PLIN3在肺腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系*

王雪婷， 張麗萍， 周丹丹， 鄭 荃， 牟青杰， 張寶剛， 李洪利 ， 尹崇高

（濰坊醫(yī)學(xué)院 1生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，2病理學(xué)教研室，3臨床學(xué)院，4醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心，5護(hù)理學(xué)院，山東濰坊261053）

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率逐年增長，對人類的生命健康存在極大威脅。肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是肺癌的一種，在過去20多年中，許多國家的LUAD 發(fā)病率一直在增加［1-2］。長期以來轉(zhuǎn)移性LUAD 患者的治療都是姑息性的，然而其整體治愈率和存活率仍然很低，改善LUAD 的預(yù)后是提高整體治愈率和存活率的關(guān)鍵［3］。因此研究與LUAD 不良預(yù)后相關(guān)的基因，可為LUAD的臨床治療提供新的靶點(diǎn)。

圍脂滴蛋白3（perilipin 3，PLIN3）是圍脂滴蛋白家族成員之一，據(jù)報道其參與了脂滴的形成和積累。圍脂滴蛋白家族參與脂代謝的調(diào)控，其表達(dá)失調(diào)可能與肥胖、糖尿病和胰島素抵抗等疾病有關(guān)［4-5］。研究表明，圍脂滴蛋白表達(dá)失調(diào)可能影響漿液性卵巢癌［6］和乳腺癌［7］等腫瘤的進(jìn)展。然而，PLIN3 在LUAD中的表達(dá)水平、診斷和預(yù)后價值以及對肺腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響尚不清楚。

本研究應(yīng)用HPA 數(shù)據(jù)庫篩選LUAD 不良預(yù)后相關(guān)的基因，運(yùn)用GEPIA 數(shù)據(jù)庫和Ualcan 數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步驗(yàn)證了PLIN3 在LUAD 中的表達(dá)及與患者預(yù)后的相關(guān)性，此外，通過構(gòu)建siPLIN3 質(zhì)粒研究了PLIN3對LUAD細(xì)胞侵襲能力的影響。

材料和方法

1 主要材料

Lipofectamine 2000 購自 Invitrogen；胎牛血清購自HyClone；Transwell小室購自Corning，Matrigal膠購自BD；鼠抗人β-actin 單抗與兔抗人PLIN3 單抗購自Abcam。

2 主要方法

2.1 The Human Protein Atlas（HPA）數(shù)據(jù)庫 HPA數(shù)據(jù)庫（https：//www.proteinatlas.org/）基于綜合組學(xué)方法，將基于抗體的蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析與高通量的mRNA 測序（RNA-Seq）相結(jié)合［7］。本研究使用HAP數(shù)據(jù)庫中公開的蛋白質(zhì)和RNA 表達(dá)數(shù)據(jù)集尋找可作為潛在生物標(biāo)記的基因。首先查找肺癌中高表達(dá)且與不良預(yù)后相關(guān)的基因，之后分析該基因與肺癌及LUAD 亞型患者生存率的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)該基因在LUAD中存在更顯著的相關(guān)性。

2.2 GEPIA 數(shù)據(jù)庫 運(yùn)用GEPIA 數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/），分析 PLIN3 在 LUAD 患者中基因表達(dá)的情況，并進(jìn)一步驗(yàn)證PLIN3與LUAD患者生存率的相關(guān)性。

2.3 Ualcan 數(shù)據(jù)庫 本研究使用Ualcan 數(shù)據(jù)庫（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）中的數(shù)據(jù)，根據(jù)LUAD 腫瘤分級、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期等臨床病理特征，分析PLIN3 表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染條件參照文獻(xiàn)實(shí)施［8］，分組為：（1）A549 組：不轉(zhuǎn)入質(zhì)粒；（2）Scr/A549 組：轉(zhuǎn)入空載質(zhì)粒；（3）siPLIN3/A549 組：轉(zhuǎn)入PLIN3小干擾質(zhì)粒。

2.5 Western blot 實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染后提取各組細(xì)胞總蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE 分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉。孵育Ⅰ抗，抗體濃度分別為 β-actin（1∶1 000）和 PLIN3（1∶500）。孵育Ⅱ抗、顯影并行定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞濃度為4×109/L 的懸液 150 μL，加入 Transwell 小室上室中，下室加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基500 μL，培養(yǎng)24 h。之后4%多聚甲醛固定20 min，Giemsa 染色45 min，PBS 洗滌3 次。顯微鏡下隨機(jī)選取5 個視野拍照計數(shù)，取穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞平均數(shù)為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

HAP 數(shù)據(jù)庫、GEPIA 數(shù)據(jù)庫和 Ualcan 數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)出的生存曲線及箱線圖采用數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站中的統(tǒng)計分析方法，其中箱線圖數(shù)據(jù)的表達(dá)格式為中位數(shù)。使用SPSS 17.0軟件對體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩組定量資料均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 應(yīng)用HPA數(shù)據(jù)庫選取PLIN3為目的基因

從HPA數(shù)據(jù)庫中查找與肺癌不良預(yù)后相關(guān)的基因，首先將得到的354個基因以FPKM 值表示轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行排序，再結(jié)合與不良預(yù)后相關(guān)的前20 個最重要基因，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，選取肺癌中未見報道過的PLIN3為研究對象。

2 PLIN3 在LUAD 組織中高表達(dá)且與LUAD 患者生存率顯著相關(guān)

根據(jù)HPA 數(shù)據(jù)庫跟蹤785 例PLIN3 低表達(dá)肺癌患者和209例高表達(dá)患者（以FPKM 值衡量基因表達(dá)水平），發(fā)現(xiàn)低表達(dá)患者的5年生存率為48%，高表達(dá)患者的5 年生存率為34%（圖1A）；跟蹤343 例PLIN3低表達(dá)LUAD 患者和157 例高表達(dá)LUAD 患者，發(fā)現(xiàn)低表達(dá)患者的5 年生存率為47%，高表達(dá)患者的5 年生存率為25%（圖1B）。LUAD 亞型的生存率分析顯示，PLIN3 與LUAD 患者生存率存在顯著的相關(guān)性。運(yùn)用GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析PLIN3 在347 例正常肺組織和483 例LUAD 組織中的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)LUAD 中PLIN3高表達(dá)（圖1C）。運(yùn)用GEPIA 數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步對LUAD 中PLIN3表達(dá)差異情況進(jìn)行生存分析，發(fā)現(xiàn)與PLIN3 低表達(dá)組相比，PLIN3 高表達(dá)組的總生存率較低（圖1D）。

Figure 1. PLIN3 was the related gene of bad prognosis of LUAD in HPA database and GEPIA database.A，B：the relationship between PLIN3 and the survival rate of lung cancer and LUAD patients and the distribution of PLIN3 FPKM in patients；C：GEPIA database verifying the expression difference of PLIN3 in LUAD tissue；D：GEPIA database verifying the relationship between PLIN3 and survival rate in LUAD.圖1 在HPA數(shù)據(jù)庫及GEPIA數(shù)據(jù)庫中PLIN3是LUAD不良預(yù)后的相關(guān)基因

3 Ualcan 數(shù)據(jù)庫分析PLIN3 在LUAD 中的表達(dá)情況

采用Ualcan 數(shù)據(jù)庫中TCGA 數(shù)據(jù)分析PLIN3 在59例正常肺組織和515例LUAD組織中的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)PLIN3 在LUAD 組織中高表達(dá)（P＜0.01），見圖2A。根據(jù)PLIN3 在LUAD 中的表達(dá)及其與腫瘤分級的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)腫瘤分級高的患者其PLIN3 的表達(dá)也高（圖2B）。PLIN3 與LUAD 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也有相關(guān)性，與正常肺組織相比，PLIN3在N0，N1，N2的LUAD患者中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)增加，PLIN3 表達(dá)也升高（圖2C）。并且發(fā)現(xiàn)LUAD 患者中不同性別之間PLIN3 的表達(dá)無明顯差異（圖2D）。

Figure 2.The expression of PLIN3 in LUAD was detected by Ualcan database.A：the different expression of PLIN3 in normal and LUAD tissues；B：the different expression of PLIN3 in different stages of LUAD；C：the different expression of PLIN3 in lymph node metastasis status of LUAD；D：the different expression of PLIN3 in LUAD of different genders.*P＜0.05 vs normal group.圖2 采用Ualcan數(shù)據(jù)庫分析PLIN3在LUAD中的表達(dá)情況

4 體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PLIN3在LUAD細(xì)胞中呈高表達(dá)

Western blot 檢測PLIN3 的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，PLIN3在肺腺癌細(xì)胞A549中的表達(dá)明顯高于人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B（P＜0.05），表明PLIN3 在A549細(xì)胞中高表達(dá)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞24 h 后，Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率，與對照組Scr/A549相比，敲減PLIN3（siPLIN3/A549）組中PLIN3 的表達(dá)量顯著降低，表明轉(zhuǎn)染成功，見圖3。

5 PLIN3促進(jìn)A549細(xì)胞的侵襲

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 A549 細(xì)胞 24 h 后，通過 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲能力，與Scr/A549 組相比，siPLIN3/A549 組穿過基膜的細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.05）。結(jié)果表明，敲減PLIN3的表達(dá)可以抑制肺腺癌細(xì)胞A549的侵襲能力，見圖4。

討 論

肺癌是全世界腫瘤死亡的主要原因，患者被診斷出肺癌時通常處于晚期階段。根據(jù)臨床和組織病理特征肺癌大致可分為非小細(xì)胞肺癌（non-smallcell lung cancer，NSCLC；占肺癌診斷的近80%）和小細(xì)胞肺癌（small-cell lung carcinoma，SCLC；占20%），其中NSCLC 又可以分為鱗狀細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌和腺癌［1］。在過去20多年中，許多國家的SCLC 發(fā)病率持續(xù)下降［9-10］。但70%以上的NSCLC 患者在診斷時處于晚期或已轉(zhuǎn)移（III、IV 期）［11-12］。雖然近25 年來肺癌的診治取得了很大進(jìn)展，但患者的預(yù)后仍不理想。

Figure 3.Western blot analysis was used to detected the PLIN3 expression.A：the expression of PLIN3 in BEAS-2B cells and A549 cells；B：the expression of PLIN3 in A549 cells，Scr/A549 cells and siPLIN3/A549 cells.Mean±SD. n=3.#P＜0.05 vs BEAS-2B cells；*P＜0.05 vs Scr/A549 cells.圖3 Western blot檢測PLIN3的表達(dá)情況

Figure 4.The invasiveness of A549 cells was detected by Transwell assay.Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs Scr/A549 cells.圖4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染siPLIN3后A549細(xì)胞的侵襲能力

圍脂滴蛋白高度磷酸化，定位于脂滴表面，可以通過調(diào)節(jié)脂肪組織中甘油三酯的代謝調(diào)節(jié)脂滴脂解和脂肪的分解［4，13］。越來越多的證據(jù)表明，肥胖增加了患腫瘤的風(fēng)險，在肥胖狀態(tài)下，脂肪組織或細(xì)胞分泌信號因子影響腫瘤進(jìn)展，并阻礙了腫瘤的治療［14-16］。在哺乳動物中，圍脂滴蛋白家族由5 個成員組成：PLIN1、PLIN2、PLIN3、PLIN4和PLIN5。PLIN1 已被證實(shí)是脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)因子，PLIN1基因突變可能導(dǎo)致小鼠和人類嚴(yán)重的代謝紊亂，如脂肪營養(yǎng)不良、血脂異常、胰島素抵抗型糖尿病和早熟急性冠狀動脈綜合征［5，17］。PLIN2已被報道為腎癌篩查和預(yù)后的生物標(biāo)志物［18］，且PLIN2可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的含量和脂滴的大小，敲減PLIN2的表達(dá)可降低促動脈粥樣硬化和促炎癥基因的表達(dá)［19］。近年來發(fā)現(xiàn)PLIN3 可以調(diào)節(jié)脂滴的發(fā)生，并且發(fā)現(xiàn)PLIN3表達(dá)上調(diào)與腎透明細(xì)胞癌不良預(yù)后相關(guān)［20］。PLIN4 已被報道可作為化學(xué)耐藥性三陰性乳腺癌的生物標(biāo)記物［21］。PLIN5可通過抑制脂解維持脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，其在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)，可以為肝細(xì)胞癌的診斷和治療奠定基礎(chǔ)［22］。

本研究表明PLIN3 高表達(dá)提示LUAD 臨床預(yù)后較差，其表達(dá)差異與LUAD 的分級和分期密切相關(guān)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PLIN3 在肺腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，且PLIN3 可促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞侵襲。根據(jù)數(shù)據(jù)庫分析和實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PLIN3的表達(dá)可作為LUAD 臨床診斷的有效評價指標(biāo)。然而，本研究沒有進(jìn)一步探討PLIN3促進(jìn)LUAD 侵襲的具體分子機(jī)制，這是本研究的局限性之一，需要未來更多實(shí)驗(yàn)研究來證實(shí)。