IL-1RII和IL-1RAcP重組質(zhì)粒對(duì)大鼠自身免疫性心肌炎的作用及機(jī)制*

常 賀， 宋 穎， 劉春曉

（1廈門大學(xué)附屬翔安醫(yī)院老年病科，福建廈門361100；2廈門大學(xué)附屬心血管病醫(yī)院，福建廈門361014；3復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院，福建廈門361015）

心肌炎（myocarditis）是一種嚴(yán)重危害人類健康的心血管疾病，自身免疫介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在心肌炎發(fā)病進(jìn)程中發(fā)揮重要作用［1］。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎（experimental autoimmune myocarditis，EAM）動(dòng)物模型模擬人類心肌炎的臨床過程，急性期出現(xiàn)充血性心衰，病理表現(xiàn)為彌漫性心肌壞死伴大量CD11b+和CD4+T淋巴細(xì)胞及多核巨細(xì)胞的浸潤(rùn)，慢性期進(jìn)展為擴(kuò)張型心肌?。?-3］。研究顯示，CD4+T細(xì)胞及其分泌的多種細(xì)胞因子在EAM中發(fā)揮重要作用，白細(xì)胞介素1（interleukin-1，IL-1）在EAM 初始階段的CD11b+細(xì)胞中高表達(dá)，并可誘導(dǎo)其他炎癥因子的分泌，被認(rèn)為是啟動(dòng)EAM 炎癥的主要細(xì)胞因子［3］。我們前期的研究顯示，導(dǎo)入 IL-1 II 型受體（IL-1 type II receptor，IL-1RII）的重組質(zhì)粒對(duì)EAM有治療作用［4-5］，但具體機(jī)制尚不明確。因此，本研究從體內(nèi)和細(xì)胞水平觀察同時(shí)導(dǎo)入IL-1RII 和IL-1 受體輔助蛋白（IL-1 receptor accessory protein，IL-1RAcP）重組質(zhì)粒對(duì)EAM的治療作用并探討其機(jī)制，為深入闡明心肌炎病人的發(fā)病機(jī)制及指導(dǎo)臨床治療提供參考資料［6］。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性 Lewis 大鼠，SPF 級(jí)，6～8周齡，體重 180～200 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［許可證號(hào)為SYXK（京）2018-0010］。所有大鼠均置于廈門大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF 級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室，溫度16～25℃，濕度50%～70%，動(dòng)物自由攝食水。本研究經(jīng)廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，且動(dòng)物飼養(yǎng)及處理符合廈門大學(xué)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

2 主要試劑與儀器

含結(jié)核桿菌H37Ra 株的完全弗氏佐劑（complete Freund's adjuvant，CFA；Difco）；SwaI、NotI、BamH I和XbaI 限制性核酸內(nèi)切酶，T4 DNA 連接酶，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑（Thermo Fisher Scientific）；Trizol（Invitrogen）；SYBR熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa）；Real-time PCR Master Mix 試劑盒（TOYOBO）；空載質(zhì)粒pUC19、pEGFP-actin 和pEGFP-tubulin（優(yōu)寶生物有限公司）；引物合成（上海生工生物公司）；瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；蛋白酶抑制劑（Roche）；Protein A 瓊脂糖珠（Santa Cruz）；SDS-PAGE 試劑（Solarbio）；IL-1RII 及 IL-1RAcP 抗體（Santa Cruz）；α-tubulin 及 β-actin 抗體（Sigma-Aldrich）；HRP 標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗（北京聯(lián)科生物公司）；HRP 標(biāo)記的羊抗小鼠Ⅱ抗（Jackson）；MyCycler梯度 PCR 儀（Bio-rad）；7500 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀（ABI）；Vivid 7型彩色多普勒血流顯像儀（GE）。

3 方法

3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 （1）構(gòu)建體內(nèi)導(dǎo)入用重組質(zhì)粒 pCAGGS-IL-1RII-Ig（IgG1Fc）-Glu（glucagon 19-29）和pCAGGS-IL-1RAcP-Ig-Glu：采用本實(shí)驗(yàn)室前期一直使用的重組質(zhì)粒pCAGGS-Ig-Glu和對(duì)照質(zhì)粒pCAGGSSP（signal peptide）-Ig-Glu，制備方法如前述［4-5，7］。（2）構(gòu)建體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染用重組質(zhì)粒pUC19-IL-1RII-actin、pUC19-IL-1RAcP-tub、pEGFP-IL-1RII-actin和pEGFPIL-1RAcP-tub。質(zhì)粒載體見圖1，引物序列見表1。

Figure 1.The vectors used for construction of recombinant plasmids.圖1 構(gòu)建重組質(zhì)粒用載體

3.2 EAM 大鼠模型的建立 提純豬心室肌球蛋白溶解于0.3 mol/L 氯化鉀溶液中使得濃度為10 g/L，加入同等體積含結(jié)核桿菌H37Ra 株的CFA，充分混合后，在大鼠雙足底皮下注射上述混合液，每只0.1 mL，以制備EAM模型。

3.3 重組質(zhì)粒的體內(nèi)導(dǎo)入 將實(shí)驗(yàn)大鼠（總計(jì)29只）分成4組：（1）對(duì)照（control）組（n=5）：未免疫、未注射質(zhì)粒的大鼠；（2）EAM+SP 組（n=9）：第0 天免疫大鼠，第6天應(yīng)用流體動(dòng)力學(xué)基因?qū)爰夹g(shù)［4-5，7］，尾靜脈注射pCAGGS-SP-Ig-Glu（800 μg）；（3）EAM+IL-1RII組（n=8）：對(duì)已免疫的大鼠尾靜脈注射pCAGGS-IL-1RII-Ig-Glu（800 μg）；（4）EAM+IL-1RII+IL-1RAcP組（n=7）：對(duì)已免疫的大鼠尾靜脈注射pCAGGS-IL-1RII-Ig-Glu（800 μg）和 pCAGGS-IL-1RAcP-Ig-Glu（800 μg）。第17天處死動(dòng)物，評(píng)估導(dǎo)入以上重組質(zhì)粒對(duì)EAM的作用。

3.4 超聲心動(dòng)圖評(píng)估 第17天對(duì)所有大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg），麻醉后仰臥位固定，采用GE Vivid 7 型彩色多普勒血流顯像儀（探頭頻率14 MHz）行M型經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖檢測(cè)。

3.5 組織病理學(xué)評(píng)估 第17天處死所有大鼠，稱取大鼠體重及心臟干重（去除血液），計(jì)算心重/體重比（ratio of heart weight to body weight，HW/BW；g/g）。獲取心臟組織，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切成5 μm厚度的切片進(jìn)行HE染色。

3.6 心肌中炎癥因子的檢測(cè) 取大鼠心尖組織，Trizol 提取總RNA 并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA（2 μg/20 μL），RT-qPCR 法檢測(cè)心衰標(biāo)志物心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）和腦鈉尿肽（brain natriuretic peptide，BNP），以及炎癥因子TNF-α、IL-2、IFN-γ、TGF-β、IL-10和IL-13的表達(dá)水平，GAPDH 作為內(nèi)參照。擴(kuò)增方法如前述［4-5，7］，引物序列見表1。

3.7 重組質(zhì)粒的體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染 Cos7細(xì)胞（非洲綠猴腎細(xì)胞）鋪于六孔板，每孔約2×105個(gè)，將pUC19-IL-1RII-actin和pUC19-IL-1RAcP-tub各2 μg，與LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑混合，加入 opti-MEM 稀釋至100 μL，混合均勻后，將質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑形成的混合物直接加入培養(yǎng)基中，37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，留取含有IL-1RII和IL-1RAcP 蛋白的培養(yǎng)上清液，于-80℃保存?zhèn)溆?。取pEGFP-IL-1RII-actin 和pEGFPIL-1RAcP-tub 各2 μg，與轉(zhuǎn)染試劑形成的混合物直接加入培養(yǎng)基中，37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，棄上清，添加RIPA 蛋白裂解液30 min，收集細(xì)胞提蛋白，進(jìn)行Western blot 和免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）檢測(cè)。

表1 構(gòu)建質(zhì)粒及RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for plasmid construction and RT-qPCR

3.8 LPS 誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞中炎癥因子的檢測(cè) 將本實(shí)驗(yàn)室存有的H9c2 細(xì)胞（大鼠心肌細(xì)胞株）鋪于6 孔板，每孔約 2×105個(gè)，分成 4 組：（1）對(duì)照（control）組（n=5）：僅為靜息細(xì)胞；（2）LPS 組（n=5）：細(xì)胞中加入 LPS（1 g/L）；（3）LPS+IL-1RII 組（n=5）：細(xì)胞中加入LPS（1 g/L）+含有IL-1RII 蛋白的培養(yǎng)上清液 100 μL；（4）LPS+IL-1RII+IL-1RAcP 組（n=5）：細(xì)胞中加入 LPS（1 g/L）+含有 IL-1RII和IL-1RAcP的培養(yǎng)上清液 100 μL。37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，提取RNA 合成cDNA，RT-qPCR 法測(cè)定炎癥因子TNF-α、IL-2、TGF-β、IL-6、IL-10 及IL-13的表達(dá)水平。

3.9 Western blot 檢測(cè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞 將Cos7 細(xì)胞分成靜息細(xì)胞（control）組、轉(zhuǎn)染pEGFP-IL-1RII-actin（IL-1RII）組、轉(zhuǎn)染 pEGFP-IL-1RAcP-tub（IL-1RAcP）組和共轉(zhuǎn)染pEGFP-IL-1RII-actin+pEGFP-IL-1RAcP-tub（IL-1RII+IL-1RAcP）組。收集細(xì)胞，抽提總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度后，SDSPAGE 分離等量蛋白，冰上行轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，添加BSA 封閉，清洗后添加 anti-IL-1RII（1∶1 000）或 anti-IL-1RAcP（1∶1 000），4℃過夜孵育，添加HRP標(biāo)記的Ⅱ抗（1∶5 000），室溫下孵育2 h，ECL 發(fā)光顯影后置于凝膠成像儀中，GAPDH 為內(nèi)參照，采用ImageJ 軟件對(duì)蛋白表達(dá)灰度進(jìn)行定量分析。

3.10 Co-IP 檢測(cè)目的蛋白的形成 共轉(zhuǎn)染pEGFPIL-1RII-actin+pEGFP-IL-1RAcP-tub 后的 Cos7 細(xì)胞提取的蛋白分成3 份：（1）陰性對(duì)照；（2）加1 μg anti-α-tubulin（1∶1 000）沉淀后孵育anti-IL-1RII 曝光，或加 1 μg anti-β-actin（1∶1 000）沉淀后孵育 anti-IL-1RAcP 曝光；（3）陽(yáng)性對(duì)照（經(jīng)mouse IgG 沉淀的蛋白）。4℃過夜孵育，protein A 瓊脂糖珠加入到與抗體孵育過夜的細(xì)胞裂解液中，4℃孵育2～4 h，使抗體與protein A 瓊脂糖珠偶聯(lián)，將蛋白-抗體復(fù)合物拉下來，最后加入 15 μL 的 2× SDS 上樣緩沖液，經(jīng) SDSPAGE檢測(cè)目的蛋白的形成。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較行單因素方差分析，進(jìn)一步的兩兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 心臟組織病理學(xué)評(píng)估

心臟外觀改變：與control 組比較，EAM+SP 組大鼠可見明顯炎癥充血、水腫伴大面積的心肌壞死（顏色變白），部分大鼠甚至出現(xiàn)心包積液；與EAM+SP組比較，EAM+IL-1RII 組和EAM+IL-1RII+IL-1RAcP組的心肌炎癥程度均有減輕，見圖2A。HE 染色顯示，control組大鼠的心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列緊密，纖維結(jié)構(gòu)排列規(guī)則；而EAM+SP 組大鼠心肌細(xì)胞破碎、壞死，細(xì)胞排列不規(guī)則，心肌纖維斷裂，并伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；EAM+IL-1RII 組和EAM+IL-1RII+IL-1RAcP 組可見破碎和壞死的心肌細(xì)胞有所減少，以心肌纖維化為主，見圖2B。

Figure 2.Assessment of myocardial pathomorphological changes.A：representative heart images；B：HE staining of the ventricular sections.圖2 心臟外觀及HE染色評(píng)價(jià)大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化

2 心功能評(píng)估

第17天行超聲心動(dòng)圖評(píng)估，結(jié)果顯示，與control組比較，EAM+SP 組左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDd）和左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic dimension，LVEDs）顯著增大（P＜0.01），射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）和左室短軸縮短率（fractional shortening，F(xiàn)S）顯著降低（P＜0.01）；與EAM+SP 組比較，EAM+IL-1RII+IL-1RAcP 組LVEDs 顯著縮?。≒＜0.05），EF和FS 有輕度升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與EAM+IL-1RII 組比較，EAM+IL-1RII+IL-1RAcP 組 LVEDd顯著縮?。≒＜0.05），見圖3。

3 HW/BW 和心肌中心衰標(biāo)志物的表達(dá)

與 control組比較，EAM+SP 組大鼠 HW/BW 及心肌中心衰標(biāo)志物ANP 和BNP 的水平均顯著升高（P＜0.01）；與EAM+SP組比較，EAM+IL-1RII組和EAM+IL-1RII+IL-1RAcP 組大鼠 HW/BW 及心肌中 ANP 和BNP水平均顯著降低（P＜0.01），見圖4。

4 心肌中炎癥因子的表達(dá)

RT-qPCR 結(jié)果顯示，與control 組比較，EAM+SP組心肌中 TNF-α、IL-2、IFN-γ和TGF-β 的 mRNA 表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01），IL-4和IL-13的表達(dá)水平輕度降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與EAM+SP 組比較，EAM+IL-1RII組TNF-α和IL-2的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），IL-4 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），EAM+IL-1RII+IL-1RAcP 組 TNF-α、IL-2、IFN-γ 和TGF-β 的表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01），IL-4 和IL-13 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），尤其是IL-13 的水平較 EAM+IL-1RII 組顯著升高（P＜0.01），見圖5E、F。

Figure 3.Echocardiogram for determining cardiac structutre and function of the rats in each group.A：left ventricular end-diastolic diameter（LVEDd）；B：left ventricular end-systolic diameter（LVEDs）；C：left ventricular ejection fraction（EF）；D：left ventricular fractional shortening（FS）.Mean±SD. **P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs EAM+SP group；△P＜0.05 vs EAM+IL-1RII group.圖3 超聲心動(dòng)圖測(cè)定大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能

Figure 4.Assessment of ratio of heart weight to body weight（HW/BW；A），and ANP（B）and BNP（C）mRNA expression in the heart.Mean±SD.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs EAM+SP group.圖4 大鼠心臟重量/體重比及心肌中ANP和BNP的表達(dá)

5 LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)

RT-qPCR 結(jié)果顯示，與 control 組比較，LPS 刺激細(xì)胞后TNF-α、TGF-β、IL-2和IL-6的mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01），提示LPS成功誘導(dǎo)了細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)；進(jìn)一步加入含有IL-1RII和IL-1RAcP 的培養(yǎng)上清后，與LPS 組比較，LPS+IL-1RII 組和LPS+IL-1RII+IL-1RAcP組TGF-β和IL-6的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），IL-10 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與LPS+IL-1RII組比較，LPS+IL-1RII+IL-1RAcP組TNF-α 和IL-2 的表達(dá)水平降低得更顯著（P＜0.05），IL-13的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），見圖6。

Figure 5.The expression of inflammatory factors in rat myocardial tissues.The relative mRNA levels were detected by RT-qPCR and normalized to the internal control GAPDH.A：TNF-α；B：IL-2；C：IFN-γ；D：TGF-β；E：IL-4；F：IL-13.Mean±SD.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs EAM+SP group；△△P＜0.01 vs EAM+IL-1RII group.圖5 大鼠心肌中炎癥因子的表達(dá)

6 IL-1RII和IL-1RAcP質(zhì)粒被成功轉(zhuǎn)染入細(xì)胞

Western blot 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染IL-1RII或IL-1RAcP一種質(zhì)粒后，檢測(cè)到IL-1RII或IL-1RAcP 的蛋白表達(dá)量均比control 組升高，提示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功；而共轉(zhuǎn)染IL-1RII和IL-1RAcP兩種質(zhì)粒后 ，IL-1RII和IL-1RAcP 的表達(dá)量均比單獨(dú)轉(zhuǎn)染一種質(zhì)粒的表達(dá)量更高，提示兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染成功，見圖7。

7 IL-1RII/IL-1RAcP異源二聚體的形成

樣品均為共轉(zhuǎn)染IL-1RII 和IL-1RAcP 兩種重組質(zhì)粒后提取的蛋白，且被分為3份。圖8A 中，1為陰性對(duì)照，2 為目的蛋白（經(jīng)anti-α-tubulin 沉淀的蛋白加anti-IL-1RII），3 為陽(yáng)性對(duì)照（經(jīng)mouse IgG 沉淀的蛋白），Co-IP 結(jié)果顯示，第2 列在約56 kD 處（rat IL-1RII 的分子量為46 kD，rat IL-1RAcP 的分子量為66 kD）檢測(cè)到一個(gè)新的蛋白條帶。在圖8B 中，1 為陰性對(duì)照，2為陽(yáng)性對(duì)照（經(jīng)mouse IgG 沉淀的蛋白），3為目的蛋白（經(jīng)anti-β-actin 沉淀的蛋白加anti-IL-1RAcP），Co-IP 結(jié)果顯示，第 3 列在約 56 kD 處檢測(cè)到一個(gè)新的蛋白條帶。這些結(jié)果提示IL-1RII 和IL-1RAcP兩者結(jié)合形成了一個(gè)新的異源二聚體。

討 論

本研究首先從體內(nèi)水平評(píng)估了導(dǎo)入IL-1RII 和IL-1RAcP 重組質(zhì)粒對(duì)EAM 的作用，我們前期構(gòu)建了質(zhì)粒pCAGGS-Ig-Glu 和對(duì)照質(zhì)粒pCAGGS-SP-Ig-Glu［4-5，7］，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了重組質(zhì)粒 pCAGGS-IL-1RII-Ig-Glu 和pCAGGS-IL-1RAcP-Ig-Glu。構(gòu)建質(zhì)粒載體時(shí)融合了IgG1Fc 片段，不僅可以使得目的基因獲得更長(zhǎng)的循環(huán)半衰期并具有免疫球蛋白的特性，還可以使之與配體有更強(qiáng)的親和力及維持血中持續(xù)高濃度水平。另外，為了檢測(cè)質(zhì)粒導(dǎo)入后的血中濃度，我們?cè)谫|(zhì)粒載體上融合了glucagon 19-29 片段，這樣通過檢測(cè)血中g(shù)lucagon 的濃度可以間接反映重組質(zhì)粒導(dǎo)入體內(nèi)后的濃度［5］。

我們前期的研究已顯示，尾靜脈注射IL-1RII 重組質(zhì)粒后，在肝臟和心臟組織中均檢測(cè)到過表達(dá)，證明質(zhì)粒被有效穩(wěn)定地導(dǎo)入EAM 大鼠體內(nèi)［4-5］。本研究結(jié)果顯示，尾靜脈注射IL-1RII和IL-1RAcP 兩種重組質(zhì)粒后，與EAM+SP 組相比，EAM+IL-1RII 組和EAM+IL-1RII+IL-1RAcP組大鼠EAM 均顯著減輕，表現(xiàn)為左室內(nèi)徑縮小，HW/BW 減小，心衰標(biāo)志物ANP和BNP 水平降低，心肌中炎癥因子TNF-α、IL-2、IFN-γ和TGF-β表達(dá)降低，IL-4和IL-13的表達(dá)升高，尤其是同時(shí)導(dǎo)入兩種質(zhì)粒能夠更強(qiáng)力地抑制炎癥因子的表達(dá)。我們前期的研究顯示，多種炎癥因子如IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-17、IL-6 等在 EAM 早期的急性炎癥階段高表達(dá)，在促進(jìn)炎癥方面起主導(dǎo)作用［8-9］；而IL-13、IL-10、IL-4 等因子在 EAM 中后期的細(xì)胞免疫反應(yīng)階段高表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用而緩解EAM［10-11］。IL-1是一種T淋巴細(xì)胞激活因子，主要產(chǎn)生于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等，是調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫的主要致炎細(xì)胞因子，并且可以誘導(dǎo)其他一些炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、MCP-1、IL-6 等的激活，故被認(rèn)為是炎癥的主要效應(yīng)因子，其中IL-1β是炎癥和宿主防御的重要調(diào)節(jié)因子，在促進(jìn)炎癥和自身免疫等方面起主導(dǎo)作用［12］。IL-1RII和IL-1RAcP 是 IL-1 受體家族中的重要成員，IL-1RI 是功能性受體，當(dāng)與IL-1β 結(jié)合時(shí)具有較高的親和力，可以招募IL-1RAcP 形成異源二聚體從而發(fā)揮促炎作用；相反，IL-1RII作為抑制性受體，因其胞內(nèi)缺乏Toll 樣受體區(qū)域，可以與IL-1RI競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合IL-1β，故IL-1RII與IL-1RAcP結(jié)合形成異源二聚體后，在一些炎癥性疾病中通過抑制IL-1 而發(fā)揮抗炎作用［12-13］。在本研究中，我們檢測(cè)了轉(zhuǎn)染IL-1RII 和IL-1RAcP 重組質(zhì)粒后獲取的培養(yǎng)上清對(duì)LPS 誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞中炎癥因子的作用，結(jié)果顯示，與 LPS 組比較，LPS+IL-1RII 組和 LPS+IL-1RII+IL-1RAcP 組 TGF-β和IL-6 表達(dá)水平顯著降低，IL-10表達(dá)水平顯著升高，尤其是LPS+IL-1RII+IL-1RAcP組TNF-α 和IL-2 的水平顯著降低。因此本研究不僅在體內(nèi)水平證明了IL-1RII 和IL-1RAcP 對(duì)EAM 有更強(qiáng)的抗炎作用，而且在細(xì)胞水平也證明了兩種蛋白可更強(qiáng)力地抑制炎癥因子的表達(dá)，這是對(duì)抗炎作用機(jī)制的初步闡明。

Figure 6.The expression of inflammatory factors in LPS-induced H9c2 cells.The relative mRNA levels were detected by RT-qPCR.A：TNF-α；B：IL-2；C：TGF-β；D：IL-6；E：IL-10；F：IL-13.Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs LPS+IL-1RII group.圖6 LPS介導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)

Figure 7.Identification of recombinant plasmid transfection into cells.A：the protein expression of IL-1RII；B：the protein expression of IL-1RAcP.Cos7 cells were transfected with recombinant plasmids pEGFP-IL-1RII-actin（IL-1RII group），pEGFPIL-1RAcP-tub（IL-1RAcP group）or pEGFP-IL-1RII-actin and pEGFP-IL-1RAcP-tub（IL-1RII+IL-1RAcP group）.The protein levels were detected by Western blot，and GAPDH served as internal control.圖7 Western blot鑒定重組質(zhì)粒被成功轉(zhuǎn)染入細(xì)胞

Figure 8.Detection of IL-1RII/IL-1RAcP heterodimer formation by Co-IP.A：proteins precipitated by anti-α-tubulin plus anti-IL-1RII；B：protein precipitated by anti-β-actin plus anti-IL-1RAcP.Cos7 cells were co-transfected with recombinant plasmids pEGFP-IL-1RII-actin and pEGFP-IL-1RAcP-tub.圖8 免疫共沉淀檢測(cè)IL-1RII/IL-1RAcP異源二聚體的形成

為進(jìn)一步明確IL-1RII 和IL-1RAcP 兩者是否可以相互結(jié)合形成異源二聚體，我們將IL-1RII 和IL-1RAcP 兩種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，Co-IP檢測(cè)到一個(gè)新的融合蛋白，間接驗(yàn)證了兩者相互結(jié)合形成了異源二聚體。二聚體是兩種蛋白質(zhì)相互作用的形式，可以看作是兩種功能相關(guān)或結(jié)構(gòu)相似的亞單位組成的一種蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物。若組成二聚體的兩種亞單位的結(jié)構(gòu)和功能完全相同則稱為同源二聚體，若結(jié)構(gòu)或功能不完全相同則稱為異源二聚體。目前關(guān)于IL-1RII/IL-1RAcP 異源二聚體的研究相對(duì)較少。Hanawa 等［14］在細(xì)胞水平用分離純化的方法，不僅鑒定了IL-1RII/IL-1RAcP異源二聚體的存在，而且發(fā)現(xiàn)此異源二聚體較IL-1 受體拮抗劑（IL-1 receptor antagonist，IL-1Ra）對(duì) IL-1 有更強(qiáng)的抑制作用。Wang 等［15］解析了 IL-1β 與 IL-1RII/IL-1RAcP 異源二聚體結(jié)合的空間晶體結(jié)構(gòu)，生化分析表明，IL-1β-IL-1RI和IL-1β-IL-1RII 與 IL-1RAcP 的結(jié)合具有一定的相似性，同時(shí)也明確了IL-1Ra 對(duì)IL-1 的重要拮抗作用，為IL-1 受體家族的激活提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。Ge等［16］進(jìn)一步解析了 IL-1RII/IL-1RAcP 異源二聚體的結(jié)構(gòu)功能域，明確了IL-1受體家族在細(xì)胞外區(qū)含有3個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域（D1～D3），負(fù)責(zé)傳遞IL-1 細(xì)胞因子的多向信號(hào)，并應(yīng)用小角度X 射線散射技術(shù)證明了配體結(jié)合的共受體由于D2/D3 連接體而具有固有的結(jié)構(gòu)域間靈活性，表明了D2/D3連接體是IL-1受體重要的功能決定因素，并強(qiáng)調(diào)了結(jié)構(gòu)域間靈活性在細(xì)胞因子/受體結(jié)合和信號(hào)傳遞中的重要作用。這些研究從空間結(jié)構(gòu)上解析了IL-1RII 和IL-1RAcP兩者可以結(jié)合形成異源二聚體，但未對(duì)功能進(jìn)行深入探討。本實(shí)驗(yàn)首次在體內(nèi)水平評(píng)估了導(dǎo)入IL-1RII和IL-1RAcP 重組質(zhì)粒對(duì)EAM 的作用，并且從機(jī)制上進(jìn)行了初步探討，鑒定了IL-1RII和IL-1RAcP 兩者可以相互結(jié)合形成異源二聚體，并觀察了對(duì)炎癥因子表達(dá)的影響。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)IL-1RII和IL-1RAcP 重組質(zhì)粒導(dǎo)入可有效緩解大鼠EAM 的炎癥損傷，其機(jī)制與兩者結(jié)合形成異源二聚體并強(qiáng)力抑制炎癥因子的表達(dá)有關(guān)。關(guān)于異源二聚體的功能區(qū)解析以及異源二聚體的作用，還有待后續(xù)進(jìn)一步探究。