尼氟滅酸抑制人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞活力、遷移及侵襲*

崔萬麗， 石雨淑雅， 蔡欣池， 田 晶△

（吉林醫(yī)藥學(xué)院 1生理學(xué)教研室，22016級臨床醫(yī)學(xué)教改班，吉林吉林132013）

尼氟滅酸（niflumic acid，NFA）是一種常用的解熱鎮(zhèn)痛藥，經(jīng)常用于痛經(jīng)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎的治療，通過抑制環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）發(fā)揮作用；同時，它也可以特異性阻斷氯通道［1］，影響細(xì)胞的增殖［2］和凋亡［3］等。膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的腫瘤，其極強的侵襲性是導(dǎo)致膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)率高的主要原因之一［4］。報道顯示惡性膠質(zhì)瘤高表達(dá)COX-2［5］，也有報道膠質(zhì)瘤的惡性程度與氯通道數(shù)量呈正相關(guān)［6-8］，而NFA 對膠質(zhì)瘤的作用尚不清楚。本研究觀察氯通道阻斷劑NFA 對人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞活力、遷移和侵襲的作用，并初步探討其作用機制，為臨床治療提供參考資料。

材料和方法

1 細(xì)胞株、主要試劑和儀器

人膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞株由吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科提供。NFA和MTT購自Sigma；胰蛋白酶和小牛血清購自Gibco；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自 Thermo。NFA 用 DMSO 配制成濃度為0.1 mol/L 的原液備用，于4℃保存，實驗時再用培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。CB150 型CO2培養(yǎng)箱為Binder公司產(chǎn)品；CA92121 型實時無標(biāo)記細(xì)胞分析（realtime cell analysis，RTCA）儀DP 系統(tǒng)為杭州艾森生物有限公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 自液氮罐中取出凍存的U87 細(xì)胞，37℃水浴振蕩溶解，用含10%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)液混勻后置于75 cm2培養(yǎng)瓶中，于37℃、5% CO2及飽和濕度條件下進行培養(yǎng)，隔日換液，隔2～3 d 傳代1 次，取生長狀態(tài)良好處于對數(shù)生長期的U87細(xì)胞隨機分為對照組和不同濃度NFA處理組。

2.2 MTT 法檢測U87 細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期的U87 細(xì)胞，0.25%胰酶消化后，用含5%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107/L。將細(xì)胞均勻接種于96 孔板中，每孔100 μL，置入37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。24 h 后加入NFA（終濃度分別為0、25、50、100和200 μmol/L），每個濃度5 個復(fù)孔，分別作用12、24 和48 h，每孔再加入MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h，棄上清后每孔加入DMSO 150 μL，振蕩15 min，全自動酶標(biāo)儀 490 nm 波長處測定各孔吸光度（A）值，并計算細(xì)胞相對活力。細(xì)胞相對活力（%）=實驗組A值/對照組A值×100%。

2.3 RTCA 法檢測細(xì)胞遷移［9］遷移侵襲檢測板下室的孔中加入165 μL 含10%小牛血清的培養(yǎng)基，上室中加入30 μL 無血清培養(yǎng)基，輕拍板四周，使培養(yǎng)基分布均勻，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱平衡1 h。將測好基線的檢測板取出，在上室孔中加入100 μL混合均勻的無血清細(xì)胞懸液，使每孔中細(xì)胞數(shù)目分別為5×104個。檢測板置于超凈臺中室溫放置30 min 后，放到培養(yǎng)箱中的RTCA Station 上，系統(tǒng)自動掃描后，間隔15 min 測量細(xì)胞指數(shù)一次，共檢測72 h。細(xì)胞遷移曲線由RTCA 儀自動生成，采取12、24、48 和72 h 4 個時點細(xì)胞指數(shù)的后臺數(shù)據(jù)計算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率（%）=實驗組細(xì)胞指數(shù)/對照組細(xì)胞指數(shù)×100%。

2.4 RTCA 法檢測細(xì)胞侵襲［9］實驗前將基質(zhì)膠從-80℃移至4℃融化。用預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基按1∶40稀釋基質(zhì)膠，冰上操作，以防基質(zhì)膠凝固。先在遷移侵襲檢測板上室中加入50 μL稀釋好的基質(zhì)膠，再吸出 30 μL 的基質(zhì)膠，孔中留 20 μL 的基質(zhì)膠包被檢測板上室。放置在37℃中至凝固，凝固時上室置于檢測板夾具上，保證懸空不觸及電極。下室孔中加入160 μL 含10%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，在上室放入30 μL 的無血清培養(yǎng)基，將裝置置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱平衡1 h。將培養(yǎng)好的細(xì)胞取出后，進行消化、離心，無血清培養(yǎng)基配制成需要的細(xì)胞濃度。上室孔中加入100 μL 混合均勻的無血清細(xì)胞懸液，每孔中細(xì)胞數(shù)為5×104個。將檢測板置于超凈臺中室溫放置30 min 后，放在培養(yǎng)箱中的RTCA Station上，系統(tǒng)自動掃描后，間隔15 min 檢測一次細(xì)胞指數(shù)，共檢測72 h。細(xì)胞侵襲曲線由RTCA 儀自動生成，采取 12、24、48和72 h 4 個時點細(xì)胞指數(shù)的后臺數(shù)據(jù)計算細(xì)胞侵襲率。細(xì)胞侵襲率（%）=實驗組細(xì)胞指數(shù)/對照組細(xì)胞指數(shù)×100%。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析。細(xì)胞相對活力、細(xì)胞遷移率及細(xì)胞侵襲率的數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 U87細(xì)胞的活力

NFA 作用膠質(zhì)瘤 U87 細(xì)胞 12 h 后，與空白對照組比較，各濃度組細(xì)胞活力均增強（P＜0.05 或P＜0.01）；與空白對照組比較，NFA 作用 24 h 后，100 和200 μmol/L NFA 組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05）；NFA 作用 48 h 后，50、100和200 μmol/L NFA 組細(xì)胞活力均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），并呈現(xiàn)濃度依賴性，見表 1。由于 100和200 μmol/L NFA 組細(xì)胞活力受到顯著抑制，因此后續(xù)研究采用這兩個濃度進行干預(yù)。

2 各組U87細(xì)胞的遷移情況

RTCA 檢測結(jié)果表明，各組U87 細(xì)胞均發(fā)生遷移。與空白對照組比較，12 h 時 200 μmol/L NFA 組細(xì)胞遷移率就顯著降低（P＜0.05），24 h 后更加顯著（P＜0.01），100 μmol/L NFA 組在48 h 后細(xì)胞遷移率顯著降低（P＜0.01），200 μmol/L NFA 組細(xì)胞遷移率低于100 μmol/L NFA 組（P＜0.01），具有一定的濃度依賴性，見圖1及表2。

表1 各組U87細(xì)胞活力Table 1.The viability of the U87 cells in various groups（%.Mean±SD. n=5）

Figure 1.Migration curves of the U87 cells.圖1 U87細(xì)胞遷移曲線

3 各組U87細(xì)胞的侵襲情況

RTCA 結(jié)果表明，各組U87 細(xì)胞均可以穿過基質(zhì)膠發(fā)生侵襲，與對照組相比，48 h 時 100和200 μmol/L NFA 組細(xì)胞侵襲率顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），200 μmol/L NFA 組細(xì)胞侵襲率低于 100 μmol/LNFA組（P＜0.01），見圖2及表3。

Figure 2.Invasion curves of the U87 cells.圖2 U87細(xì)胞侵襲曲線

表3 各組U87細(xì)胞的侵襲率Table 3.Invasive rates of the U87 cells in different groups（%.Mean±SD. n=3）

討 論

根據(jù)組織病理學(xué)的特征膠質(zhì)瘤分為4 級，Ⅰ和Ⅱ級為低級別膠質(zhì)瘤，這兩型分化好，相對良性，5年生存率可達(dá)59.9%［10-11］；Ⅲ和Ⅳ級為高級別膠質(zhì)瘤，均為惡性。Ⅳ級膠質(zhì)瘤又稱膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，它具有高度增殖性和侵襲性，且易復(fù)發(fā)、預(yù)后差，兩年生存率可低至3.3%［10-11］。膠質(zhì)瘤的侵襲能力強導(dǎo)致其易復(fù)發(fā)，是影響其預(yù)后的主要因素。COX-2 在惡性膠質(zhì)瘤表達(dá)增加并與患者生存期縮短有關(guān)［5］。COX-2受表皮生長因子受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控，通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 Id1 增強 GBM 細(xì)胞的惡性程度［5］。腫瘤細(xì)胞在增殖、遷移和侵襲前都有容積的變化。當(dāng)細(xì)胞處于低滲環(huán)境時，位于胞膜上的容積激活性鉀通道與氯通道會開放，通過K+和Cl-的外流，帶動水的流出，可使細(xì)胞體積變小，這一過程稱為調(diào)節(jié)性容積減?。╮egulatory volume decrease，RVD）。RVD 在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和遷移等過程中非常重要。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞，RVD 功能尤其強大。研究表明，正常腦細(xì)胞內(nèi)Cl-濃度約6～10 mmol/L，由于膠質(zhì)瘤高表達(dá)Na+-K+-2Cl-轉(zhuǎn)運體1 使細(xì)胞內(nèi)Cl-濃度可高達(dá)80～100 mmol/L，具有明顯的外流趨勢［12］。膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)Cl-或者K+通過離子通道或轉(zhuǎn)運蛋白外流，從而帶動水的外流，使細(xì)胞容積變小，使膠質(zhì)瘤能夠穿過狹窄的縫隙，發(fā)生遷移［12］。

據(jù)報道，長期使用非甾體抗炎藥可降低結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、食道癌和胃癌的發(fā)病率［13］，能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡并抑制遷移［13］。NFA 作為一種非甾體抗炎藥，近年來發(fā)現(xiàn)能抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖［2］。大多數(shù)非甾體抗炎藥對COX-1和COX-2有較強的抑制作用。抑制COX-2 可以抑制腫瘤的血管生成并促進凋亡［14］。然而，非甾體抗炎藥的抗腫瘤作用可能不僅是通過抑制COX-2 活性來介導(dǎo)的。因為，首先非甾體抗炎藥誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的濃度明顯高于COX-2抑制所需的濃度［15］；其次非甾體抗炎藥不僅抑制COX-2 表達(dá)細(xì)胞的生長，而且抑制COX-2 缺陷細(xì)胞系的生長［16］。NFA 是COX-2的選擇性抑制劑，同時，它也是氯通道的阻斷劑，可以特異性地阻斷鈣激活氯通道、囊性纖維跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)體和容量調(diào)控氯通道［2］。研究發(fā)現(xiàn)多種氯通道阻斷劑如NPPB、氯毒素、9-蒽羧酸等都可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖［17］。

本研究檢測了NFA 對人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示NFA在12 h時表現(xiàn)為促進增殖作用，作用24 和48 h 時抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。進一步用RTCA 法檢測了NFA 對膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響，顯示100和200 μmol/L NFA 在作用24 h和48 h可以明顯地抑制膠質(zhì)瘤的遷移和侵襲，作用具有時間和劑量依賴性。NFA 對膠質(zhì)瘤遷移和侵襲的抑制程度大于對細(xì)胞增殖的抑制程度，尤其是48 h 更為顯著，說明NFA 抑制膠質(zhì)瘤的遷移和侵襲不是或不僅是通過抑制細(xì)胞增殖起作用的。氯通道種類繁多，目前研究傾向于認(rèn)為，鈣激活的氯通道家族中ClC-3參與了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲［18］。鈣/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶II（calcium/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII）可 以激活 ClC-3［18-20］。短期內(nèi)阻斷氯通道，可以使細(xì)胞內(nèi)Ca2+代償性增多從而促進細(xì)胞增殖［21］，這可能是NFA 短期作用時促進細(xì)胞增殖的原因。膠質(zhì)瘤細(xì)胞緩激肽受體2（bradykinin receptor 2，B2R）的表達(dá)量與腫瘤惡性度正相關(guān)［21-22］。腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞通過血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放的緩激肽的趨化作用沿血管外壁遷移。抑制氯通道后，緩激肽的趨化作用消失［21-22］。因此推測，緩激肽與B2R 結(jié)合，可以引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加，通過CaMKII 激活ClC-3 氯電流，從而引起細(xì)胞容積變小而發(fā)生遷移。NFA 是通過抑制COX-2還是通過阻斷ClC-3 抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，還需要我們進一步研究證實。阻斷氯通道可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，這為膠質(zhì)瘤的治療提供了研究方向。