)φ掌?含量99.3%)、阿苯達唑原料藥(含量98.3%)，由常州亞邦齊暉醫(yī)藥化工有限公司提供；阿苯達唑亞砜對照品(含量99.5%)，由常州市亞邦獸藥有限公司提供。流動相用乙腈、甲醇為HPLC級，樣品前處理乙腈、甲醇、乙酸乙酯等有機試劑為分析純。

1.3 儀器及其他

SHMADZU高效液相色譜儀(日本島津公司)；ODS-2HYPERSIL不銹鋼色譜柱(Thermo ELECTRON CORPORATION)；C18保護柱[翡納米(天津)科技發(fā)展有限公司]。

1.4 動物給藥與采樣

1.4.1 口服給藥的藥動學 水溫設(shè)定為15～18 ℃，將60尾鯽魚，隨機分為12組，每組5尾。每尾灌服阿苯達唑 12 mg/kg?？诜o藥后12、20、26、34、36、38、44、48、60、72、96 h 采集尾靜脈血約1 mL，分離血漿，-20 ℃保存。

1.4.2 口服給藥的殘留消除 40尾鯽魚于水溫(20±1)℃下，隨機分為8組，根據(jù)體質(zhì)量按12 mg/kg的劑量灌服給予阿苯達唑溶液，每天1次，連續(xù)5 d。于最后一次給藥后0.5、1、2、4、8、12、24 d各剖殺1組，取肌肉樣品，置于-20 ℃保存。

1.5 測定血漿阿苯達唑及其亞砜濃度

1.5.1 血漿樣品預處理 取血漿樣品0.25 mL于EP管中，加1 mL乙酸乙酯沉淀蛋白，渦旋混合3 min后，3 500 r/min離心15 min，吸取上清液于50 mL雞心瓶中，65 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干，之后用0.5 mL流動相溶解，渦旋混合2 min，轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管，高速離心5 min(16 000 r/min)，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，供HPLC分析。

1.5.2 HPLC測定條件 流動相：體積比33 ∶67的乙腈-KH2PO4溶液(0.05 mol/L)；檢測器：紫外吸收檢測器；檢測波長：292 nm；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；紫外檢測器靈敏度：0.020 AUFS；進樣量：20 μL。在上述檢測條件下，在空白血漿樣品中添加系列濃度的阿苯達唑或其亞砜的標準工作液，經(jīng)預處理后分別測定血漿中阿苯達唑及其亞砜濃度，確定標準曲線及線性范圍、定量限(LOQ)與檢測限(LOD)、回收率、精密度。

1.6 測定組織中阿苯達唑及其亞砜的藥物濃度

1.6.1 組織樣品預處理 肌肉樣品剪碎后準確稱取2.5 g于50 mL離心管中，加入12 mL乙酸乙酯，渦旋混合3 min，勻漿2 min(15 000 r/min)，勻漿刀頭用12 mL乙酸乙酯清洗，且清洗液轉(zhuǎn)入勻漿液中，超聲提取10 min，3 500 r/min離心 10 min，將上清液轉(zhuǎn)入50 mL雞心瓶中，65 ℃蒸干。利用 2 mL 流動相溶解雞心瓶中的殘渣，渦旋2 min，轉(zhuǎn)入10 mL玻璃離心管中，再用3 mL正己烷清洗雞心瓶，合并清洗液于玻璃離心管，渦旋3 min，離心5 min(4 000 r/min)，棄去正己烷層，再加入3 mL正己烷渦旋混合，離心，棄去正己烷層。將底層液體轉(zhuǎn)入另一離心管中，16 000 r/min離心5 min，0.45 μm濾膜過濾，供HPLC分析。

1.6.2 HPLC測定條件 流動相：體積比3 ∶7的乙腈-KH2PO4溶液(0.05 mol/L，pH值3.5)；其余同“1.5.2”節(jié)。

1.7 數(shù)據(jù)分析處理

利用藥代動力學軟件3P97處理鯽魚口服給藥后的血漿藥物濃度-時間數(shù)據(jù)以及肌肉藥物濃度-時間數(shù)據(jù)，自動擬合最佳藥動學模型，推導藥動學參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 鯽魚血漿及肌肉組織中阿苯達唑藥物濃度的HPLC檢測方法

所建立的色譜條件下，能較好地將阿苯達唑、阿苯達唑亞砜與血漿或肌肉組織中其他基質(zhì)組分完全分離開。血漿中阿苯達唑及阿苯達唑亞砜出峰時間為21.10 min和4.00 min，峰形良好；肌肉中的保留時間分別為24.0 min和4.4 min，峰形對稱，峰寬較窄。

基質(zhì)加標標準曲線顯示，阿苯達唑在0.1～1.6 mg/L范圍內(nèi)，阿苯達唑亞砜在0.012 5～1.6 mg/L范圍內(nèi)，線性良好，相關(guān)系數(shù)大于0.999。

血漿中，阿苯達唑及其亞砜平均回收率介于82.93%～97.45%之間，變異系數(shù)分別為3.40%～3.70%和4.16%～4.53%，LOD分別為0.05、0.006 25 mg/L，LOQ分別為0.1、0.012 5 mg/L。肌肉組織中，阿苯達唑及其亞砜的回收率在82.39%～97.25%之間，變異系數(shù)分別為2.59%～5.26%、2.46%～4.36%，LOD分別為0.05、0.006 25 mg/kg，LOQ分別為0.1、0.012 5 mg/kg。

2.2 口服給藥的藥動學特征

鯽魚口服阿苯達唑(12 mg/kg)后，血藥濃度時間數(shù)據(jù)可用一級吸收一室開放模型擬合，血漿中阿苯達唑亞砜的藥動學參數(shù)見表1。

表1 鯽魚血漿中阿苯達唑亞砜的藥動學參數(shù)(單劑量口服阿苯達唑12 mg/kg)

2.3 口服給藥殘留消除結(jié)果

在(20±1)℃水溫下，鯽魚多劑量口服阿苯達唑(12 mg/kg)后，肌肉濃度-時間數(shù)據(jù)可用一級吸收一室開放模型擬合。肌肉中阿苯達唑亞砜的藥動學參數(shù)見表2。

表2 鯽魚多劑量口服阿苯達唑(12 mg/kg)后阿苯達唑亞砜的殘留參數(shù)

3 討論

3.1 檢測條件和樣品預處理方法的選擇

國內(nèi)外有關(guān)測定畜禽血漿中阿苯達唑及其代謝物的分析方法已有報道[1-4]。本試驗在已報道方法的基礎(chǔ)上優(yōu)化了血漿及肌肉樣品預處理方法。本試驗采用乙酸乙酯為提取液不但能夠?qū)悠分械牡鞍壮恋?，對待測組分的提取效果也較好，而且乙酸乙酯對于操作人員安全無毒，樣品只需提取1次，提取的上清液澄清，易蒸干，提取過程較沙先誼等[2]和邱銀生等[3]的方法簡單，靈敏度更高。HPLC結(jié)果顯示空白血漿樣品中雜峰少，干擾小，血漿中阿苯達唑亞砜保留時間與沙先誼等和邱銀生等的研究結(jié)果[2-3]基本一致，而阿苯達唑的保留時間與之相比則較晚，但藥物峰形好，拖尾因子小，可以滿足鯽魚血漿及肌肉組織中阿苯達唑和阿苯達唑亞砜藥物動力學及藥物殘留研究的要求。肌肉樣品預處理方法與Casetta等[5]和林海丹等[6]的相比，過程簡單，少量的乳化和不過小柱處理對出峰情況基本無影響，肌肉中阿苯達唑及其亞砜的回收率達到80%以上。肌肉中阿苯達唑及其亞砜檢測方法與邱銀生等和Fletouris等相比，空白樣品雜峰少、干擾小，阿苯達唑的保留時間較長，但峰形較好。在該條件下，肌肉中阿苯達唑及其亞砜的回收率、檢測限、定量限及日內(nèi)、日間變異系數(shù)均可滿足鯽魚肌肉中阿苯達唑及其亞砜殘留分析的要求。

3.2 鯽魚口服給藥的藥動學特征

阿苯達唑在動物體內(nèi)代謝迅速，極少以原形藥物存在，主要代謝為阿苯達唑亞砜和阿苯達唑砜[7]。水溫條件為15～18 ℃時，鯽魚口服(12 mg/kg體質(zhì)量)阿苯達唑后，血漿中阿苯達唑亞砜的藥物濃度-時間變化規(guī)律符合一級吸收一室開放模型，藥物吸收緩慢，藥物濃度低，代謝物消除亦較慢，表觀分布容積較小。與豬或羊單劑量內(nèi)服阿苯達唑后的藥動學參數(shù)相比[1]，在本試驗條件下，阿苯達唑亞砜在鯽魚的達峰時間比較長，消除半衰期為11.9 h，長于阿苯達唑亞砜在豬體內(nèi)的半衰期，但比在羊體內(nèi)的短。

3.3 殘留消除特點與休藥期

在(20±1) ℃水溫下，鯽魚以12 mg/kg體質(zhì)量的給藥劑量多劑量口服阿苯達唑，停藥后0.5～4 d內(nèi)阿苯達唑亞砜代謝物的生成速率大于消除速率，肌肉中的藥物濃度處于上升趨勢，4 d時達到峰濃度0.787 mg/kg，之后開始下降，8 d時下降到0.064 mg/kg，24 d時藥物濃度低于檢測限。阿苯達唑在鯽魚口服給藥的殘留消除特征是，消除速率常數(shù)Ke為0.359 h-1，消除半衰期為1.971 d，停藥后24 d，藥物濃度低于檢測限。

魚類動物的體溫會隨著水溫的變化而變化，其采食量、新陳代謝也會隨著水溫的變化而改變，鯽魚最適合的生長溫度在20～28 ℃之間，在非適性溫度條件下，其代謝強度明顯下降，進而影響消除速率[8]。據(jù)統(tǒng)計，在最適生長溫度范圍內(nèi)魚的體溫每增加1 ℃，藥物在魚體內(nèi)的代謝速率就增加10%[9]。藥物在魚體內(nèi)的消除速度隨水溫的降低而減慢，即藥物的半衰期會隨著水溫的降低而延長[10]。

我國規(guī)定阿苯達唑在魚組織中的休藥期為500 ℃·d，本研究在(20±1) ℃水溫條件下，鯽魚多劑量口服給藥阿苯達唑(12 mg/kg體質(zhì)量)，連續(xù)用藥5 d，停藥后24 d阿苯達唑亞砜低于最低殘留限量標準，結(jié)果與我國的休藥期相符合。但是對于其他種類的魚來說，還需要試驗進一步驗證。

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