健肝消脂方醫(yī)院制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)初步研究

房昉 溫偉波 楊齡 謝雪華 陶麗玲

摘要：目的 初步建立健肝消脂方醫(yī)院制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用薄層色譜法分別定性鑒別該醫(yī)院制劑中的三七、赤芍、青皮、黃芪，采用高效液相色譜法定量測(cè)定該醫(yī)院制劑中丹酚酸B的含量。結(jié)果 在選定的薄層色譜條件下，供試品色譜與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，分離效果較好，專(zhuān)屬性強(qiáng)。高效液相色譜法測(cè)定丹酚酸B的線(xiàn)性范圍在0.101 μg～2.525 μg之間，線(xiàn)性關(guān)系良好（r2=1）。平均回收率為101.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值為0.98%。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便可行、專(zhuān)屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，可作為初步質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)用于控制該制劑的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：健肝消脂方;薄層色譜法;高效液相色譜法;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2020）09-0073-06

Preliminary Study on Quality Standard of Hospital Preparationsof Jiangan Xiaozhi Prescription

FANG Fang1，WEN Wei-bo1，YANG Ling2，XIE Xue-hua1，TAO Li-ling2

（1. The First Affiliated Hospital of Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650021，China;2. Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500，China）

【Abstract】Objective： To preliminarily establish the quality standard of hospital preparation of Jiangan Xiaozhi prescription. Methods： TLC was used to qualitatively identify Panax notoginseng，Radix paeoniae rubra，Pericarpium Citri，and Astragalus membranaceus in the hospital preparation，and the content of salvianolic acid B in the hospital preparation was quantitatively determined by HPLC. Results： Under the selected TLC conditions，spots of the same color appeared on the corresponding positions of the chromatogram of the test substance and the chromatogram of the reference substance，with good separation effect and strong specificity. The linear range of salvianolic acid B measured by HPLC was between 0.101 μg～2.525 μg，and the linear relationship is good （r2=1）. The average recovery rate was 101.7%，and the relative standard deviation value was 0.98%. Conclusion： The method is simple and feasible，with strong specificity and good reproducibility，and can be used as a preliminary quality standard to control the quality of the preparation.

【Key words】Jiangan Xiaozhi prescription，TLC，HPLC，quality standard

健肝消脂方是由云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院溫偉波主任醫(yī)師根據(jù)其多年診治非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的臨床經(jīng)驗(yàn)所擬定。目前該方已在臨床上得到了廣泛應(yīng)用，臨床療效優(yōu)良。該方由丹參、三七、赤芍、青皮、黃芪等十二味中藥組成，具有活血化痰、健肝消脂的功效。但其湯劑劑型臨床服用不便，為便于患者服用，我們以顆粒劑的形式制備了健肝消脂方醫(yī)院制劑，并采用薄層色譜法（Thin Layer Chromatography，TLC）對(duì)方中三七、赤芍、青皮、黃芪進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）對(duì)丹參中丹酚酸B（Salvianolic acid B，Sal B）的含量進(jìn)行定量測(cè)定，以期為有效地控制健肝消脂方醫(yī)院制劑的質(zhì)量提供方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-2030高效液相色譜儀（日本島津公司），CPA225D分析天平（德國(guó)賽多利斯公司），KQ-500B超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑試藥 三七（批號(hào)：20180701）、赤芍（批號(hào)：20180901）、青皮（批號(hào)：20180701）、黃芪（批號(hào)：20180902）飲片（均購(gòu)自昆明道地中藥飲片廠(chǎng)，符合2015年版《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)）。丹酚酸B（批號(hào)：111562-201716）、人參皂苷Rb1（批號(hào)：110704-201827）、人參皂苷Rg1（批號(hào)：110703-201832）、三七皂苷R1（批號(hào)：110745-201820）、芍藥苷（批號(hào)：110736-201943）、橙皮苷（批號(hào)：110721-201818）、黃芪甲苷（批號(hào)：110781-201717）（均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院）;薄層層析用硅膠G（青島海洋化工有限公司）;甲醇[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，批號(hào)：178507]、乙腈（Sigma-Aldrich Co，LLC，批號(hào)：WXBC9206V）均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 三七TLC鑒別 根據(jù)《國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編》所載三七脂肝丸的國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)[WS-10285（ZD-0285）-2002]及《中華人民共和國(guó)藥典》相關(guān)內(nèi)容[1]進(jìn)行操作。

2.1.1 供試品溶液制備 取健肝消脂方醫(yī)院制劑10 g，研細(xì)，加乙醚50 mL，浸漬1 h，超聲處理5 min，濾過(guò)，棄去乙醚液，藥渣揮干乙醚，加水飽和的正丁醇25 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過(guò)，濾液置分液漏斗中，用正丁醇飽和的氨試液洗2次，每次20 mL，放置分層，分取正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。

2.1.2 陰性樣品溶液制備 按處方取除去三七以外的藥材，按照制備方法制成揮發(fā)油包合物及提取浸膏，按照制備處方比例混合輔料，稱(chēng)取適量，按照2.1.1制備方法制成陰性樣品溶液。

2.1.3 對(duì)照品溶液制備 取人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1對(duì)照品，分別加甲醇制成每1 mL各含0.5 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.4 鑒別方法 吸取上述三種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15：40：22：10）10℃以下放置的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以硫酸乙醇溶液（1→10），在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣品溶液無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

2.2 赤芍TLC鑒別[1]

2.2.1 陰性樣本溶液制備 按處方取除去赤芍以外的藥材，按照制備方法制成揮發(fā)油包合物及提取浸膏，按照制備處方比例混合三七粉、輔料，稱(chēng)取適量，按照2.1.1方法制成陰性樣品溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 取芍藥苷對(duì)照品，加乙醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.3 鑒別方法 吸取2.1.1項(xiàng)下的供試品溶液、2.2.1項(xiàng)下陰性樣品溶液和2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40：5：10：0.2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性溶液無(wú)干擾，見(jiàn)圖2。

2.3 青皮TLC鑒別[1]

2.3.1 供試品溶液制備 取健肝消脂方醫(yī)院制劑10 g，研細(xì)，加水40 mL浸泡15 min，時(shí)時(shí)振搖，濾過(guò)，濾液加乙醚振搖洗滌3次，每次30 mL，水層加乙酸乙酯振搖提取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯提取液，濃縮至2 mL，作為供試品溶液。

2.3.2 陰性樣品溶液制備 按處方取除去青皮以外的藥材，按照制備方法制成揮發(fā)油包合物及提取浸膏，按照制備處方比例混合三七粉、輔料，稱(chēng)取適量，按照2.3.1制備方法制成陰性樣品溶液。

2.3.3 對(duì)照品溶液制備 取橙皮苷對(duì)照品，加乙酸乙酯制成1 mL含0.1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3.4 鑒別方法 吸取上述三種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一用0.5%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（32：17：5）的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴于1%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外燈（365nm）下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性溶液無(wú)干擾，見(jiàn)圖3。

2.4 黃芪TLC鑒別[2-3]

2.4.1 供試品溶液制備 取健肝消脂方醫(yī)院制劑5 g，研細(xì)，加2%氫氧化鉀甲醇溶液50 mL，加熱回流2 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用三氯甲烷-正丁醇（2：1）溶液振搖提取4次，每次15 mL，合并三氯甲烷-正丁醇溶液，加1%磷酸二氫鉀溶液洗滌2次，每次25 mL，三氯甲烷-正丁醇溶液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。

2.4.2 陰性樣品溶液制備 按處方取除去黃芪以外的藥材，按照制備方法制成揮發(fā)油包合物及提取浸膏，按照制備處方比例混合三七粉、輔料，稱(chēng)取適量，按照2.4.1制備方法制成陰性樣品溶液。

2.4.3 對(duì)照品溶液制備取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.4.4 鑒別方法 吸取上述三種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13：7：2）10℃下放置的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性溶液無(wú)干擾，見(jiàn)圖4。

3 定量分析

依據(jù)健肝消脂方醫(yī)院制劑制備方法，丹參采用水提方式，故選擇丹參藥材中水溶性有效成分丹酚酸B為含量測(cè)定指標(biāo)，檢測(cè)方法為HPLC[1]。

3.1 色譜條件 色譜柱：ACE-EXL-121-2546U（C18，250×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（24：76）;檢測(cè)波長(zhǎng)：286nm;流速：1.2 mL/min。此條件下丹酚酸B與其他組分達(dá)到有效分離（r>1.5），理論板數(shù)按丹酚酸B峰計(jì)算應(yīng)不低于6000。

3.2 溶液制備

3.2.1 供試品溶液的制備 取健肝消脂方醫(yī)院制劑適量，研細(xì)，取約2.0 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，再稱(chēng)定重量，用50%甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3.2.2 陰性樣品溶液的制備 按處方比例，稱(chēng)取除丹參以外其他藥材，按照制備方法制成陰性樣品，稱(chēng)取適量，再按照3.2.1的制備方法，制得。

3.2.3 對(duì)照品溶液的制備 取丹酚酸B對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加50%甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

3.3 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液1、5、10、20、25 μL進(jìn)行色譜測(cè)定，測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并以進(jìn)樣量對(duì)峰面積進(jìn)行回歸，得回歸方程為Y=1125797X-2657，r2=1，表明進(jìn)樣量在0.101 μg-2.525 μg范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

3.4 專(zhuān)屬性考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，供試品溶液色譜圖與對(duì)照品色譜圖丹酚酸B有相同保留時(shí)間色譜峰，陰性樣品溶液色譜圖丹酚酸B相應(yīng)位置未見(jiàn)有峰，方中其他藥材、輔料均對(duì)丹酚酸B含量測(cè)定不產(chǎn)生干擾，方法專(zhuān)屬性良好，方法可行。見(jiàn)圖5至圖7。

3.5 穩(wěn)定性考察 取健肝消脂方醫(yī)院制劑適量參照3.2.1制備方法制成供試品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、6、8、12、18、24 h精密吸取注入液相色譜儀，記錄色譜圖，峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）值為0.30%，穩(wěn)定性良好。

3.6 重復(fù)性考察 取健肝消脂方醫(yī)院制劑6份，參照3.2.1制備方法制成供試品溶液，測(cè)定含量，結(jié)果示供試品平均含量為1.69 mg/g，RSD值為1.96%，重復(fù)性良好。

3.7 準(zhǔn)確度考察 采用加樣回收法測(cè)定。取6份已知含量供試品（含量0.12%）約1.0 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，分別加入丹酚酸B對(duì)照品溶液（濃度1.001 mg/mL）0.8、1.2、2.0 mL，加50%甲醇50 mL，稱(chēng)定重量，超聲處理（功率500W，頻率40kHz）30 min，放冷，加50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.8 供試品溶液制備方法考察

3.8.1 提取溶劑考察 取健肝消脂方醫(yī)院制劑約2.0 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，分別加甲醇、80%甲醇、50%甲醇、乙醇各50 mL，稱(chēng)定重量，超聲處理（功率500W，頻率40kHz）30 min，放冷，分別加甲醇、80%甲醇、50%甲醇、乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2試驗(yàn)結(jié)果表明：50%甲醇有效成分提取效率最高，故將供試品溶液制備所用溶劑定為50%甲醇。

3.8.2 提取時(shí)間考察 取健肝消脂方醫(yī)院制劑約2.0 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱(chēng)定重量，分別超聲處理（功率500W，頻率40kHz）60、90 min，放冷，分別加50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

試驗(yàn)結(jié)果表明：50%甲醇為溶劑，采用超聲處理方法，30 min與60 min相近，90 min含量有所降低，可能由于超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而溶液溫度上升有關(guān)，故提取時(shí)間定為30 min。

3.9 樣品測(cè)定 對(duì)3批樣品進(jìn)行含量測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

4 討論

由于本品成分較多，供試品處理較為關(guān)鍵。在制劑的定性分析中，曾對(duì)三七供試品溶液制備方法進(jìn)行研究。供試品未經(jīng)乙醚處理所制備的供試品溶液，經(jīng)試驗(yàn)展開(kāi)后，在與對(duì)照品相應(yīng)的位置上主斑點(diǎn)顯色不清晰;而經(jīng)乙醚處理后，試驗(yàn)效果良好。除此之外，我們?cè)鴮?duì)青皮供試品溶液制備方法進(jìn)行研究，按照《中華人民共和國(guó)藥典》青皮藥材制備方法制備，供試品在與對(duì)照品相應(yīng)的位置上主斑點(diǎn)顯色不清晰，經(jīng)乙醚除雜處理后，試驗(yàn)效果良好。

三七、丹參均是健肝消脂方中的君藥。三七味甘、微苦，性溫，歸肝、胃、心、大腸經(jīng)，具有散瘀之功，傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)用于治療脘脅久痛，癥瘕積塊等病癥;現(xiàn)代研究證實(shí)，三七能夠提高肝組織中超氧化物歧化酶的活性，還可降低血糖，臨床可用于治療高脂血癥、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶增高癥[4]。而中外多部藥典均把人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1作為三七含量測(cè)定的重要標(biāo)準(zhǔn)[5]。丹參味苦、微寒，歸心、心包、肝經(jīng)，具有活血祛瘀之功，傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)于治療癥瘕積聚等病證;現(xiàn)代研究證實(shí)，丹參具有調(diào)節(jié)血脂、保護(hù)肝損傷、促進(jìn)肝細(xì)胞再生、抗肝纖維化等作用，可用于改善高脂血癥，可用于治療高脂血癥、糖尿病、肝纖維化等疾病[4]。而丹酚酸B是丹參中的重要水溶性酚酸類(lèi)化合物，是丹參的主要有效成分之一，也是丹參質(zhì)量控制的重要指標(biāo)之一[6-8]。

而赤芍、青皮、黃芪則均為健肝消脂方中的臣藥。赤芍味苦，性微寒，歸肝、脾經(jīng)，具有活血祛瘀之功，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)赤芍具有保肝作用，而芍藥苷則是赤芍TLC鑒別的主要對(duì)照品，同時(shí)芍藥苷也是赤芍的主要品質(zhì)標(biāo)志物[4]。青皮味苦、辛，性溫，歸肝、膽、胃經(jīng)，具有消積化滯之功，現(xiàn)代藥理證實(shí)青皮具有保護(hù)肝細(xì)胞的功能，而橙皮苷則是青皮TLC鑒別的主要對(duì)照品，同時(shí)橙皮苷也是青皮的主要品質(zhì)標(biāo)志物[4]。黃芪味甘，性溫，歸肺、脾經(jīng)，具有益氣升陽(yáng)之功，現(xiàn)代藥理研究證實(shí)黃芪具有良好的清除自由基、抗氧化作用，對(duì)于NAFLD模型大鼠，黃芪水煎劑能有效調(diào)節(jié)其血脂水平、保護(hù)肝功能和降低脂質(zhì)過(guò)氧化水平，而黃芪甲苷則是黃芪TLC鑒別的主要對(duì)照品之一，同時(shí)黃芪甲苷也是黃芪的主要品質(zhì)標(biāo)志物之一[4-9]。

中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制是目前中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)難點(diǎn)，而基于質(zhì)量標(biāo)志物（Q-marker）的中藥復(fù)方制劑評(píng)價(jià)方法已經(jīng)受到了廣大學(xué)者的重視[10-11]。我們的研究中，以丹酚酸B、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、芍藥苷、橙皮苷、黃芪甲苷作為健肝消脂方的質(zhì)量標(biāo)志物，采用經(jīng)典方法對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，初步確立了健肝消脂方醫(yī)院制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。但今后仍應(yīng)立足于中藥復(fù)方制劑的已知有效成分及中藥復(fù)方的臨床功效，利用先進(jìn)技術(shù)，進(jìn)一步深入研究該制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。

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（收稿日期：2020-05-07）