前列腺素受體4 與腎臟疾病相關(guān)性研究進展

熊夢瑤 賈英麗 楊寶學

天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室，北京大學基礎(chǔ)醫(yī)學院藥理學系，北京，100191，中國

前列腺素受體4（prostaglandin receptor 4，EP4）是細胞表面七次跨膜受體的亞家族，屬G-蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor，GPCR）的一種，是內(nèi)源性脂質(zhì)介質(zhì)前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的特異性受體之一。前列腺素E（prostaglandin E，PGE）是腎臟中合成最豐富的前列腺素，在腎功能中發(fā)揮重要作用。PGE 調(diào)節(jié)腎血流動力學、水鈉代謝、血壓等，但同時作為一種眾所周知的促炎脂質(zhì)介質(zhì)，PGE 在許多病理生理條件下介導腎臟損傷的發(fā)生［1］。在所有的前列腺素類物質(zhì)中，前列腺素E2 是一種內(nèi)源性脂質(zhì)介質(zhì)，在機體內(nèi)分布非常廣泛。PGE2 通過激活前列腺素E受體4 種亞型發(fā)揮其不同的作用。4 種受體亞型分別被命名為EP1、EP2、EP3 和EP4［2-3］。在這些亞型中，EP4 分布最廣泛，幾乎存在于所有組織。在腎臟，EP4較EP1、EP2 有更多表達，分布在腎小球旁顆粒細胞、腎小球上皮細胞、遠曲小管和皮質(zhì)集合管上皮細胞。EP4通過偶聯(lián)興奮性信號Gs 蛋白及抑制性信號Gi 蛋白，調(diào)節(jié)下游多種信號通路，參與各種生理及病理生理過程，與癌變、心肌肥大、血管擴張、血管重構(gòu)、骨重構(gòu)、胃腸穩(wěn)態(tài)、腎功能和女性生殖功能密切相關(guān)［4-6］。目前通過腎組織特異性EP4 敲除小鼠模型的研究和選擇性EP4 激動劑/拮抗劑作用的研究，證明該受體可對腎臟產(chǎn)生重要影響，與多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本文就PGE2-EP4 信號通路在腎功能調(diào)節(jié)及一些腎臟疾病的相關(guān)研究進展進行概述。

1 EP4 的結(jié)構(gòu)及其在腎臟分布

1.1 EP4 的分子結(jié)構(gòu)

EP4 是一種G 蛋白偶聯(lián)受體，N 末端位于細胞外，C 末端位于細胞內(nèi)，中段形成七個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)、三個細胞外環(huán)和三個細胞內(nèi)環(huán)，其中胞漿面的第三個環(huán)與激活型G 蛋白（Gs）偶聯(lián)，胞外第2 環(huán)的N-糖基化位點為配體結(jié)合的重要位置［7］，而EP4 與Gi、β-arrestin蛋白偶聯(lián)的部位尚未有實驗探究。人和小鼠EP4 分別由488 個和513 個氨基酸殘基組成，大鼠的EP4 同人源長度相同，其中EP4 的細胞內(nèi)C 末端在所有的PGE2受體中是最長的［3，8］。在前列腺素受體家族中，位于第二個胞外環(huán)（extracellular loop 2，ECL2）中間的WCF序列（Trp169、Cys170 和Phe171）高度保守［9］。

2019 年，Yosuke Toyoda 等人解析了分辨率較高的人EP4-Fab001 與抑制性配體復合物的晶體結(jié)構(gòu)，揭示抑制劑配體ONO-AE3-208 競爭性結(jié)合EP4 的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，通過與Arg316、Tyr80、Thr76 形成氫鍵，并與保守殘基Thr168、Trp169 和Leu312 以及與不保守殘基Pro24、Val72、Leu99、Ile315、Ser319 和Val320 形成范德華力相互作用，該項結(jié)構(gòu)研究為受體失活的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和識別受體胞外表面抗體的變構(gòu)調(diào)節(jié)提供了新的見解［10］。

1.2 EP4 在腎臟的表達與分布

EP4 在人、鼠、犬、兔等物種中均有表達。小鼠組織的Northern blot 分析結(jié)果顯示，在四種EP 中，EP3 和EP4 的mRNAs 幾乎在所有被檢測的組織中均有表達。在組織內(nèi)，每個EP 亞型都顯示出不同的細胞定位，例如在腎臟，EP3 在腎小管上皮、升支粗段和皮質(zhì)集合管表達，EP1 在乳頭集合管表達，而EP4 在腎小球高度表達［3］。在對大鼠EP4 的研究中，其在腎小球旁顆粒細胞、腎小球上皮細胞、遠曲小管、皮質(zhì)集合管和發(fā)育中的腎小管上皮細胞均有高度表達［11-13］。在人的腎組織，EP4 分布在腎小球和動脈中膜，且從外髓向內(nèi)髓表達逐漸下降［14］。對犬EP4 的開放閱讀框架序列進行分析，結(jié)果表明，在核苷酸水平上其與人源EP4 編碼區(qū)的同源性為89%，蛋白水平上序列同源性為90%。Northern印跡結(jié)果顯示EP4 在犬的心、肺和腎中的表達水平相對較高［15］。同樣，EPs 在兔中的表達分布與人極為相近［16］。EPs 在腎臟的分布模式似乎與PGE2 介導的離子轉(zhuǎn)運、水重吸收和腎小球濾過的調(diào)節(jié)有關(guān)。EP4 在人體腎臟的特異性高表達提示我們可能與很多相應(yīng)的疾病發(fā)生機制有很大關(guān)系。

2 EP4 的配體及信號傳導

2.1 EP4 的選擇性配體

PGE2 和各種亞型的EP 受體結(jié)合的Kd 值一般在1～40 nmol·L-1之間。目前通過培養(yǎng)穩(wěn)定表達各型受體的細胞系的方法已經(jīng)篩選或開發(fā)出了針對各型前列腺素受體的高親和力配體，EP4 特異的激動劑和拮抗劑分別是ONO-AE1-329、L-902688［17-19］和ONO-AE3-208［20-22］。關(guān)于配體與腎臟中EP4 作用的研究目前較少，其中發(fā)現(xiàn)EP4 激動劑CP-044，519-02 對氯化汞誘導的大鼠急性腎功能衰竭及慢性腎衰竭模型均有保護作用［23］。TCS2510 是EP2 和EP4 的共同激動劑，實驗發(fā)現(xiàn)其通過增加PC-1 缺陷細胞內(nèi)cAMP 濃度和活性β-catenin的豐度，從而介導常染色體顯性多囊腎?。╝utosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD）囊泡上皮細胞增殖和氯化物分泌［24］。Leduc 等人在生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（bioluminescence resonance energy transfer，BRET）實驗中系統(tǒng)比較Gαs、Gαi 和β-arrestin信號通路的激活，首次揭示了不同配體與天然配體PGE2 之間的特征性差異。如PGE2 激活Gαs 通路的效率是Gαi 的十倍，而其他配體，如L-902688 和PGE1-OH，則偏向于激活Gαi 和β-arrestin［25］。故尋找能選擇性激活或抑制腎臟EP4 的偏向性配體，引起有利的腎臟生理功能改變，具有很重要的臨床意義。

2.2 EP4 信號傳導

EP4 主要是與激活型G 蛋白（Gs）偶聯(lián)，在內(nèi)源性配體PGE2 的刺激下，誘導細胞中環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）水平升高，cAMP 水平升高后激活蛋白激酶A（protein kinase A，PKA），PKA 使得下游蛋白磷酸化，其中多數(shù)是被稱為cAMP效應(yīng)元件結(jié)合因子（cAMP response element binding protein，CREBP）的核轉(zhuǎn)錄因子。PGE2-EP4 信號通路還可激活Epac 和AMPK，它們可能具有協(xié)同或交替作用，介導EP4 的Gαs 依賴性效應(yīng)。EP4 同時還能與抑制型G 蛋白（Gi）偶聯(lián)，當PGE2 刺激后，Gi 抑制腺苷酸環(huán)化酶活性，導致cAMP 水平下降［26-27］，并依賴磷酸激酶3（phosphatidy linositol 3-kinase，PI3K）途徑激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERKs）1 和2，從而誘導早期生長反應(yīng)因子-1（EGR-1）的表達［28-29］。同時也有研究顯示COX-1/PGE/EP4 通路可以上調(diào)β-arrestin1 介導的AKT 信號通路［30］。三條不同的信號通路激活取決于配體偏向性及EP4 的組織分布，相應(yīng)地，也影響腎臟發(fā)揮不同的生物學功能。

3 EP4 與腎臟生理及病理生理功能的關(guān)系

在腎臟中，PGE2-EP4 信號通路與調(diào)節(jié)血管張力、細胞增殖、炎癥、氧化應(yīng)激、纖維化改變及其他蛋白調(diào)控密切相關(guān)，從而與腎臟的生物學功能密切相關(guān)。

3.1 腎臟發(fā)育

非甾體抗炎藥作用于花生四烯酸環(huán)氧化酶，在臨床使用的同時可引起腎臟嚴重發(fā)育缺陷，如腎小球、腎小管的分化不全，也是該藥物臨床使用中常見的不良反應(yīng)［31-32］。有研究觀察到EP4 而不是其他EP 受體缺陷小鼠的腎小球體積明顯縮小，由此證明PGE2 及EP4在腎臟發(fā)育中發(fā)揮重要作用［33］。體外實驗中觀察過表達COX-2 的大鼠腎小管上皮細胞，發(fā)現(xiàn)PGE2 生成增加、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶激活、細胞的凋亡減少和增殖增加，這些改變可以被EP4 拮抗劑L-161982 逆轉(zhuǎn)；同時小管上皮細胞EP4 表達增加［34］。也有研究發(fā)現(xiàn)COX2-PGE2-EP4 的過表達對體外無血清培養(yǎng)的內(nèi)臟腎小球上皮細胞（glomerular epithelial cell，GEC）和腎小管上皮細胞（renal tubular epithelial cell）起到保護作用，由此提示EP4 對維持腎小球通透性和腎臟結(jié)構(gòu)完整性至關(guān)重要。

3.2 腎血管性高血壓

腎血管性高血壓主要是由于腎動脈狹窄引起腎臟的血流減少，繼而激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，通過血管收縮、水鈉潴留、氧化應(yīng)激等多種機制引起，可導致心功能不全的發(fā)生，嚴重時還將導致腎功能衰竭［35］。

環(huán)氧合酶（cyclooxygenase，COX）衍生的前列腺素在維持腎功能、體液平衡和血壓方面起著重要作用［36］。微粒體PGE 合酶（microsomal PGE synthase，mPGES）也可通過調(diào)節(jié)血管張力、鈉平衡和腎素釋放而在調(diào)節(jié)血壓方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。在嚙齒動物中，mPGES-1 的缺失已被證明在幾種高血壓模型中血壓進一步升高［37-38］。在PGE 的受體中，EP1 和EP3 增加細胞內(nèi)Ca2+［39］，可能引起血管平滑肌收縮。相比之下，EP2 和EP4 與Gs結(jié)合，Gs 通過激活腺苷酸環(huán)化酶而發(fā)出信號，引起細胞內(nèi)cAMP 增加，從而導致平滑肌松弛和血管舒張［40］。PGE2 主要作用于腎小球前動脈，實驗結(jié)果顯示將少量PGE2 直接注入腎動脈可引起體內(nèi)血管舒張，并可有效地減輕激素誘導的血管收縮［41］。同時，PGE2 可以緩沖ANG Ⅱ誘導的離體腎小動脈收縮和ANG Ⅱ誘導的離體腎前血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）胞漿鈣的增加。實驗證明，PGE2 通過激活EP2 或EP4 誘導腎臟血管舒張，但取決于所應(yīng)用的模型、PGE2 濃度和實驗方法，例如當小鼠EP4 缺乏時，失去低濃度PGE2 誘導的血管舒張作用，而在高濃度的PGE2 下，EP1 介導的血管收縮作用增強［42-44］。其中EP4 介導PGE2 對血管的舒張是由cAMP 依賴的超極化和抑制Ca2+電流介導的，繼而也可抑制腎素結(jié)合顆粒胞吐。前列腺素誘導腎素的釋放主要通過EP2和EP4 介導，兩者的生物學特性具有很大相似性，而在人的腎組織中，EP4 較EP2 在腎小球的分布更為廣泛，故選擇性靶向EP4 可能是治療腎血管性高血壓的潛在靶點。

3.3 急性腎損傷

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）的發(fā)病率為20/百萬～200/百萬，其中住院的成年病人發(fā)病率約為1/5 并呈逐年上升趨勢，死亡率約為23%［45］。急性腎損傷預后不良將大大增加慢性腎臟疾病及終末期腎臟疾病的發(fā)生率，增加病人的死亡率。因此，深入研究急性腎損傷發(fā)病機制，探究其干預靶點是當務(wù)之急［45-46］。

3.3.1 腎臟缺血再灌注損傷

缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI））是臨床常見的病理現(xiàn)象，表現(xiàn)為短暫的缺血發(fā)生后血液突然回流至相應(yīng)器官［47］。腎臟I/R 損傷是體外循環(huán)手術(shù)、創(chuàng)傷或腎移植后AKI 的主要原因，是一種具有快速腎功能障礙和高死亡率的臨床綜合征［48-49］。RIRI 機制復雜，目前認為主要涉及氧自由基和活性氧（reactive oxygen species，ROS）的大量產(chǎn)生、中性粒細胞活化浸潤、炎性損傷、細胞凋亡以及微循環(huán)障礙等過程，而啟動這些環(huán)節(jié)的關(guān)鍵是細胞能量代謝障礙［50-51］。

COX-2 是調(diào)控體內(nèi)PGE2 生成的重要限速酶，已有研究證明COX-2 和EP4 在RIRI 中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［52］。Puxun Tian 等人在大鼠缺血/再灌注前給予EP4 激動劑治療，結(jié)果表明，激動劑治療后可改善因損傷導致的線粒體質(zhì)量降低，增加線粒體DNA 拷貝數(shù)和ATP 生成，并抑制線粒體過度自噬［53］。最近有研究證明，當缺血再灌注（ischemia/ reperfusion，I/R）后近端腎小管細胞陰離子轉(zhuǎn)運體Oat1 和Oat3 表達受損，對基底外側(cè)有機陰離子的攝取減少，從而導致嚴重的腎損傷。Sauvant C 等人將hOAT1（SLC22A6）和hOAT3（SCL22A8）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK 細胞，在模型再灌注開始時應(yīng)用EP4 激動劑（TCS2510）或拮抗劑（L161 982）進行觀察。結(jié)果表明，COX1 代謝物通過EP4 介導了有機陰離子轉(zhuǎn)運體的下調(diào)，在腎臟I/R 損傷中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［54］。目前關(guān)于EP4 對腎臟I/R 損傷的影響機制只是集中在以上兩點。

像EP4 激動劑通過降低炎癥發(fā)生，降低活性氧水平等通路對視網(wǎng)膜［55］、心臟［56］、肝臟［57］I/R 損傷發(fā)揮保護作用，目前還沒有在腎臟得以驗證。研究表明不同藥物通過不同作用機制對I/R 的治療效果不同。有研究顯示吲哚美辛可通過減少細胞壞死和凋亡、PGE2 的釋放、I/R 誘導蛋白的產(chǎn)生和去分化、一氧化氮合酶的誘導及促進基底外側(cè)有機陰離子轉(zhuǎn)運等機制，在體外近端腎小管模型中糾正與I/R 相關(guān)的指標改變，PGE2 釋放減少與上述EP4 激動劑的研究相反，推測此保護機制可能有其他COX 產(chǎn)物參與［58］。綜上，可以想到促進PGE2-EP4 信號的傳遞會起到很好的腎臟保護作用，這也是未來靶向EP4 激動劑的研究熱點。

3.3.2 其他急性腎損傷

在氯化汞誘導的急性腎功能衰竭大鼠模型中給予EP4 激動劑CP-044，519-02，血肌酐水平顯著降低，近端腎小管壞死較少，凋亡細胞較少，大鼠的存活率提高，此時EP4 的表達未受影響［23］，而EP2 和EP2/4 受體激動劑對血生化指標及急性腎衰竭大鼠的生存均無影響。

人腎小管上皮細胞（HK-2）經(jīng)偏骨化醇預處理1h后，加入脂多糖誘導腎小管細胞損傷，用AH-23848 或EP4 小干擾核糖核糖核酸（siRNA）研究偏骨化醇預處理對EP4 阻斷的影響。結(jié)果顯示與單純暴露于LPS的HK-2 細胞相比，經(jīng)偏骨化醇處理后，HK-2 細胞中COX-2、PGE2 和EP4 的表達明顯增加。在AH-23848或EP4siRNA 的共同處理下將失去這些細胞保護作用，實驗結(jié)果也表明EP4 通過AKT 和NF-κB 信號轉(zhuǎn)導發(fā)揮抗炎和抗凋亡作用［59］。在腎缺血再灌注損傷模型中，偏骨化醇抗氧化、抗炎和抗凋亡的作用也在EP4 拮抗劑的作用下被抵消［60］。

內(nèi)毒素通過介導動脈血管舒張使膿毒癥患者易患AKI，導致腎小球濾過分數(shù)和腎小球濾過率顯著下降，這是膿毒癥常見嚴重的并發(fā)癥［61］。其中COX-2-mPGES-1 通路是內(nèi)毒素血癥反應(yīng)中PGE2 形成的重要機制，引起血流動力學和炎癥的改變。在高濃度的PGE2 刺激下，由于腎EP2 或EP4 增加和/或腎EP1 和EP3 受體下調(diào)而導致腎血管舒張，使得癥狀加重。

由此可見，EP4 對AKI 腎臟結(jié)構(gòu)和功能的預防和恢復至關(guān)重要，通過靶向EP4，使用特殊的激動劑或抑制劑會在一定程度上減輕藥物或毒性代謝物引起的嚴重腎損傷。

3.4 腎源性尿崩癥

腎源性尿崩癥（nephrogenic diabetes insipidus，NDI）是一種X 連鎖性隱性遺傳疾病，由精氨酸加壓素V2 受體基因失活突變導致的腎臟尿濃縮功能喪失所致的嚴重腎臟疾?。?2-63］。盡管抗利尿激素（antidiuretic hormone，ADH）正常或精氨酸加壓素（arginine vasopressin，AVP）增加，但腎小管對其缺乏反應(yīng)使尿液不能被濃縮［64-66］。

目前，還沒有針對NDI 的特異性藥物治療方法，一項研究中通過注射4-羥基-三苯氧胺條件性敲除小鼠的V2R 基因，成年小鼠即表現(xiàn)出NDI 的所有特征癥狀，包括多尿、多飲和抗利尿作用抵抗。在基因表達分析結(jié)果中顯示，腎臟EP4 的激活可能彌補NDI 小鼠腎臟V2R 活性的不足，用選擇性EP4 激動劑ONO AE1-329 治療急性和慢性突變小鼠都顯著改變NDI 的尿量減少、水攝入的增加表現(xiàn)，包括腎臟形態(tài)學的變化，同時負責水重吸收的水通道蛋白（aquaporin2，AQP2）表達提高70%。這些生理改善均反映集合管細胞上表達的EP4 的直接作用［67］。

在NDI 患者中，AQP2 和尿素通道蛋白 A1（urea transporter A1，UT-A1）功能正常［68］。在腎臟，加壓素除了作用在V2R 上導致水重吸收增加，同時會導致AQP2 的多聚磷酸化和膜靶向，這個過程增加了上皮細胞的水通透性，使水從集合管內(nèi)腔重新吸收，并增加尿液的濃縮［69］。這種情況針對NDI 的治療需要繞過V2R 以增加AQP2 膜的靶向性，但目前還沒有特異的藥物治療方法。AQP2 磷酸化取決于Ser256、Ser264和Ser269 三個cAMP 和蛋白激酶依賴的位點，其中Ser256 和Ser269 磷酸化位點對AQP2 的頂端膜積累起重要作用［70］，一項體外研究發(fā)現(xiàn)PGE2、EP2（Butaprost）或EP4（CAY10580）選擇性激動劑均能增加犬腎集合管上皮細胞（MDCK）細胞中AQP2 的轉(zhuǎn)運和Ser-264磷酸化。CAY10580 可增加離體腎小管中AQP2 的磷酸化，增加AQP2 的頂端膜豐度，導致細胞水滲透性增加［71］。

在Gao M 等人的一項研究中，利用Cre-loxP 重組系統(tǒng)建立腎小管特異性EP4 敲除小鼠（KSP-EP4（-/-））和集合管特異性EP4 敲除小鼠（AQP2-EP4（-/-）），均出現(xiàn)尿液濃縮缺陷。KSP-Ep4（-/-）小鼠腎集合管水通道蛋白2（aquaporin protein-2，AQP2）豐度降低，頂膜靶向性明顯減少。體外研究表明，CAY10580 選擇性激活或腺病毒介導的EP4 過表達后，小鼠原代內(nèi)髓質(zhì)集合管（inner myelin collecting duct，IMCD）細胞AQP2 mRNA 和蛋白水平明顯上調(diào)。此外，EP4 的激活也通過cAMP/PKA 和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶途徑增加穩(wěn)定轉(zhuǎn)染AQP2 cDNA 的IMCD 細胞中AQP2 膜的積聚，在調(diào)節(jié)尿液濃度方面發(fā)揮重要作用［72］。

上述結(jié)果說明EP4 獨立于VP-V2R 系統(tǒng)，促進AQP2 膜靶向性并增加AQP2 的膜豐度，使其成為治療獲得性尿崩癥和先天性尿崩癥等臨床疾病的潛在治療靶點。

3.5 腎小球腎炎

腎小球腎炎（glomerulonephritis，GN）又稱腎炎綜合征（簡稱腎炎），病因及發(fā)病機制較為復雜，包括原發(fā)性（自身免疫性表現(xiàn)）或繼發(fā)性（繼發(fā)于傳染性、惡性或代謝性疾?。?，表現(xiàn)為大量蛋白尿、增生性和炎癥性腎小球改變，包括新月體形成和白細胞浸潤［73-74］。腎小球腎炎被認為是世界范圍內(nèi)第二常見的終末期腎衰竭原因，最終需要透析或移植，給臨床治療帶來很大壓力［75］。

PGE2 通過EP4 調(diào)節(jié)免疫細胞，限制促炎細胞因子的產(chǎn)生及巨噬細胞、中性粒細胞的激活。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)靶向EP4 的激動劑同時具有有益［76］和有害的作用［77］。Nagamatsu 等人首次發(fā)現(xiàn)EP4 在腎小球腎炎中的重要作用，實驗中觀察到腎小球腎炎小鼠產(chǎn)生的PGE2 高于正常腎小球，而cAMP 水平較低，當皮下注射EP4 激動劑AE1-329 治療時兩者的變化可以改善，與對照組相比，AE1-329 抑制了腎炎小鼠肌酐和膽固醇的增加，腎小球新月體減少，兔抗腎小球基底膜抗體IgG 沉積減少，阻止腎小球腎炎的發(fā)展，但其保護機制仍不清楚［76］。Furuhashi K 等人在研究低血清條件培養(yǎng)的脂肪基質(zhì)細胞（LASCs）可改善新月體腎炎中發(fā)現(xiàn)，當使用藥物抑制PGE2 的產(chǎn)生，或阻斷EP4，或中和共培養(yǎng)介質(zhì)中的IL-6，或用阿司匹林或COX-2 抑制劑（CAY10404）預處理LASCs 均會削弱LASCs 減輕腎炎IgG 介導的腎損傷的能力，顯示EP4 可能是巨噬細胞轉(zhuǎn)化為免疫調(diào)節(jié)表型細胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白［78］。一項研究發(fā)現(xiàn)選擇性EP4 拮抗劑ONO AE3-208 可明顯改善腎炎表型，但不影響血壓水平，作用機制為降低腎小管趨化因子配體Cxcl-1 和Cxcl-5 的表達，減少中性粒細胞向腎間質(zhì)的浸潤，由此改善腎毒性血清性腎炎［79］。腎小球系膜細胞釋放過多的一氧化氮參與了腎炎的發(fā)病過程，研究發(fā)現(xiàn)在腎小球系膜細胞MES-13 中，PGE2主要通過EP4 以cAMP 依賴的方式調(diào)節(jié)NO 的產(chǎn)生。EP4 拮抗劑AH23848 可顯著抑制NO 生成和誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的表達從而抑制內(nèi)源性cAMP 在MES-13 細胞中的積累，緩解腎臟炎癥［80］。這些發(fā)現(xiàn)充分證明EP4 是一個很有前途的預防腎小球腎炎發(fā)展的靶點。

3.6 慢性腎臟病

近20 年來，慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）的患病率高、防治率低、已成為繼心腦血管疾病、腫瘤、糖尿病之后的一個威脅人類健康的疾病［81-82］。慢性腎臟病由多原因引起，盡管血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制劑和血管緊張素受體阻斷藥（angiotensin receptor blocker，ARBs）的幾種藥物取得了成功，但CKD 患者腎臟和心血管發(fā)病率和死亡率的絕對風險仍然很高，甚至可導致死亡［83］。因此，亟需新的藥物來有效地阻止腎功能喪失的進展。

不同病因引起CKD 的發(fā)生已在動物身上建立相關(guān)模型，這對于理解它們的病理生理機制和評估臨床前水平的前瞻性治療至關(guān)重要。在腎臟切除模型中，使用EP2（CP-536，745-01）、EP4（CP-044，519-02）和EP2/4 激動劑（CP-043，305-02）治療9 周后降低了血清肌酐，增加腎小球濾過率。其中EP4 激動劑治療的腎臟腎小球硬化程度較輕，近端和遠端小管和血管形態(tài)較好，上皮細胞增生增加，凋亡細胞較少。腎切除對EP4 的表達無影響，而EP2 表達水平降低50%，經(jīng)EP2和EP2/4 激動劑治療后得到糾正。在鏈脲佐菌素-糖尿病內(nèi)皮型一氧化氮合酶敲除的小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)EP4選擇性抑制劑ONO-AE3-208 可以減輕蛋白尿的發(fā)生，在2 型糖尿病db/db 小鼠中，ONO-AE3-208 也可將蛋白尿降低到與ACE 抑制劑卡托普利相當?shù)乃?，但不引起血壓及腎臟濾過率的改變。同時ONO-AE3-208也可減輕非糖尿病大鼠腎部分切除后蛋白尿的發(fā)展和腎小球瘢痕形成，提示選擇性拮抗EP4 可減輕糖尿病及非糖尿病性CKD 大鼠的腎損傷［84］。

大量研究表明，TGF-β誘導系膜細胞肥大引起系膜擴張、增殖、凋亡和細胞外基質(zhì)合成，被認為是CKD發(fā)生的重要介質(zhì)［85］，已知TGF-β誘導腎小球系膜細胞（mesangial cells，MCs）中COX-2、mPGES1 和PGE2 的表達［86］。研究發(fā)現(xiàn)EP1 激動劑可以通過調(diào)節(jié)門控鈣通道激活p38MAPK 和ERK 磷酸化，EP3 激動劑通過抑制G 蛋白受體抑制腺苷酸環(huán)化酶活性，從而阻斷cAMP 的產(chǎn)生，導致p38MAPK 和ERK 磷酸化的激活，從而通過促進腎小球系膜細胞增殖和細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）纖維化而成為腎損傷的關(guān)鍵介質(zhì)。相反，EP2 和EP4 激動劑可增加TGF-β1 依賴性cAMP 的產(chǎn)生，ERK 和p38 磷酸化降低，對TGF-β誘導的腎小球系膜損傷起到一定的保護作用。

然而在另一項研究中，通過對大鼠行5/6 腎切除術(shù)（5/6 nephrectomy，NX）制造慢性腎臟病模型，探究EP4選擇性拮抗劑ASP7657 對其腎臟的保護作用。結(jié)果顯示ASP7657 重復給藥8 周后，血漿肌酐和血尿素氮水平降低，肌酐清除率增加，并呈劑量依賴性顯著減少尿蛋白排泄，減輕腎小球硬化、團塊黏連和腎小管上皮細胞變性、萎縮及間質(zhì)損害，包括纖維化和炎癥細胞浸潤，但不影響血壓。而血管緊張素Ⅱ受體阻斷藥氯沙坦通過降低高血壓發(fā)揮腎臟保護作用，ASP7657 在不顯著降低全身血壓的情況下具有腎臟保護作用，提示其可能對CKD 的局部腎臟腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，具有選擇性藥理作用［87］。同樣，Mohamed 等人在1型糖尿病動物模型發(fā)現(xiàn)，EP4 激動劑通過增加IL-6 水平誘導腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化［77］。這些結(jié)果之間存在矛盾，可能是由于PGE2 的雙重作用，也可能是由于激動劑濃度不同或EP4 作用時間不同或組織差異，亦或其他原因所致，有待進一步研究。但其充分證明EP4是CKD 發(fā)生發(fā)展過程中一個重要的靶點，靶向EP4 篩選合適的選擇性激動劑或拮抗劑對CKD 患者的治療有潛在的幫助。

3.7 腎小球硬化

腎小球硬化（glomerulosclerosis，GS）表現(xiàn)為腎小球系膜細胞（MCs）的增殖和細胞外基質(zhì)（ECM）的積累，是慢性腎功能衰竭的終末期事件［88］。功能性細胞的丟失和非功能性基質(zhì)如Ⅰ型膠原（COL-1）和纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）的過度表達，伴隨炎性細胞浸潤，導致腎小球瘢痕形成，疤痕最終導致腎小球硬化［89］。因為目前還沒有逆轉(zhuǎn)進展的特異性治療，當腎小球濾過率（glomerular filtration rate，GFR）降至正常值的10%時，腎小球-管失衡患者需要進行腎臟替代治療。

在一項高尿酸血癥的研究中，尿酸（uric acid，UA)水平的升高除了可以誘導ROS 的產(chǎn)生和細胞死亡，還具有直接促炎作用，誘導COX-2 表達和PGE2 合成，導致腎小球損傷如腎小球硬化的發(fā)生［90］。Suzuki Y 等人用免疫組化的方法證明PGE2 通過EP2、EP4 升高腎小球細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平，促進血漿白蛋白（a-BSA）的清除，提示PGE2 通過環(huán)磷酸腺苷（cAMP）和蛋白激酶A（PKA）正向調(diào)節(jié)腎小球大分子的清除，為預防腎小球腎炎和腎小球硬化提供了新的思路［91］。有研究證明EP4 的增強可以通過TGF-β1/Smad 和ERK/MAPK 信號通路加速腎小球系膜細胞（MCs）損傷，增加ECM 蛋白的合成［92］。同樣Schneider A 等人使用足細胞特異性EP4 過度表達或缺失的小鼠（分別為EP4（pod+）和EP4（pod-/-）），給與PGE2 刺激后EP4（pod+）的cAMP 水平與對照相比高達8 倍，而EP4（pod-/-）的cAMP 合成缺陷。對其使用5/6 腎切除術(shù)，EP4（pod+）組白蛋白/肌酐比值顯著高于非手術(shù)組，存活率降低，而EP4（pod-/-）組小鼠的白蛋白/肌酐比值明顯低于非TG 組［93］。這些研究表明，PGE2 通過EP4 引起足細胞損傷并損害腎小球濾過屏障。刺激EP4 可加重腎小球硬化，并伴有腎小球毛細血管壓力增高?？傊?，目前關(guān)于EP4 的發(fā)現(xiàn)為延緩腎小球疾病的進展確定了一個新的潛在治療靶點。

3.8 常染色體顯性遺傳性多囊腎病

常染色體顯性遺傳性多囊腎?。╝utosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD）是一種常見的遺傳性疾病，組織病理學特征表現(xiàn)為腎臟中多發(fā)充滿液體的腎囊泡［94］，囊泡形成的機制涉及形態(tài)控制、細胞生長、增殖分化、凋亡和液體分泌［95］，Pkd1或其他囊性基因功能的喪失與cAMP 信號轉(zhuǎn)導共同作用，也可誘導上皮小管細胞形成囊泡［96］。

已有實驗證明前列腺素E2（PGE2）刺激人ADPKD 細胞時促進cAMP 產(chǎn)生和囊泡形成，在PKD囊液中PGE2 的濃度也顯著高于對照組，在分離的人ADPKD 腎上皮細胞中，PGE2 的作用似乎是由EP2 介導的［97-99］。同樣，也有研究致力于建立新的動物或可操作的細胞系統(tǒng)，由此發(fā)展新的治療ADPKD 或其他腎囊性疾病的方法。如小鼠IMCD-3 細胞系，可以在細胞外因子的作用下于3D 基質(zhì)中形成小管或囊泡，研究發(fā)現(xiàn)在IMCD-3 細胞中EP4 正常表達但未檢測到EP2 的表達，并且使用EP4 特異性拮抗劑CJ-42794 可降低cAMP的水平，在大小和數(shù)量水平上抑制PGE2 刺激的囊泡形成，EP2 拮抗劑PF-04418948 則不能，證明在IMCD-3 中PGE2 刺激cAMP 的增加是由EP4 介導的［100］。故選擇合適的模型系統(tǒng)才能有效測試前列腺素E 受體對囊泡形成的阻斷作用。

ADPKD 的兩個典型表型特征是PGE2 誘導的細胞增殖和Cl-分泌，為了驗證這一假說，一項研究測定了多囊蛋白1（PC1）缺乏的腎上皮細胞的增殖和Cl-分泌。PC-1 缺陷細胞的增殖速度快于PC1 完整細胞，但當環(huán)氧合酶被抑制時該效應(yīng)消除，表明PGE2 在細胞增殖中起作用。實驗結(jié)果也顯示PC1 缺陷的集合管細胞通過PGE2 的自分泌，主要刺激EP4 增加細胞內(nèi)cAMP濃度，活化β-catenin 并且誘導Cl-分泌［24］。這些結(jié)果表明，抑制PGE2 依賴性通路可能成為ADPKD 患者治療干預的方向，EP4 拮抗劑將是ADPKD 臨床上一個有潛力的治療靶點。

4 結(jié)論及展望

腎臟是人體主要的代謝器官，有很多因素易引起腎臟疾病，若診治不及時或缺乏有效的治療手段，會導致終末腎衰竭的發(fā)生，威脅患者生命。EP4 在腎小球及小管高度表達，又因為可以級聯(lián)興奮性信號Gs 蛋白及抑制性信號Gi 蛋白，故在腎疾病的多個復雜信號通路中發(fā)揮作用。隨著EP4 特異性激動劑和拮抗劑的廣泛應(yīng)用以及對EP4 敲除或過表達小鼠的深入研究，EP4在更多腎臟生理與病理生理學過程中的作用將逐漸被揭示，其作用機制也將被逐漸闡明。現(xiàn)有的研究表明，EP4 有可能成為治療包括腎性高血壓、急性腎損傷、腎小球腎炎、腎源性尿崩癥、慢性腎衰竭、腎小球硬化及常染色體顯性遺傳性多囊腎病中在內(nèi)的多種腎病的新靶標，選擇性藥物的篩選將給臨床腎臟疾病患者用藥帶來新的機遇。