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    黑斑蛙腐皮病病原分離、鑒定及致病性研究

    2020-10-26 06:54:35李成偉王均蘇航耿毅
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2020年17期
    關(guān)鍵詞:分離鑒定致病性

    李成偉 王均 蘇航 耿毅

    摘要:為了解黑斑蛙養(yǎng)殖場大規(guī)模暴發(fā)腐皮病的病原,從患病蛙肝臟中分離獲得1株革蘭氏陰性桿菌(編號:QW),對其培養(yǎng)特性、生理生化特性、16S rRNA和gyrB基因檢測、致病性及藥物敏感性進行分析。結(jié)果表明,菌株QW表型特征和理化特性與洛菲不動桿菌相似,16S rRNA和gyrB基因在系統(tǒng)發(fā)育樹上與洛菲不動桿菌聚集為一族,最終判定該菌為洛菲不動桿菌,是黑斑蛙上的一種新病原;致病性研究表明,該菌能夠通過浸泡的方式感染黑斑蛙,具有較強的致病性,發(fā)病癥狀主要表現(xiàn)為皮膚潰爛和內(nèi)臟器官出血,與自然發(fā)病癥狀一致;藥敏試驗表明,洛菲不動桿菌僅對四環(huán)素、氧氟沙星和氟苯尼考3種抗生素敏感。本研究鑒定出引起黑斑蛙腐皮病的病原為洛菲不動桿菌,并對其致病性進行研究,同時檢測了其藥物敏感范圍,為該病臨床防治用藥提供理論依據(jù)。

    關(guān)鍵詞:黑斑蛙;洛菲不動桿菌;分離鑒定;致病性;藥物敏感

    中圖分類號:S947.2 ??文獻標志碼: A ?文章編號:1002-1302(2020)17-0174-05

    黑斑蛙(Pelophylax nigromaculatus)屬無尾目蛙科側(cè)褶蛙屬,在我國華北、華中、華南地區(qū)的平原和丘陵分布較廣泛,也是我國近年來養(yǎng)殖蛙類中的主要品種之一。由于該品種是近年來擴大的養(yǎng)殖規(guī)模[1],相對于其他傳統(tǒng)養(yǎng)殖蛙類如牛蛙、虎紋蛙、美國青蛙的規(guī)?;B(yǎng)殖歷程較短,疾病研究相對較少,發(fā)病后只能參考其他蛙類疾病進行比較處理,但水生動物不同種屬間具有同病不同癥、同癥不同病的特征。如牛蛙、虎紋蛙上常見的白內(nèi)障、歪脖子疾病,這此疾病已報道的病原有氣單胞菌、腦膜敗血伊麗莎白菌、淺黃假單胞菌等[2-3],而在黑斑蛙上的相同癥狀,病原卻出現(xiàn)了肺炎克雷伯菌[4]。因此,應(yīng)對不同品種、病原進一步區(qū)分研究。對于蛙類的腐皮癥,已報道的有牛蛙和棘胸蛙由奇異變形桿菌感染引起[5-6],但黑斑蛙的腐皮病未見相關(guān)報道。2019年6月,四川省內(nèi)江市某黑斑蛙養(yǎng)殖場出現(xiàn)黑斑蛙大面積死亡,主要表現(xiàn)為頭部、背部及四肢出現(xiàn)不同程度的腐爛,剖解可見肝臟腫大、腎臟及肺部出血。本研究對其病原進行分離,并通過病原菌的形態(tài)特征、生理生化特性及16S rRNA和gyrB基因測序與系統(tǒng)發(fā)育分析進行鑒定,確定該病原菌的種屬地位;然后通過人工感染試驗確定該病原菌的致病性;最后通過藥物敏感試驗分析該病原菌的藥物敏感范圍,旨在為該病的臨床防治用藥提供理論參考。

    1 材料與方法

    1.1 試驗對象

    四川省內(nèi)江市某黑斑蛙養(yǎng)殖場的發(fā)病黑斑蛙(25~50 g)頭部、背部及四肢出現(xiàn)不同程度腐爛,剖解可見肝臟腫大出血、腎臟及肺部出血。采集患病典型的黑斑蛙進行實驗室細菌接種;健康黑斑蛙采集于另一黑斑蛙養(yǎng)殖場,實驗室暫養(yǎng)15 d確定健康無病后用于人工感染試驗。

    1.2 主要試劑

    牛腦心浸液培養(yǎng)基(BHI,美國BD公司),細菌生化微量鑒定管(杭州天和微生物試劑有限公司),PCR所用試劑、特異性引物及細菌基因組DNA提取試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司),藥敏試驗紙片(杭州微生物試劑有限公司)。

    1.3 病原菌的分離

    無菌操作接種患病黑斑蛙的肝、脾、腎臟組織劃線于BHI培養(yǎng)基上,于28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48 h后挑取顏色、大小、形態(tài)特征基本一致的優(yōu)勢菌落進一步培養(yǎng)。純化后再轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 分離菌株形態(tài)學與生理生化鑒定

    將純化后的細菌接種至BHI瓊脂平板,于生化培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)24 h,觀察菌落形態(tài)大小,同時對菌體進行革蘭氏染色,光學顯微鏡觀察菌體形態(tài)特征。挑取單個菌落接種于微量生化管中,28 ℃下培養(yǎng)24~48 h,參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[7]和《伯杰細菌鑒定手冊》[8]進行生理生化特性鑒定。

    1.5 16S rRNA和gyrB基因擴增及序列測定

    按照細菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌株基因組DNA作為PCR模板。采用細菌通用引物進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預變性 5 min;94 ℃變性1 min,54 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物純化后送生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定。

    將分離菌株的16S rRNA基因序列和gyrB基因擴增序列與GenBank中已知核酸序列進行Blast分析,調(diào)出與該序列相關(guān)性較高的核酸序列,用MEGA 6.0軟件包中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,重復抽樣1 000次分析系統(tǒng)樹各分枝的置信度。

    1.6 人工感染試驗

    將復壯后的菌株接種到BHI肉湯培養(yǎng)基中,在28 ℃,120 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h后,革蘭氏染色檢驗純度。采用生理鹽水調(diào)整細菌濃度至3.0×108、3.0×107、3.0×106 CFU/mL,將1 L菌液加入黑斑蛙養(yǎng)殖桶中浸泡,對照組加入等量的生理鹽水,每組20只黑斑蛙。連續(xù)觀察14 d,記錄黑斑蛙發(fā)病情況和死亡情況,并分離病原進行鑒定。

    1.7 藥物敏感試驗

    采用藥敏紙片法對分離菌株進行藥敏試驗,采用氨芐西林、青霉素、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、新霉素、阿齊霉素、克拉霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、制霉菌素、恩諾沙星、丁胺卡那、諾氟沙星、氧氟沙星、多粘菌素B、氟苯尼考17種藥物進行藥敏試驗。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 病原菌的分離及生理生化特性

    從患病黑斑蛙的肝臟分離得到1株高純度的優(yōu)勢菌株(編號:QW),其菌落狀態(tài)是灰白色、表面光滑、圓形凸起、邊緣整齊、透明、涂片染色鏡檢可見革蘭氏陰性短桿菌(圖1),生化反應(yīng)結(jié)果見表1。

    2.2 分離菌株的鑒定

    以分離菌株QW的DNA為模板,采用細菌16S rRNA和gyrB基因通用引物進行PCR擴增,經(jīng)電泳檢測和凝膠成像系統(tǒng)后,16S rRNA基因于1 500 bp 左右得到目的條帶(圖2-a),gyrB基因于 1 200 bp 左右得到目的條帶(圖2-b)。經(jīng)測序得到16S rRNA序列1 409 bp(genbank登陸號:MN396229),gyrB基因1 113 bp(genbank登陸號:MN504787)。

    系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示,在16S rRNA序列、gyrB基因序列上,菌株QW上都分別聚在洛菲不動桿菌(Acinetobacter lwoffii)的分支上(圖3、圖4)。結(jié)合生理生化結(jié)果,將菌株QW判定為洛菲不動桿菌。

    2.3 人工感染試驗

    人工浸泡感染連續(xù)觀察14 d,試驗結(jié)果見表2,隨著浸泡菌液濃度的增大,黑斑蛙的死亡率隨之升高,同時病癥周期加快,表現(xiàn)出背部、腿部表皮潰爛(圖5-a),肝臟腫大,腎臟、肺部出血(圖 5-b),與自然發(fā)病癥狀相似,推測洛菲不動桿菌是該病的主要病原,且對黑斑蛙致病性較強。

    2.4 藥敏試驗

    采用紙片擴散法,對菌株QW進行17種藥物敏感性試驗。由表3可知,QW菌株僅對四環(huán)素、氧氟沙星、氟苯尼考3種抗生素敏感;而對慶大霉素、鏈霉素、阿齊霉素、丁胺卡那4種抗生素介于敏感與耐藥之間;其余的10種均為耐藥。

    3 討論

    洛菲不動桿菌是一種可利用環(huán)境中多種營養(yǎng)物質(zhì)作為自身能量來源的需氧型革蘭氏陰性菌,因其適應(yīng)性強,普遍存在于土壤、水及干燥環(huán)境中,且是一種對多種抗生素具有抗性的細菌,一直以來是醫(yī)院感染常見的一種條件性致病菌[9]。洛菲不動桿菌感染包括菌血癥、繼發(fā)性腦膜炎、尿路感染、手術(shù)部位感染、胃炎和肺炎,特別是在重癥監(jiān)護室中[10]。在養(yǎng)殖業(yè)中,洛菲不動桿菌能廣泛引起養(yǎng)殖動物感染,感染包括奶牛子宮內(nèi)膜炎[11]、仔豬肺部感染[12]、禽類呼吸道感染[13]等,水生動物感染相對較少,感染鯉魚[14]、虹鱒[15]、草魚[16],主要表現(xiàn)為敗血癥、胡子鲇“吊頭病”[17]等, 兩棲動物感染的美國青蛙“抽搐癥”[18]、牛蛙腹水病[19]。本試驗表明,洛菲不動桿菌感染黑斑蛙后,主要表現(xiàn)為腐皮和肝臟腫大出血、腎臟出血、肺出血,這與洛菲不動桿菌感染牛蛙癥狀相似[19],感染后黑斑蛙表皮輕微腐爛、肝臟腫大充血,但未出現(xiàn)美國青蛙和牛蛙的腹水、肝臟白色結(jié)節(jié)、腿部充出血斑,證明不同環(huán)境、不同種屬動物感染間存在一定差異。

    水產(chǎn)動物中細菌性疾病的治療最常用且有效的方法為內(nèi)服抗生素,而抗生素的準確使用需要以藥敏試驗結(jié)果作為依據(jù)[20]。相關(guān)研究表明,在人醫(yī)領(lǐng)域洛菲不動桿菌不同地域分離株的耐藥性不同,但大部分菌株對青霉素、頭孢類、復方新諾明表現(xiàn)出強耐藥性,對阿米卡星、亞胺硫霉素、美羅培南敏感[21],但除阿米卡星不能獸用且存在多重耐藥、耐藥率上升較快外,洛菲不動桿菌已成為“超級耐藥菌的潛在菌群”[22]。近幾年,在水生動物上分離的洛菲不動桿菌對廣譜β-內(nèi)酰胺類、碳青霉烯類、氨基糖苷類和氟喹諾酮類等存在多重耐藥性[15]。本研究分析了洛菲不動桿菌對17種抗生素的敏感性,結(jié)果顯示,菌株僅對四環(huán)素、氧氟沙星、氟苯尼考3種藥物敏感,對慶大霉素、鏈霉素、阿齊霉素、丁胺卡那4種抗生素介于敏感與耐藥之間,其余的10種均為耐藥,說明洛菲不動桿菌具有較強的耐藥性,因此建議臨床治療不能盲目使用抗生素。首先通過改善養(yǎng)殖環(huán)境,提高動物自身免疫力,調(diào)節(jié)水環(huán)境菌群結(jié)構(gòu)等措施來預防該疾病,發(fā)病后需要科學診斷,在藥物敏感試驗指導下科學用藥。

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