降低腦脊液miR-16的水平對大鼠抑郁樣行為的影響*

李桂萍， 宋明芬， 李 靜， 王晟東， 劉 義， 劉文娟， 胡霖霖， 張永華

（杭州市第七人民醫(yī)院 1老年科，2分子生物學(xué)實驗室，3心身科，浙江杭州310013；4杭州市中醫(yī)院內(nèi)科，浙江杭州310007）

目前普遍認為抑郁癥的發(fā)病是遺傳和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果［1-2］。作為表觀遺傳學(xué)中的重要分子，微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是真核生物體內(nèi)一種內(nèi)源性的、長約20～25 nt、具有調(diào)控基因表達功能的非編碼 RNA［3］。目前，多個 miRNAs 被報道可能參與了抑郁癥發(fā)病過程中的基因表達調(diào)節(jié)［2-4］，例如，miR-16 因其序列與5-羥色胺轉(zhuǎn)運體（serotonin transporter，SERT）的3'端非翻譯區(qū)匹配，從而可能在翻譯水平調(diào)節(jié)SERT的表達，并介導(dǎo)抗抑郁藥的療效發(fā)揮［5-6］；miR-135a 則能同時調(diào)節(jié) SERT 和5-HT1a 受體基因表達，與轉(zhuǎn)基因小鼠的焦慮或抑郁樣行為改變相關(guān)［7］；另外，miR-1202因參與調(diào)節(jié)代謝型谷氨酸受體4 的表達，被認為與抑郁癥的病理機制及其抗抑郁藥的療效相關(guān)［8］。

近年來，我們研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者及抑郁大鼠模型腦脊液中 miR-16 水平降低［9-10］，且腦脊液中miR-16 水平的大幅下降可導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)抑郁樣行為［10］。為進一步明確miR-16 在抑郁癥發(fā)病機制中的作用，本實驗通過人為降低腦脊液中miR-16 至不同水平，著重探討其與中縫核miR-16 與SERT 水平的劑量反應(yīng)關(guān)系，并觀察對抑郁行為學(xué)指標的影響，為探明抑郁癥發(fā)病機制并確定生物標志物提供參考。

材料和方法

1 動物

無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級健康雌性 Sprague-Dawley（SD）大鼠 50 只，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，動物合格證號為SCXK（浙）2014-0001，8 周齡，體重200～250 g。飼養(yǎng)室溫度（25±1）℃，相對濕度（55±5）%，12 h/12 h 明暗交替，充足的水和食物供大鼠自由攝入。

2 方法

2.1 動物分組 將大鼠隨機分為空白對照（saline）組、陰性對照（negative control）組及miR-16 拮抗劑5 nmol組、10 nmol組和20 nmol組，每組10只。

2.2 側(cè)腦室注射 大鼠在4%異氟烷（流速1 L/min）誘導(dǎo)麻醉后，固定于腦立體定位儀（購自瑞沃德生命科技有限公司），2%異氟烷（流速0.5 L/min）維持麻醉，定位側(cè)腦室注射點（上切牙板平面比耳間線平面低2.4 mm，保持前囟點后1.2 mm，中線旁開2 mm，深4 mm）。在側(cè)腦室注射點用牙科鉆開一小孔，用牙托粉和502 膠混合，固定導(dǎo)管，用于注射溶液。將一次性7 號注射針頭剪成長約5 mm 的導(dǎo)管，把插入口磨光滑，并配備略小于導(dǎo)管內(nèi)徑的尼龍線內(nèi)芯，用于注射后堵塞導(dǎo)管口，防止感染和腦脊液漏，注射體積為20 μL，miR-16拮抗劑（由上海吉瑪基因合成）3 個劑量組分別注射miR-16 拮抗劑5、10、20 nmol，陰性對照組和空白對照組大鼠分別注射等量陰性對照液（上海吉瑪基因）和生理鹽水，隔天注射1次，共3 次。本次實驗的miR-16 拮抗劑采用miR-16 antagomir，其經(jīng)過特殊化學(xué)修飾，在動物體內(nèi)外具有很高的穩(wěn)定性和抑制miRNA功能發(fā)揮的效果。

2.3 蔗糖偏好實驗 包括訓(xùn)練和測試2 個部分。在訓(xùn)練實驗中，每籠放置2瓶1%的蔗糖溶液，24 h后將其中1 瓶蔗糖溶液換成自來水，24 h 后進行測試。測試階段，每只大鼠單籠飼養(yǎng)，禁食禁水23 h，給予1瓶為1%的蔗糖溶液和1瓶自來水，1 h后，測定蔗糖水和自來水的消耗量。糖水偏好率（%）=糖水消耗量/（糖水消耗量＋自來水消耗量）×100%。

2.4 強迫游泳實驗 采用強迫游泳系統(tǒng)（EthoVision XT）進行實驗，游泳桶為高度50 cm、直徑30 cm的圓柱形透明塑料桶，水溫（25±1）℃，水深30 cm。將大鼠逐一放入水中適應(yīng)15 min 后，取出烘干，置回籠中。24 h 后，再次將大鼠逐一放入水中，每只大鼠攝像頭錄像5 min，記錄在此期間的不動時間。以大鼠漂浮在水中而不掙扎，僅有必要的動作保持頭部在水面以上，或接觸水池底部超過1 s 的時間作為不動的標準。

2.5 腦脊液與中縫核的取材 大鼠麻醉后，頭頸部剪毛，碘伏消毒，沿縱軸切一約2 cm 的切口，鈍性分離頸部背側(cè)肌肉，暴露枕骨大孔，由枕骨大孔進針抽取腦脊液。隨后，剪開顱骨，分離腦組織置于冰上，取下腦干，在腦干正中切取約1 mm 厚的組織，即為中縫核。

2.6 RT-qPCR法測定miR-16的表達水平 通過總RNA提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取腦脊液和中縫核的總RNA，用NanoDrop（Thermo Scientific）測定濃度和純度；取 2 μg 總 RNA 用 cDNA第1 鏈合成試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］反轉(zhuǎn)錄成cDNA，步驟如下：取10 μL 2×miRNA 轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、2 μL 酶溶液，混合，加入2 μg 總RNA，補足水（無RNAase）至20 μL，37℃放置60 min。通過該反應(yīng)，在Poly（A）聚合酶的作用下，miRNAs 3’端加上poly A 尾巴；Oligo（dT）與 Poly A 尾巴結(jié)合；最后，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，將總miRNAs 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取cDNA 進行實時定量熒光PCR 擴增測定miR-16 水平，miRNAs 熒光定量檢測試劑盒（SYBR Green）購自天根生化科技（北京）有限公司。miR-16的正向引物序列為5'-TAGCAGCACGTAAATTGGCG-3'，反向引物從miRNAs熒光定量檢測試劑盒中獲得，序列未顯示。反應(yīng)體系為20 μL，包含10 μL 2×反應(yīng)緩沖液、0.5 μL 正向引物（終濃度0.25 μmol/L）、0.5 μL 反向引物（終濃度 0.25 μmol/L）、1 μL cDNA 模板、1 μL ROX 染料、7 μL 水（無 RNAase）。PCR 擴增程序為94℃ 2 min 預(yù)變性；然后94℃ 20 s、52℃ 30 s、72℃ 30 s，循環(huán) 35 次。熒光 PCR 儀購自 ABI（型號 StepOne Plus），獲得 Ct值，并根據(jù)內(nèi)參照 U6 計算 miR-16 的相對含量。

2.7 Western blot法測定SERT蛋白的表達 使用總蛋白提取試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）提取中縫核組織的總蛋白，并且通過BCA 法對蛋白進行定量。取8 μL蛋白提取液（約50 μg）與2 μL 5×上樣緩沖液混合后，置于沸水中5 min，使蛋白變性，冷卻至室溫后，上樣至SDS-PAGE 膠的加樣孔中，100 V 電泳2 h（電泳裝置為Bio-Rad 生產(chǎn)）。電泳結(jié)束后，用轉(zhuǎn)膜裝置在300 mA 電流下將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。PVDF 膜經(jīng)封閉后，進行I抗和II抗孵育，然后進行化學(xué)發(fā)光、顯影和定影?？筍ERTI抗和II 抗均購自Santa Cruz。使用ChemiDocTMXRS+分子成像儀（Bio-Rad）進行蛋白條帶分析，并用內(nèi)參照β-actin 校正，得出SERT蛋白的相對水平。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，5 組間腦脊液miR-16 和中縫核miR-16、中縫核SERT 水平及抑郁樣行為指標的比較采用方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗，組內(nèi)治療前后比較采用配對t檢驗，3 個劑量拮抗劑組間的劑量反應(yīng)關(guān)系分析采用Spearman偏相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 腦脊液中miR-16水平的變化

空白對照組與陰性對照組比較，腦脊液中miR-16 水平的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＞0.05）；拮抗劑5 nmol 組、10 nmol 組和 20 nmol 組 miR-16 水平均顯著低于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05），見圖1。腦脊液中miR-16 水平與拮抗劑的注射劑量呈負相關(guān)關(guān)系（r=-0.92，P＜0.05）。

Figure 1.Relative miR-16 level in cerebrospinal fluid（CSF）of the rats in each group.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs saline group；##P＜0.01 vs negative control group.圖1 各組大鼠腦脊液miR-16水平的比較

2 中縫核miR-16水平的變化

空白對照組與陰性對照組比較，中縫核中miR-16 水平的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＞0.05）；拮抗劑5 nmol 組、10 nmol 組和 20 nmol 組中縫核 miR-16 水平均顯著低于空白對照和陰性對照組（P＜0.05），見圖2。中縫核miR-16 水平與拮抗劑的注射劑量呈負相關(guān)關(guān)系（r=-0.57，P＜0.05）。

Figure 2.Relative miR-16 levels in raphe nuclei of the rats in each group.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs saline group；##P＜0.01 vs negative control group.圖2 各組大鼠中縫核miR-16水平的比較

3 中縫核SERT的蛋白水平變化

與陰性對照組比較，空白對照組中縫核中SERT蛋白水平的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＞0.05）；拮抗劑5 nmol 組、10 nmol 組和 20 nmol 組中縫核 SERT 蛋白水平均顯著高于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05或P＜0.01），見圖3。中縫核SERT 蛋白水平與拮抗劑的注射劑量呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.49，P＜0.05）。

Figure 3.Western blot was used to determine the protein levels of SERT in the raphe nuclei of rats with different treatments.Mean±SD. n=10.*P＜0.05，**P＜0.01 vs saline group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs negative control group.圖3 Western blot檢測各組中縫核SERT的蛋白水平

4 行為學(xué)指標的變化

采用蔗糖偏好實驗和強迫游泳實驗評價大鼠的抑郁樣行為。注射前，蔗糖偏好率和不動時間在各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＞0.05）。注射后，兩指標的組間差異顯著（P＜0.05），其中10 nmol組和20 nmol 組的蔗糖偏好率明顯低于空白對照組、陰性對照組及同組注射前（P＜0.05，P＜0.01），不動時間明顯長于空白對照組、陰性對照組及同組注射前（P＜0.01）。3個劑量組之間比較，隨著注射劑量的增加，蔗糖偏好率顯著降低、不動時間則明顯延長（P＜0.05，P＜0.01）。見表1。

討 論

研究證實，許多miRNAs在神經(jīng)系統(tǒng)中的特異表達，與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、分化、生長、記憶、突觸可塑性及生物鐘調(diào)節(jié)等密切相關(guān)［11-12］，其中，miR-16 被認為與抑郁癥的關(guān)系十分密切。2010 年，Baudry 等［6］在《Science》上發(fā)表論文稱，1C11 神經(jīng)內(nèi)分泌細胞系有兩個分化方向，即分泌去甲腎上腺素的細胞系和分泌5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）的細胞系，其中分泌去甲腎上腺素的細胞系miR-16 表達水平低，但是SERT 合成增加；而分泌5-HT 的細胞系則相反，由此作者首次提出miR-16 與SERT 的靶標關(guān)系；另外，該研究還指出選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑（selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs）氟西汀通過miR-16 介導(dǎo)了SERT 蛋白的抑制性表達。而后，又有研究者以人肺癌上皮細胞A549、人胎盤絨膜癌細胞系JAR及大鼠中縫核神經(jīng)元細胞系RN46A為研究對象來研究miR-16 與SERT 的靶標關(guān)系，結(jié)果表明，miR-16 通過下調(diào)SERT基因的表達而影響5-HT遞質(zhì)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)［13-14］。

基于miR-16 對SERT基因表達的調(diào)節(jié)作用，miR-16 可能參與抑郁癥的病理生理過程。但是，抑郁癥患者血液中miR-16 的水平與健康對照比較無統(tǒng)計學(xué)差異［10］，分析原因，可能是由于血液中的miR-16 受體內(nèi)外多種因素的影響，其在抑郁癥患者和健康對照間的差異已不甚明顯，從而限制了其在抑郁癥發(fā)病中的作用。

眾所周知，腦脊液因其所在的部位及其生理學(xué)作用，比血液能更好地反應(yīng)大腦病理過程中的各項指標變化［15-16］。在脊椎動物體內(nèi)，腦組織內(nèi)有豐富的miRNAs［17］，一方面提示 miRNAs 可能在腦功能的發(fā)揮中起著重要作用，另一方面，腦脊液miRNAs 的表達水平可能有別于血液miRNAs，它或許能反映腦組織中的某些變化。已有研究者指出，腦脊液中的miRNAs 可能參與某些神精疾病的病理過程，如阿爾茨海默病患者［18］和帕金森氏病患者［19］的腦脊液中，均有miRNAs 的表達異常，miRNAs 可能成為這些疾病的生物標志［20］。在抑郁癥方面，Wan 等［21］對抑郁癥患者腦脊液中miRNAs 進行了檢測，發(fā)現(xiàn)血清中miR-221-3p，miR-34a-5p和let-7d-3p 水平高于健康對照，而miR-451a 水平低于健康對照。我們研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者的腦脊液miR-16 水平明顯低于健康對照組［10］，另外，我們建立慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）模型，檢測了該模型大鼠腦脊液中miR-16 的水平，也得出其水平低于對照組大鼠的結(jié)果［9］。

表1 各組大鼠蔗糖偏好率與不動時間的比較Table 1.Sucrose preference rates and immobility time among each group（Mean±SD. n=10）

miRNA 拮抗劑成為近年來研究miRNA 沉默作用的重要手段，它是根據(jù)miRNA 成熟體序列而設(shè)計的單鏈RNA，通過與體內(nèi)成熟miRNA 結(jié)合，阻止miRNA 與其靶基因mRNA 的互補配對的同時，引起miRNA 降解，從而抑制miRNA 發(fā)揮作用。為進一步驗證miR-16 在抑郁癥發(fā)病機制中的作用，本實驗通過側(cè)腦室注射miRNA 拮抗劑，探討人為降低腦脊液miR-16 至不同水平對中縫核miR-16 和SERT 水平的影響及其劑量反應(yīng)關(guān)系。結(jié)果顯示，各拮抗劑組的腦脊液miR-16 水平和中縫核miR-16 水平與對照組比較，均有不同程度的下降，而中縫核SERT 蛋白水平則增加，該結(jié)果與其他文獻報道一致，即miRNA拮抗劑能有效降低動物體內(nèi)miRNA 水平、提升其靶基因表達［6，22］。但是，目前的研究均未進行劑量反應(yīng)關(guān)系探討，而本實驗得出miR-16 拮抗劑注射劑量與中縫核miR-16 水平呈負相關(guān)關(guān)系、與中縫核SERT蛋白表達呈正相關(guān)關(guān)系，這是本實驗的特色之一。

在抑郁行為學(xué)實驗中，拮抗劑10 nmol 組和20 nmol 組表現(xiàn)出明顯的抑郁樣行為，而5 nmol 組的抑郁樣行為尚不明顯，可能是因為miR-16 的小幅下降尚不能達到引起行為改變的閾值，對此有待進一步研究。

本次實驗中，雖然各劑量組腦脊液miR-16 水平下降明顯，但是中縫核miR-16 和SERT 水平卻變化有限（約10%～20%），其原因可能有以下幾點：（1）注入的miR-16 拮抗劑隨腦脊液流動而分布于其他腦區(qū)，減少了進入中縫核的量；（2）中縫核miR-16 水平下降后，機體啟動負反饋性調(diào)節(jié)，從而使中縫核miR-16 下降不明顯；（3）除了 miR-16 外，SERT基因表達還受其他因素調(diào)節(jié)，比如miR135a［7］。目前的研究顯示，miRNAs 與靶基因并非一一對應(yīng)關(guān)系，即每個miRNA 可以有多個靶基因，而幾個miRNAs 也可以共同調(diào)節(jié)同一個基因［23］。根據(jù)文獻報道，抑郁癥患者血液和腦組織中的miR135a 水平顯著降低；服用抗抑郁藥后，miR135a 水平上調(diào)；miR-135a基因過表達小鼠的中縫核SERT 蛋白表達明顯降低，而miR-135a基因敲除小鼠則相反［7］。因此，基于基因表達調(diào)節(jié)的多因素性，miR-16 水平降低可能在一定程度上影響到SERT基因表達。

本研究存在的不足：（1）只分析了降低腦脊液miR-16 水平對中縫核組織的影響。海馬、前額葉和藍斑核等都可能參與抑郁癥的發(fā)生和發(fā)展［6，11，24］；（2）只分析了對SERT基因的調(diào)節(jié)作用。根據(jù)miRNAs 對基因調(diào)節(jié)的網(wǎng)絡(luò)作用，miR-16 可能還參與其他抑郁癥相關(guān)基因的調(diào)節(jié)［23］；（3）未將 miR-16 與其他 miRNAs（如 miR-135a）結(jié)合來探討對SERT基因表達以及抑郁樣行為的影響。后續(xù)實驗有待針對以上不足，進行深入研究。

總之，本次實驗表明，降低腦脊液miR-16 水平可影響大鼠中縫核miR-16 及SERT基因表達，并與抑郁樣行為相關(guān)，初步探明腦脊液miR-16 作為抑郁癥生物標志物和新治療靶點的可行性。