法舒地爾減輕早產(chǎn)仔鼠腦白質(zhì)損傷*

唐穎林， 周齊艷， 張士發(fā)

（1永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南永州425006；2皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院兒科，安徽蕪湖241001）

腦白質(zhì)損傷（white matter injury，WMI）是早產(chǎn)兒出生時最常見的腦損傷形式之一，在早產(chǎn)兒中，WMI發(fā)生率高達(dá)50%［1］。WMI是早產(chǎn)兒神經(jīng)發(fā)育障礙的主要原因，并可能導(dǎo)致如腦癱、聽力障礙、認(rèn)知障礙、智力低下等多種神經(jīng)功能障礙類疾病發(fā)生［2］。早產(chǎn)兒WMI 的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。多數(shù)研究認(rèn)為，孕期感染/炎癥反應(yīng)是早產(chǎn)兒WMI發(fā)生的主要因素之一［3-5］。WMI 發(fā)生后能導(dǎo)致少突膠質(zhì)祖細(xì)胞不能正常分化和成熟，從而可能導(dǎo)致早產(chǎn)兒大腦發(fā)育不良［6］。而目前尚缺乏針對早產(chǎn)兒WMI有效的干預(yù)措施，因此，對早產(chǎn)兒WMI 治療策略的探索尤為緊迫。

法舒地爾（fasudil）是5-異喹啉磺酰胺衍生物，為Rho 相關(guān)激酶（Rho-associated kinase，ROCK）抑制劑，具有保護(hù)神經(jīng)免受各種因素導(dǎo)致的神經(jīng)損傷并促進(jìn)神經(jīng)再生的作用［7］。在大鼠尾動脈不凝血造內(nèi)囊出血模型和脊髓缺血再灌注模型中，法舒地爾可減輕大鼠腦水腫和白質(zhì)損傷［8-9］。這些結(jié)果提示了其在WMI中的作用，但其在早產(chǎn)兒WMI中的作用卻未見報道。因此，本研究通過對Wistar 大鼠孕期腹腔注射細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）建立早產(chǎn)仔鼠WMI模型，并對WMI的早產(chǎn)仔鼠實施法舒地爾干預(yù)處理，研究其對WMI 早產(chǎn)仔鼠腦室擴(kuò)張和膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響，并分析其機(jī)制。

材料和方法

1 實驗試劑

鹽酸法舒地爾（fasudil hydrochloride，F(xiàn)H）注射液（廣州海瑞藥業(yè)有限公司）；HE 染色試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、ECL 化學(xué)發(fā)光液、抗β-acin 抗體和HRP 標(biāo)記的II 抗（上海碧云天生物科技公司）；LPS（O55：B5；Sigma）；RIPA 裂解液、通用反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green Realtime PCR Master Mix 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；Trizol試劑（Invitrogen）；抗髓磷脂堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）抗體和少突膠質(zhì)細(xì)胞前體O4 抗體免疫組化試劑盒（武漢純度生物科技有限公司）；抗膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體和抗離子化鈣結(jié)合銜接分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1）抗體（Abcam）；抗ROCK2 抗體和磷酸化肌球蛋白輕鏈2（phosphorylated myosin light chain 2，p-MLC2）抗體（Novus）。

2 實驗動物

7 周齡雄性［6 只，（230±10）g］和雌性［18 只，（200±12）g］SPF 級Wistar 大鼠購自南華大學(xué)實驗動物中心［許可證號為SCXK（湘）2015-0002］，均飼養(yǎng)在室溫（23±2）℃、晝夜循環(huán)12 h 的SPF 級動物房中，可自由進(jìn)食飲水。

3 方法

3.1 模型構(gòu)建及分組處理 實驗開展前，大鼠均在飼養(yǎng)環(huán)境下適應(yīng)1周。適應(yīng)飼養(yǎng)結(jié)束后，1只雄性大鼠與3 只雌性大鼠同籠飼養(yǎng)，并每天早上檢查雌性大鼠陰栓。將孕鼠隨機(jī)分為正常組（n=6）和宮內(nèi)炎癥組（n=12），并根據(jù)文獻(xiàn)［10-11］方法，在雌性大鼠檢查到陰道栓后第16 和17 天，宮內(nèi)炎癥組孕鼠連續(xù)2 d腹腔注射LPS（350 μg·kg-1·d-1），正常組注射等體積生理鹽水。按文獻(xiàn)［10-11］方法，將宮內(nèi)炎癥組中孕期≤21 d 分娩的仔鼠定義為WMI 的早產(chǎn)仔鼠，并取WMI早產(chǎn)仔鼠隨機(jī)分為WMI 組（n=32）和WMI+FH 組（n=34）；將正常組足月（22～23 d）分娩仔鼠作為對照（control）組（n=58）。WMI 和WMI+FH 組早產(chǎn)仔鼠以及對照組仔鼠分別與原母鼠同籠飼養(yǎng)，待仔鼠出生后3 d，WMD+FH 組早產(chǎn)仔鼠腹腔注射FH（20 mg·kg-1·d-1）并持續(xù)2 周［12］，其余組仔鼠給予等體積生理鹽水。

3.2 腦組織的分離 仔鼠在出生第18 天，每組任取10 只仔鼠，麻醉后斷頭處死并取出全腦組織。腦組織分為兩部分，一部分凍存在-80℃，用于Western blot 和RT-qPCR 檢測，另一部分用石蠟包埋，并切為冠狀腦片（6 μm厚）用于HE染色和免疫組化檢測。

3.3 側(cè)腦室擴(kuò)張的檢測 冠狀腦片經(jīng)脫蠟水化后，行HE 染色。用顯微鏡觀察腦組織形態(tài)并拍照，用ImageJ 軟件量化左腦室、右腦室和全腦面積。側(cè)腦室指數(shù)（%）=兩個腦室總面積/全腦面積×100%。

3.4 免疫組化染色 腦片經(jīng)脫蠟水化后，用0.6%H2O2分解腦片中內(nèi)源性過氧化物酶，并用10%山羊血清在37℃下封閉1 h。添加Ⅰ抗（GFAP 和Iba1 抗體1∶300稀釋，MBP和O4抗體1∶500稀釋）并在37℃下孵育1 h，PBS 洗3 次；同時在免疫組化實驗中設(shè)計陰性對照（用PBS 代替I 抗）。添加生物素標(biāo)記的Ⅱ抗（1∶300 稀釋）并在37℃下30 min，PBS 洗3 次；添加HRP 標(biāo)記的鏈霉卵白素（1∶200 稀釋）并在室溫孵育 30 min，PBS 洗 3 次后以 DAB 溶液顯色。顯微鏡隨機(jī)選取3個視野，用ImageJ軟件統(tǒng)計陽性信號。

3.5 RT-qPCR 實驗 用Trizol 試劑提取腦組織中RNA，RNA 定量后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取引物和cDNA 用SYBR Green Realtime PCR Master Mix 試劑盒通過 ABI 7300 實時 PCR 系 統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR。髓鞘形成相關(guān)基因的引物序列如下：髓磷脂相關(guān)糖蛋白（myelin-associated glycoprotein， MAG）的上游引物序列為5′-GATGATATTCCTCGCCACC-3′，下游引物序列為 5′-ACTGACCTCCACTTCCGTT-3′；髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白（myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG）的上游引物序列為5′-TACAACTGGCTGCACCGAAGACT-3′，下游引物序列為 5′-AGGCTTTCCTTCGCTCCAGGAAGA-3′；早期生長應(yīng)答因子1（early growth response 1，EGR1）的上游引物序列為5′-AACCGGCCCAGCAAGACACC-3′，下游引物 序 列 為 5′-GGGCACAGGGGATGGGAATG-3′；MBP 的上游引物序列為 5′-CACACACGAGAACTACCCA-3′，下游引物序列為5′-GGTGTTCGAGGTGTCACAA-3′；GAPDH 的上游引物序列為5′-CAGCAATGCATCCTGCACC-3′，下游引物序列為5′-TGGACTGTGGTCATGAGCCC-3′。反應(yīng)體系為：1 μL cDNA、10 μL SYBR Green PCR Master Mix 及 200 nmol/L 正向和反向引物。反應(yīng)條件為：95℃5 min；94℃ 15 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，40 個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，以 GAPDH 作為內(nèi)參照，用 2-ΔΔCt法對目的基因進(jìn)行量化分析。

3.6 Western blot 實驗 RIPA 裂解液裂解腦組織，BCA 法定量后取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE（100 V、2 h）。將電泳分離的蛋白樣品通過濕法電轉(zhuǎn)至甲醇活化的PVDF 膜（200 A、1.5 h）。用5%脫脂牛奶室溫下封閉PVDF 膜上蛋白1 h，隨后加I 抗（β-actin 抗體1∶5 000 稀釋，ROCK2 抗體 1∶1 500 稀釋，p-MLC2 抗體1∶1 000 稀釋）在4℃下孵育過夜。TBST 洗膜后，室溫孵育HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗（1∶2 000 稀釋）1 h，TBST洗膜后，ECL法成像顯影。膠片進(jìn)行掃描后，ImageJ軟件分析條帶吸光度。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）。采用單因素方差分析及Bonfferoni 法對多組間數(shù)據(jù)的差異進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 法舒地爾對早產(chǎn)仔鼠側(cè)腦室擴(kuò)張的影響

通過HE 染色法觀察法舒地爾對WMI 早產(chǎn)仔鼠出生后18 d側(cè)腦室擴(kuò)張的影響，結(jié)果顯示，與對照組足月分娩仔鼠比較，WMI 組早產(chǎn)仔鼠的側(cè)腦室面積明顯增大（圖1A），側(cè)腦室指數(shù)顯著升高（P＜0.01；圖1B）；與WMI組比較，WMI+FH 組早產(chǎn)仔鼠的側(cè)腦室面積明顯減?。▓D1A），側(cè)腦室指數(shù)顯著下降（P＜0.01；圖1B）。

Figure 1.Fasudil reduced lateral ventricular dilatation in WMI preterm rats.A：the representative images of HE staining of lateral ventricle sections（top panel，scale bar=100 μm；bottom panel，scale bar=50 μm）；B：quantitative analysis of ventricular size index.Mean±SEM. n=10.##P＜0.01 vs control group；**P＜0.01 vs WMI group.圖1 法舒地爾減小WMI早產(chǎn)仔鼠的側(cè)腦室擴(kuò)張

2 法舒地爾對WMI的早產(chǎn)仔鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞的影響

MBP 染色結(jié)果顯示，對照組足月分娩仔鼠的胼胝體和皮質(zhì)下白質(zhì)中MBP 表達(dá)豐富；與對照組足月分娩仔鼠比較，WMI 組早產(chǎn)仔鼠的胼胝體和皮質(zhì)下白質(zhì)中 MBP 表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；與WMI 組比較，WMI+FH 組早產(chǎn)仔鼠的胼胝體和皮質(zhì)下白質(zhì)中MBP 表達(dá)顯著增加（P＜0.01），見圖2A。O4 免疫組化染色結(jié)果顯示，對照組足月分娩仔鼠O4 表達(dá)豐富，主要見于扣帶回和胼胝體；與對照組足月分娩仔鼠比較，WMI 組早產(chǎn)仔鼠O4 陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.01）；與WMI 組比較，WMI+FH 組早產(chǎn)仔鼠O4染色細(xì)胞數(shù)顯著增多（P＜0.01），見圖2B。

Figure 2.Fasudil increased the number of oligodendrocyte precursor cells in WMI preterm rats.A：the representative images of immunohistochemical staining and the quantitative analysis of MBP expression levels；B：the representative images of immunohistochemical staining and the quantitative analysis of O4 expression levels.Mean±SEM. n=10.##P＜0.01 vs control group；**P＜0.01 vs WMI group.圖2 法舒地爾增加WMI的早產(chǎn)仔鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞數(shù)

3 法舒地爾對早產(chǎn)仔鼠膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響

Iba1 免疫組化檢測活化的小膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)果顯示，對照組足月分娩仔鼠扣帶回和胼胝體有少量活化的小膠質(zhì)細(xì)胞；與對照組足月分娩仔鼠比較，WMI組早產(chǎn)仔鼠扣帶回和胼胝體中活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)顯著增多（P＜0.01）；與WMI 組比較，WMI+FH 組早產(chǎn)仔鼠扣帶回和胼胝體中活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.01），見圖3A。GFAP 免疫組化檢測活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)果顯示，對照組足月分娩仔鼠皮層下白質(zhì)和扣帶內(nèi)有少量活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞；與對照組足月分娩仔鼠比較，WMI 組早產(chǎn)仔鼠皮層下白質(zhì)和扣帶內(nèi)活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)顯著增多（P＜0.01）；與WMI 組比較，WMI+FH 組早產(chǎn)仔鼠皮層下白質(zhì)和扣帶內(nèi)活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.01），見圖3B。

4 法舒地爾對早產(chǎn)仔鼠髓鞘形成相關(guān)基因表達(dá)的影響

RT-qPCR 結(jié)果顯示，與對照組足月分娩仔鼠比較，WMI 組早產(chǎn)仔鼠腦組織中 MAG、MBP、MOG 和EGR1 的 mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與WMI 組比較，WMI+FH 組早產(chǎn)仔鼠腦組織中MAG、MBP、MOG 和EGR1 的mRNA 表達(dá)水平顯著增加（P＜0.01），見圖4。

5 法舒地爾對早產(chǎn)仔鼠Rho/ROCK 信號活性的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與對照組足月分娩仔鼠比較，WMI 組早產(chǎn)仔鼠腦組織中ROCK2 和p-MLC2蛋白水平顯著增加（P＜0.01）；與WMI組比較，WMI+FH 組早產(chǎn)仔鼠腦組織中ROCK2 和p-MLC2 蛋白水平顯著降低（P＜0.01），見圖5。

討 論

WMI 是造成早產(chǎn)兒腦性癱瘓的最主要因素，嚴(yán)重影響患兒神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育［2］。圍產(chǎn)期宮內(nèi)感染/炎癥是導(dǎo)致早產(chǎn)兒發(fā)生WMI的主要因素［3-5］，因此本實驗通過孕鼠腹腔注射LPS 致宮內(nèi)炎癥建立早產(chǎn)仔鼠WMI 模型。側(cè)腦室擴(kuò)張是WMI 主要的癥狀表現(xiàn)［13］，本實驗結(jié)果顯示，法舒地爾可降低 WMI 早產(chǎn)仔鼠的側(cè)腦室擴(kuò)張，說明其對早產(chǎn)仔鼠的WMI 具有抑制作用。

少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞是嬰幼兒腦白質(zhì)損傷的主要靶點［14］。少突膠質(zhì)細(xì)胞系細(xì)胞的發(fā)育涉及少突膠質(zhì)細(xì)胞的遷移、增殖和分化的不同階段，并最終髓鞘化。早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷的髓鞘形成減少正是與少突膠質(zhì)細(xì)胞系細(xì)胞，特別是少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞的延遲發(fā)育或破壞有關(guān)［14-15］。本實驗結(jié)果顯示，法舒地爾可增加WMI 的早產(chǎn)仔鼠腦中O4 和MBP 陽性細(xì)胞數(shù)目，提示其可促進(jìn)WMI 的早產(chǎn)仔鼠的少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞的發(fā)育。已有研究表明，膠質(zhì)細(xì)胞的活化會引起少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育和髓鞘形成障礙［14-15］。法舒地爾可抑制LPS激活的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞的炎性反應(yīng)［16］，增加缺氧缺血性腦損傷模型新生大鼠的腦組織中 Nogo 髓鞘相關(guān)蛋白表達(dá)［17］，但其對 WMI 早產(chǎn)仔鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的活化以及髓鞘形成的作用并不清楚。本實驗結(jié)果顯示，其可降低WMI 的早產(chǎn)仔鼠腦組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化水平，并可增加WMI 的早產(chǎn)仔鼠髓鞘形成相關(guān)基因表達(dá)水平。本研究結(jié)果提示，法舒地爾可能通過減少膠質(zhì)細(xì)胞的活化以及增加少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞數(shù)和髓鞘形成相關(guān)基因表達(dá)來減輕早產(chǎn)仔鼠WMI。

Figure 3.Fasudil decreased glial cell activation in WMI preterm rats.A：representative images of immunohistochemical staining of Iba1 and the quantitative data of the number of microglia；B：representative images of immunohistochemical staining of GFAP and the quantitative data of the number of astrocytes.Mean±SEM. n=10.##P＜0.01 vs control group；**P＜0.01 vs WMI group.圖3 法舒地爾降低WMI早產(chǎn)仔鼠膠質(zhì)細(xì)胞的激活

Figure 4.Fasudil promoted the expression of myelin formation-related genes in WMI preterm rats.A：relative mRNA expression of MAG；B：relative mRNA expression of MBP；C：relative mRNA expression of MOG；D：relative mRNA expression of EGR1.Mean±SEM. n=10.##P＜0.01 vs control group；**P＜0.01 vs WMI group.圖4 法舒地爾促進(jìn)WMI早產(chǎn)仔鼠髓鞘形成相關(guān)基因的表達(dá)

Figure 5.Fasudil inhibited Rho/ROCK signaling activity in WMI preterm rats.The protein levels of ROCK2 and p-MLC2 were determined by Western blot.Mean±SEM. n=10.##P＜0.01 vs control group；**P＜0.01 vs WMI group.圖5 法舒地爾抑制WMI早產(chǎn)仔鼠的Rho/ROCK信號活性

Rho蛋白是一種三磷酸鳥苷酸結(jié)合蛋白，ROCK是最早發(fā)現(xiàn)的Rho 效應(yīng)物，在分子水平上參與基因表達(dá)、胞質(zhì)分裂、細(xì)胞黏附和遷移等的調(diào)節(jié)［18］。Rho/ROCK 通路異常激活與WMI 密切相關(guān)，但大多數(shù)報道集中在急性缺血性動物模型中。且已有研究顯示，法舒地爾在急性缺血性動物模型中可降低ROCK活性［19］，但法舒地爾對 WMI 早產(chǎn)仔鼠中 Rho/ROCK信號活性的影響并不清楚。本實驗結(jié)果顯示，法舒地爾可顯著抑制WMI 早產(chǎn)仔鼠腦組織中Rho/ROCK信號活性。

綜上所述，法舒地爾可顯著降低WMI 早產(chǎn)仔鼠的腦病理損傷，緩解少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞數(shù)目的減少，降低腦組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活水平，促進(jìn)髓鞘形成相關(guān)基因的表達(dá)，并降低Rho/ROCK 信號活性，因此，可以作為早產(chǎn)WMI 的潛在治療藥物。