• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    黑斑蛙腐皮病病原分離、鑒定及致病性研究

    2020-10-26 06:54:35李成偉王均蘇航耿毅
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2020年17期
    關(guān)鍵詞:分離鑒定致病性

    李成偉 王均 蘇航 耿毅

    摘要:為了解黑斑蛙養(yǎng)殖場大規(guī)模暴發(fā)腐皮病的病原,從患病蛙肝臟中分離獲得1株革蘭氏陰性桿菌(編號:QW),對其培養(yǎng)特性、生理生化特性、16S rRNA和gyrB基因檢測、致病性及藥物敏感性進行分析。結(jié)果表明,菌株QW表型特征和理化特性與洛菲不動桿菌相似,16S rRNA和gyrB基因在系統(tǒng)發(fā)育樹上與洛菲不動桿菌聚集為一族,最終判定該菌為洛菲不動桿菌,是黑斑蛙上的一種新病原;致病性研究表明,該菌能夠通過浸泡的方式感染黑斑蛙,具有較強的致病性,發(fā)病癥狀主要表現(xiàn)為皮膚潰爛和內(nèi)臟器官出血,與自然發(fā)病癥狀一致;藥敏試驗表明,洛菲不動桿菌僅對四環(huán)素、氧氟沙星和氟苯尼考3種抗生素敏感。本研究鑒定出引起黑斑蛙腐皮病的病原為洛菲不動桿菌,并對其致病性進行研究,同時檢測了其藥物敏感范圍,為該病臨床防治用藥提供理論依據(jù)。

    關(guān)鍵詞:黑斑蛙;洛菲不動桿菌;分離鑒定;致病性;藥物敏感

    中圖分類號:S947.2 ??文獻標志碼: A ?文章編號:1002-1302(2020)17-0174-05

    黑斑蛙(Pelophylax nigromaculatus)屬無尾目蛙科側(cè)褶蛙屬,在我國華北、華中、華南地區(qū)的平原和丘陵分布較廣泛,也是我國近年來養(yǎng)殖蛙類中的主要品種之一。由于該品種是近年來擴大的養(yǎng)殖規(guī)模[1],相對于其他傳統(tǒng)養(yǎng)殖蛙類如牛蛙、虎紋蛙、美國青蛙的規(guī)?;B(yǎng)殖歷程較短,疾病研究相對較少,發(fā)病后只能參考其他蛙類疾病進行比較處理,但水生動物不同種屬間具有同病不同癥、同癥不同病的特征。如牛蛙、虎紋蛙上常見的白內(nèi)障、歪脖子疾病,這此疾病已報道的病原有氣單胞菌、腦膜敗血伊麗莎白菌、淺黃假單胞菌等[2-3],而在黑斑蛙上的相同癥狀,病原卻出現(xiàn)了肺炎克雷伯菌[4]。因此,應(yīng)對不同品種、病原進一步區(qū)分研究。對于蛙類的腐皮癥,已報道的有牛蛙和棘胸蛙由奇異變形桿菌感染引起[5-6],但黑斑蛙的腐皮病未見相關(guān)報道。2019年6月,四川省內(nèi)江市某黑斑蛙養(yǎng)殖場出現(xiàn)黑斑蛙大面積死亡,主要表現(xiàn)為頭部、背部及四肢出現(xiàn)不同程度的腐爛,剖解可見肝臟腫大、腎臟及肺部出血。本研究對其病原進行分離,并通過病原菌的形態(tài)特征、生理生化特性及16S rRNA和gyrB基因測序與系統(tǒng)發(fā)育分析進行鑒定,確定該病原菌的種屬地位;然后通過人工感染試驗確定該病原菌的致病性;最后通過藥物敏感試驗分析該病原菌的藥物敏感范圍,旨在為該病的臨床防治用藥提供理論參考。

    1 材料與方法

    1.1 試驗對象

    四川省內(nèi)江市某黑斑蛙養(yǎng)殖場的發(fā)病黑斑蛙(25~50 g)頭部、背部及四肢出現(xiàn)不同程度腐爛,剖解可見肝臟腫大出血、腎臟及肺部出血。采集患病典型的黑斑蛙進行實驗室細菌接種;健康黑斑蛙采集于另一黑斑蛙養(yǎng)殖場,實驗室暫養(yǎng)15 d確定健康無病后用于人工感染試驗。

    1.2 主要試劑

    牛腦心浸液培養(yǎng)基(BHI,美國BD公司),細菌生化微量鑒定管(杭州天和微生物試劑有限公司),PCR所用試劑、特異性引物及細菌基因組DNA提取試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司),藥敏試驗紙片(杭州微生物試劑有限公司)。

    1.3 病原菌的分離

    無菌操作接種患病黑斑蛙的肝、脾、腎臟組織劃線于BHI培養(yǎng)基上,于28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48 h后挑取顏色、大小、形態(tài)特征基本一致的優(yōu)勢菌落進一步培養(yǎng)。純化后再轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 分離菌株形態(tài)學與生理生化鑒定

    將純化后的細菌接種至BHI瓊脂平板,于生化培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)24 h,觀察菌落形態(tài)大小,同時對菌體進行革蘭氏染色,光學顯微鏡觀察菌體形態(tài)特征。挑取單個菌落接種于微量生化管中,28 ℃下培養(yǎng)24~48 h,參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[7]和《伯杰細菌鑒定手冊》[8]進行生理生化特性鑒定。

    1.5 16S rRNA和gyrB基因擴增及序列測定

    按照細菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌株基因組DNA作為PCR模板。采用細菌通用引物進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預變性 5 min;94 ℃變性1 min,54 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物純化后送生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定。

    將分離菌株的16S rRNA基因序列和gyrB基因擴增序列與GenBank中已知核酸序列進行Blast分析,調(diào)出與該序列相關(guān)性較高的核酸序列,用MEGA 6.0軟件包中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,重復抽樣1 000次分析系統(tǒng)樹各分枝的置信度。

    1.6 人工感染試驗

    將復壯后的菌株接種到BHI肉湯培養(yǎng)基中,在28 ℃,120 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h后,革蘭氏染色檢驗純度。采用生理鹽水調(diào)整細菌濃度至3.0×108、3.0×107、3.0×106 CFU/mL,將1 L菌液加入黑斑蛙養(yǎng)殖桶中浸泡,對照組加入等量的生理鹽水,每組20只黑斑蛙。連續(xù)觀察14 d,記錄黑斑蛙發(fā)病情況和死亡情況,并分離病原進行鑒定。

    1.7 藥物敏感試驗

    采用藥敏紙片法對分離菌株進行藥敏試驗,采用氨芐西林、青霉素、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、新霉素、阿齊霉素、克拉霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、制霉菌素、恩諾沙星、丁胺卡那、諾氟沙星、氧氟沙星、多粘菌素B、氟苯尼考17種藥物進行藥敏試驗。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 病原菌的分離及生理生化特性

    從患病黑斑蛙的肝臟分離得到1株高純度的優(yōu)勢菌株(編號:QW),其菌落狀態(tài)是灰白色、表面光滑、圓形凸起、邊緣整齊、透明、涂片染色鏡檢可見革蘭氏陰性短桿菌(圖1),生化反應(yīng)結(jié)果見表1。

    2.2 分離菌株的鑒定

    以分離菌株QW的DNA為模板,采用細菌16S rRNA和gyrB基因通用引物進行PCR擴增,經(jīng)電泳檢測和凝膠成像系統(tǒng)后,16S rRNA基因于1 500 bp 左右得到目的條帶(圖2-a),gyrB基因于 1 200 bp 左右得到目的條帶(圖2-b)。經(jīng)測序得到16S rRNA序列1 409 bp(genbank登陸號:MN396229),gyrB基因1 113 bp(genbank登陸號:MN504787)。

    系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示,在16S rRNA序列、gyrB基因序列上,菌株QW上都分別聚在洛菲不動桿菌(Acinetobacter lwoffii)的分支上(圖3、圖4)。結(jié)合生理生化結(jié)果,將菌株QW判定為洛菲不動桿菌。

    2.3 人工感染試驗

    人工浸泡感染連續(xù)觀察14 d,試驗結(jié)果見表2,隨著浸泡菌液濃度的增大,黑斑蛙的死亡率隨之升高,同時病癥周期加快,表現(xiàn)出背部、腿部表皮潰爛(圖5-a),肝臟腫大,腎臟、肺部出血(圖 5-b),與自然發(fā)病癥狀相似,推測洛菲不動桿菌是該病的主要病原,且對黑斑蛙致病性較強。

    2.4 藥敏試驗

    采用紙片擴散法,對菌株QW進行17種藥物敏感性試驗。由表3可知,QW菌株僅對四環(huán)素、氧氟沙星、氟苯尼考3種抗生素敏感;而對慶大霉素、鏈霉素、阿齊霉素、丁胺卡那4種抗生素介于敏感與耐藥之間;其余的10種均為耐藥。

    3 討論

    洛菲不動桿菌是一種可利用環(huán)境中多種營養(yǎng)物質(zhì)作為自身能量來源的需氧型革蘭氏陰性菌,因其適應(yīng)性強,普遍存在于土壤、水及干燥環(huán)境中,且是一種對多種抗生素具有抗性的細菌,一直以來是醫(yī)院感染常見的一種條件性致病菌[9]。洛菲不動桿菌感染包括菌血癥、繼發(fā)性腦膜炎、尿路感染、手術(shù)部位感染、胃炎和肺炎,特別是在重癥監(jiān)護室中[10]。在養(yǎng)殖業(yè)中,洛菲不動桿菌能廣泛引起養(yǎng)殖動物感染,感染包括奶牛子宮內(nèi)膜炎[11]、仔豬肺部感染[12]、禽類呼吸道感染[13]等,水生動物感染相對較少,感染鯉魚[14]、虹鱒[15]、草魚[16],主要表現(xiàn)為敗血癥、胡子鲇“吊頭病”[17]等, 兩棲動物感染的美國青蛙“抽搐癥”[18]、牛蛙腹水病[19]。本試驗表明,洛菲不動桿菌感染黑斑蛙后,主要表現(xiàn)為腐皮和肝臟腫大出血、腎臟出血、肺出血,這與洛菲不動桿菌感染牛蛙癥狀相似[19],感染后黑斑蛙表皮輕微腐爛、肝臟腫大充血,但未出現(xiàn)美國青蛙和牛蛙的腹水、肝臟白色結(jié)節(jié)、腿部充出血斑,證明不同環(huán)境、不同種屬動物感染間存在一定差異。

    水產(chǎn)動物中細菌性疾病的治療最常用且有效的方法為內(nèi)服抗生素,而抗生素的準確使用需要以藥敏試驗結(jié)果作為依據(jù)[20]。相關(guān)研究表明,在人醫(yī)領(lǐng)域洛菲不動桿菌不同地域分離株的耐藥性不同,但大部分菌株對青霉素、頭孢類、復方新諾明表現(xiàn)出強耐藥性,對阿米卡星、亞胺硫霉素、美羅培南敏感[21],但除阿米卡星不能獸用且存在多重耐藥、耐藥率上升較快外,洛菲不動桿菌已成為“超級耐藥菌的潛在菌群”[22]。近幾年,在水生動物上分離的洛菲不動桿菌對廣譜β-內(nèi)酰胺類、碳青霉烯類、氨基糖苷類和氟喹諾酮類等存在多重耐藥性[15]。本研究分析了洛菲不動桿菌對17種抗生素的敏感性,結(jié)果顯示,菌株僅對四環(huán)素、氧氟沙星、氟苯尼考3種藥物敏感,對慶大霉素、鏈霉素、阿齊霉素、丁胺卡那4種抗生素介于敏感與耐藥之間,其余的10種均為耐藥,說明洛菲不動桿菌具有較強的耐藥性,因此建議臨床治療不能盲目使用抗生素。首先通過改善養(yǎng)殖環(huán)境,提高動物自身免疫力,調(diào)節(jié)水環(huán)境菌群結(jié)構(gòu)等措施來預防該疾病,發(fā)病后需要科學診斷,在藥物敏感試驗指導下科學用藥。

    參考文獻:

    [1]楊尚昆,陳金輝,潘麗婷,等. 黑斑蛙高效生態(tài)養(yǎng)殖新型技術(shù)[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學,2015,43(29):52-53.

    [2]紀榮興,鄒文政,莫英軍. 牛蛙“白內(nèi)障”病病原的初步研究[J]. 集美大學學報(自然科學版),2003,8(1):8-11.

    [3]周永燦,朱傳華,陳國華,等. 虎紋蛙白內(nèi)障病病原的分離鑒定及其免疫防治[J]. 上海水產(chǎn)大學學報,2001,10(1):16-21.

    [4]夏理海,羅 凱,李由申,等. 黑斑蛙“白內(nèi)障(歪頭)”病原診斷及藥敏試驗[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學,2018,46(8):174-176.

    [5]舒新華,金燮理,肖克宇,等. 牛蛙腐皮-紅腿病并發(fā)癥致病菌研究[J]. 生命科學研究,1997,1(1):54-59.

    [6]王瑞君,熊筱娟. 棘胸蛙爛皮病奇異變形桿菌的分離、鑒定及對藥物敏感性研究[J]. 淡水漁業(yè),2012(4):31-34.

    [7]東秀珠,蔡妙英. 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京:科學出版社,2001.

    [8]布坎南R E,吉本斯N E. 伯杰細菌鑒定手冊[M]. 9版.北京:科學出版社,1994:729-759.

    [9]Rathinavelu S,Zavros Y,Merchant J L. Acinetobacter lwoffii infection and gastritis[J]. Microbes Infect,2003,5(7):651-657.

    [10]Regalado N G,Martin G,Antony S J. Acinetobacter lwoffii:bacteremia associated with acute gastroenteritis[J]. Travel Medicine and Infectious Disease,2009,7(5):316-317.

    [11]陳現(xiàn)偉. 規(guī)?;瘓瞿膛W訉m內(nèi)膜炎病原菌的分離及鑒定[J]. 畜牧與獸醫(yī),2008,40(2):72-74.

    [12]朱娟娟,馮世文,廖黎黎,等. 產(chǎn)房仔豬魯氏不動桿菌感染的診治[J]. 中國動物保健,2013,14(1):35-36.

    [13]Robino P,Bert E,Tramuta C. Isolation of Acinetobacter lwoffii from a lovebird(Agapornis roseicollis)with severe respiratory symptoms[J]. Schweizer Archiv Fur Tierheilkunde,2005,147(6):267-269.

    [14]Kozińska A,Paz′dzior E,Pkala A,et al. Acinetobacter johnsonii and Acinetobacter lwoffii-the emerging fish pathogens[J]. Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy,2014,58(2):193-199.

    [15]Dadar M,Adel M,Zorriehzahra M J. Isolation and phylogenic analysis of emerging new antibiotic resistant bacteria,Acinetobacter lwoffii,associated with mortality in farmed rainbow trout[J]. Iranian Journal of Fisheries Sciences,2016,15(4):1279-1292.

    [16]Lü A J,Wei Z,Hu X C,et al. Isolation and characterization of Acinetobacter lwoffii from the intestine of grass carp (Ctenopharyngodon idella)[J]. Israeli Juornal of Aquaculture-Bamidgeh,2017,69:1411-1417.

    [17]李桂峰,李海燕,畢英佐. 胡子鲇“吊頭病”病原的研究[J]. 中國水產(chǎn)科學,2001,8(2):72-75.

    [18]葉雪平,羅毅志,施偉達,等. 美國青蛙“抽搐癥”病原及防治研究[J]. 淡水漁業(yè),2005,35(5):48-50.

    [19]于 喆,肖克宇,鐘 蕾,等. 牛蛙腹水病病原鑒定和藥敏試驗[J]. 淡水漁業(yè),2013,43(1):50-54.

    [20]張石云,宋 超,陳家長. 喹諾酮類抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用的研究進展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學,2019,47(3):32-36.

    [21]Luciano T,Katia R,Ottaviani D,et al. Catheter-related bacteremia and multidrug-resistant Acinetobacter lwoffii[J]. Emerging Infectious Diseases,2007,13(2):355.

    [22]Alejandro B,Dominguez L,Ribera A,et al. Molecular characterization of the gene encoding a new AmpC beta-lactamase in a clinical strain of acinetobacter genomic species 3[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2004,48(4):1374-1378.

    猜你喜歡
    分離鑒定致病性
    煙粉虱病原真菌的分離鑒定及生物活性初步研究
    草魚腸道不動桿菌的分離鑒定及藥敏試驗
    五株雞傳染性支氣管炎病毒流行株的分離鑒定
    引起奶牛關(guān)節(jié)炎的牛支原體病原的分離鑒定
    生豬高致病性藍耳病混合感染防治技術(shù)
    一例高致病性豬藍耳病的診治
    高致病性藍耳病的診斷和治療
    哺乳仔豬高、低致病性藍耳病的診治
    一株纖維素分解菌的分離鑒定及生物學特性
    重慶煙區(qū)硅酸鹽細菌的分離鑒定及生理生化特性
    亚洲三级黄色毛片| 少妇熟女欧美另类| 男女那种视频在线观看| 毛片一级片免费看久久久久| 特级一级黄色大片| or卡值多少钱| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 亚洲av国产av综合av卡| 久久久久网色| 亚洲成色77777| 婷婷色av中文字幕| 日本爱情动作片www.在线观看| 亚洲成色77777| 欧美3d第一页| 综合色av麻豆| 免费av观看视频| av女优亚洲男人天堂| 91aial.com中文字幕在线观看| 亚洲色图av天堂| 99热这里只有精品一区| 日本免费a在线| 成人国产麻豆网| 秋霞在线观看毛片| 欧美区成人在线视频| 丝瓜视频免费看黄片| 午夜精品国产一区二区电影 | 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 免费看a级黄色片| 日韩在线高清观看一区二区三区| 亚洲av不卡在线观看| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲精品日韩av片在线观看| 女人久久www免费人成看片| 免费黄网站久久成人精品| 五月伊人婷婷丁香| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲天堂国产精品一区在线| 激情五月婷婷亚洲| 在线a可以看的网站| 成年女人在线观看亚洲视频 | 亚洲成人中文字幕在线播放| 午夜免费观看性视频| videos熟女内射| 2021少妇久久久久久久久久久| 精品人妻视频免费看| 亚洲av二区三区四区| 99久久人妻综合| 美女大奶头视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 最后的刺客免费高清国语| 日日啪夜夜撸| 欧美丝袜亚洲另类| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 综合色丁香网| 久久久久久久久久黄片| 久久99蜜桃精品久久| 亚洲成人av在线免费| 精品国内亚洲2022精品成人| 中文字幕亚洲精品专区| 最新中文字幕久久久久| 亚洲无线观看免费| 国产精品国产三级国产专区5o| 日日撸夜夜添| 国产成人aa在线观看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 免费av毛片视频| 国产色婷婷99| 国产视频内射| 国产真实伦视频高清在线观看| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲真实伦在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 91av网一区二区| 看黄色毛片网站| 别揉我奶头 嗯啊视频| 九色成人免费人妻av| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 国产精品久久久久久久电影| 夜夜爽夜夜爽视频| 99久国产av精品国产电影| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 欧美日韩在线观看h| 亚洲成人一二三区av| 亚洲综合色惰| 国产精品一区二区性色av| 国产精品蜜桃在线观看| 久久韩国三级中文字幕| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲精品一二三| 日韩一区二区视频免费看| 在线免费十八禁| 国产成年人精品一区二区| 久久这里只有精品中国| 大话2 男鬼变身卡| 色尼玛亚洲综合影院| 神马国产精品三级电影在线观看| h日本视频在线播放| 直男gayav资源| 天美传媒精品一区二区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产久久久一区二区三区| 一级黄片播放器| 成人av在线播放网站| 亚洲精品国产av成人精品| 在线观看免费高清a一片| 校园人妻丝袜中文字幕| 日韩欧美三级三区| 亚洲美女视频黄频| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 22中文网久久字幕| 日本黄大片高清| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产黄片美女视频| 不卡视频在线观看欧美| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲在线自拍视频| 18禁动态无遮挡网站| 成年免费大片在线观看| 亚洲av免费高清在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产精品人妻久久久影院| 国产极品天堂在线| 亚洲av中文av极速乱| 国产成人a区在线观看| 中文字幕免费在线视频6| 美女黄网站色视频| kizo精华| 国产久久久一区二区三区| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 校园人妻丝袜中文字幕| 日本wwww免费看| 男女啪啪激烈高潮av片| 老司机影院毛片| 中文字幕亚洲精品专区| 国产 亚洲一区二区三区 | 欧美3d第一页| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 在线播放无遮挡| 国产乱来视频区| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 久久鲁丝午夜福利片| 久久久久性生活片| 毛片一级片免费看久久久久| 免费看美女性在线毛片视频| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产精品国产三级专区第一集| 日韩av不卡免费在线播放| 日韩在线高清观看一区二区三区| 一本一本综合久久| 我要看日韩黄色一级片| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲激情五月婷婷啪啪| h日本视频在线播放| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 婷婷色av中文字幕| 高清毛片免费看| 精品欧美国产一区二区三| 国国产精品蜜臀av免费| 男女国产视频网站| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产三级在线视频| 亚洲美女搞黄在线观看| 午夜免费激情av| 综合色av麻豆| 国产精品一及| 免费观看在线日韩| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 久久人人爽人人片av| 免费黄色在线免费观看| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲成人久久爱视频| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产精品国产三级国产专区5o| 韩国av在线不卡| 男人狂女人下面高潮的视频| 久热久热在线精品观看| 国产91av在线免费观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 久久久久久久国产电影| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产 一区 欧美 日韩| 黄色欧美视频在线观看| 精品久久久噜噜| 欧美97在线视频| 午夜免费男女啪啪视频观看| 色5月婷婷丁香| 伦理电影大哥的女人| 日韩在线高清观看一区二区三区| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 禁无遮挡网站| 99久国产av精品国产电影| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 欧美区成人在线视频| 三级经典国产精品| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲丝袜综合中文字幕| kizo精华| 免费av不卡在线播放| 夜夜爽夜夜爽视频| 午夜激情欧美在线| 69av精品久久久久久| 国产片特级美女逼逼视频| av女优亚洲男人天堂| 亚洲高清免费不卡视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 婷婷色麻豆天堂久久| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 美女黄网站色视频| 免费看a级黄色片| 亚洲经典国产精华液单| 国产精品.久久久| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 少妇高潮的动态图| 亚洲电影在线观看av| 欧美+日韩+精品| 国内精品一区二区在线观看| 人体艺术视频欧美日本| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 91久久精品电影网| 永久网站在线| 国产乱人视频| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 99久久中文字幕三级久久日本| 男女边吃奶边做爰视频| 一级二级三级毛片免费看| 最后的刺客免费高清国语| 水蜜桃什么品种好| 干丝袜人妻中文字幕| 国产日韩欧美在线精品| 国产亚洲精品av在线| 真实男女啪啪啪动态图| av黄色大香蕉| 国产成人a区在线观看| 伦精品一区二区三区| 91精品一卡2卡3卡4卡| 少妇高潮的动态图| .国产精品久久| 网址你懂的国产日韩在线| 国产精品国产三级专区第一集| 日日啪夜夜撸| 22中文网久久字幕| 欧美日韩在线观看h| 97超视频在线观看视频| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 日韩av在线大香蕉| 国产淫片久久久久久久久| 韩国av在线不卡| 欧美极品一区二区三区四区| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 尾随美女入室| 日本免费在线观看一区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 久久这里只有精品中国| 国产黄a三级三级三级人| 观看美女的网站| 禁无遮挡网站| 天堂影院成人在线观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲真实伦在线观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 久99久视频精品免费| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 免费看不卡的av| 国产免费福利视频在线观看| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲精品乱久久久久久| 成人欧美大片| 亚洲高清免费不卡视频| 国内精品宾馆在线| 久久草成人影院| 别揉我奶头 嗯啊视频| 日韩视频在线欧美| 欧美高清成人免费视频www| .国产精品久久| 日本与韩国留学比较| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 一级毛片久久久久久久久女| 午夜激情欧美在线| 亚洲国产成人一精品久久久| 欧美成人午夜免费资源| 伊人久久精品亚洲午夜| 边亲边吃奶的免费视频| 七月丁香在线播放| 免费观看性生交大片5| 亚洲精品第二区| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 久久久久久久久久久免费av| 成人毛片a级毛片在线播放| 久久久久精品久久久久真实原创| 日本av手机在线免费观看| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲精品一区蜜桃| 99热全是精品| 亚洲最大成人手机在线| 免费看日本二区| 99re6热这里在线精品视频| 国产爱豆传媒在线观看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产视频首页在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 久久这里有精品视频免费| 永久免费av网站大全| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 亚洲精品乱久久久久久| xxx大片免费视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产精品久久久久久精品电影| 男女视频在线观看网站免费| 99久国产av精品国产电影| 韩国高清视频一区二区三区| 成人午夜精彩视频在线观看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产极品天堂在线| 男女国产视频网站| 成人av在线播放网站| 国产 一区 欧美 日韩| 成年版毛片免费区| 日韩av不卡免费在线播放| 国产亚洲91精品色在线| 最近手机中文字幕大全| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 免费观看a级毛片全部| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 午夜亚洲福利在线播放| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产成人午夜福利电影在线观看| 男人舔奶头视频| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲av福利一区| 成人午夜高清在线视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| 伦理电影大哥的女人| 最近中文字幕2019免费版| av网站免费在线观看视频 | av又黄又爽大尺度在线免费看| 熟女人妻精品中文字幕| 丝袜喷水一区| 精品少妇黑人巨大在线播放| 久久久久久九九精品二区国产| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产免费视频播放在线视频 | 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 一级二级三级毛片免费看| 99热6这里只有精品| 午夜免费男女啪啪视频观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 一级二级三级毛片免费看| 免费在线观看成人毛片| 国产伦一二天堂av在线观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| av一本久久久久| 人妻系列 视频| 麻豆成人av视频| 亚洲国产精品sss在线观看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 啦啦啦啦在线视频资源| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产精品av视频在线免费观看| 久久97久久精品| 18禁动态无遮挡网站| 欧美+日韩+精品| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 中国国产av一级| 国产黄色视频一区二区在线观看| 99热这里只有是精品50| 亚洲国产高清在线一区二区三| 精品人妻熟女av久视频| 天堂俺去俺来也www色官网 | 色网站视频免费| 高清av免费在线| 国产亚洲一区二区精品| 大香蕉久久网| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 高清欧美精品videossex| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲国产欧美人成| 成人鲁丝片一二三区免费| 日本熟妇午夜| 日韩伦理黄色片| videossex国产| 久久久久久久国产电影| 久久久久久久久久成人| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 毛片一级片免费看久久久久| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产有黄有色有爽视频| 777米奇影视久久| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲欧美精品专区久久| 久久99热这里只频精品6学生| 中文字幕制服av| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产精品熟女久久久久浪| 99久久精品一区二区三区| 亚洲av国产av综合av卡| 日本免费a在线| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产有黄有色有爽视频| 2018国产大陆天天弄谢| 久久人人爽人人片av| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产精品av视频在线免费观看| 午夜免费激情av| 久久这里有精品视频免费| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产 一区 欧美 日韩| ponron亚洲| 成人午夜高清在线视频| 久久久a久久爽久久v久久| 日日啪夜夜撸| 精品久久久精品久久久| 欧美高清成人免费视频www| 日本色播在线视频| 丰满少妇做爰视频| 国产精品99久久久久久久久| 黄片无遮挡物在线观看| 嫩草影院入口| 午夜免费观看性视频| 少妇丰满av| 人妻少妇偷人精品九色| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产男人的电影天堂91| 免费看av在线观看网站| 熟女电影av网| 偷拍熟女少妇极品色| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 亚洲av国产av综合av卡| 美女内射精品一级片tv| 欧美变态另类bdsm刘玥| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 中文字幕av在线有码专区| 日本午夜av视频| 高清欧美精品videossex| 亚洲无线观看免费| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 久久人人爽人人片av| 亚洲成人av在线免费| 97在线视频观看| 国产91av在线免费观看| 22中文网久久字幕| 直男gayav资源| 免费黄网站久久成人精品| 22中文网久久字幕| 美女内射精品一级片tv| 免费看不卡的av| 美女黄网站色视频| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久久亚洲精品成人影院| 好男人视频免费观看在线| 91精品一卡2卡3卡4卡| 久久久久久久久大av| 国产精品一二三区在线看| 99视频精品全部免费 在线| 观看美女的网站| 秋霞伦理黄片| 日韩制服骚丝袜av| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产高清国产精品国产三级 | 只有这里有精品99| 日本一二三区视频观看| 免费大片黄手机在线观看| 天堂√8在线中文| 亚洲不卡免费看| 国产乱人视频| 好男人视频免费观看在线| 成人欧美大片| 日本wwww免费看| 国产中年淑女户外野战色| 成人亚洲欧美一区二区av| 久久久精品欧美日韩精品| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲精品,欧美精品| 婷婷色综合www| 日本熟妇午夜| 亚洲国产成人一精品久久久| 婷婷色麻豆天堂久久| 日韩亚洲欧美综合| 色综合色国产| 一夜夜www| 少妇的逼水好多| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲人成网站在线播| 亚洲欧美精品专区久久| 毛片女人毛片| 女人久久www免费人成看片| 男女边吃奶边做爰视频| 日本三级黄在线观看| 亚洲乱码一区二区免费版| 久久久久精品性色| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 国产成人精品一,二区| 91av网一区二区| 一级黄片播放器| 1000部很黄的大片| 最后的刺客免费高清国语| 国产成人一区二区在线| 亚洲欧洲日产国产| 欧美成人午夜免费资源| 国产精品福利在线免费观看| 五月天丁香电影| 老司机影院毛片| 免费观看无遮挡的男女| 欧美日本视频| 亚洲av成人av| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 成人亚洲欧美一区二区av| 国精品久久久久久国模美| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 亚洲欧洲日产国产| 国产色婷婷99| 亚洲av男天堂| 久久久久久久国产电影| 久久99精品国语久久久| 国产成人aa在线观看| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲精品影视一区二区三区av| 精品少妇黑人巨大在线播放| 嫩草影院精品99| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚州av有码| 高清在线视频一区二区三区| 看非洲黑人一级黄片| 久热久热在线精品观看| 国产极品天堂在线| 亚洲成人久久爱视频| 成人毛片60女人毛片免费| 春色校园在线视频观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 成年人午夜在线观看视频 | 又大又黄又爽视频免费| 嘟嘟电影网在线观看| 欧美日韩在线观看h| 韩国av在线不卡| 男女边摸边吃奶| 水蜜桃什么品种好| 两个人的视频大全免费| 亚洲av免费高清在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 午夜福利在线观看吧| 欧美激情久久久久久爽电影| 最近中文字幕高清免费大全6| 人妻一区二区av| 青春草亚洲视频在线观看| 国产午夜精品一二区理论片| 久久久久久国产a免费观看| a级一级毛片免费在线观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 中文在线观看免费www的网站| 99久久精品热视频| 99热全是精品| 免费看a级黄色片| 麻豆乱淫一区二区| 久久久午夜欧美精品| 免费在线观看成人毛片| 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲精品第二区| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲国产色片| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲va在线va天堂va国产| 亚洲成人av在线免费| 亚洲国产最新在线播放| av天堂中文字幕网| 午夜老司机福利剧场| 日本免费在线观看一区| 丰满少妇做爰视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 一级毛片我不卡| .国产精品久久| 久久久久九九精品影院| 在线天堂最新版资源| 禁无遮挡网站| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产淫片久久久久久久久| 国产高潮美女av| 乱系列少妇在线播放| 午夜日本视频在线| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产视频内射| 国产真实伦视频高清在线观看| 如何舔出高潮| 国产精品av视频在线免费观看| 国产久久久一区二区三区| 精品久久久久久电影网| 精品人妻一区二区三区麻豆| 高清日韩中文字幕在线| 日本一本二区三区精品| 国产亚洲91精品色在线| 国产伦精品一区二区三区四那| 一级毛片电影观看|