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    產(chǎn)低毒性脂多糖大腸桿菌J5基因重組株的構(gòu)建

    2020-10-26 06:54:35徐悅周明旭朱純尹文竹馬芳鮑熹張金秋盧宇
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年17期
    關(guān)鍵詞:大腸桿菌佐劑疫苗

    徐悅 周明旭 朱純 尹文竹 馬芳 鮑熹 張金秋 盧宇

    摘要:細(xì)菌脂多糖(LPS)對(duì)宿主細(xì)胞具有一定的毒性,但經(jīng)修飾后的單磷酸類脂A(MPLA)卻是一種無(wú)毒性的高效免疫佐劑。選擇天然O抗原不完全的大腸桿菌J5疫苗株為出發(fā)菌株,利用λ-Red同源重組技術(shù)導(dǎo)入外源弗朗西斯菌(Francisella novicida)lpxE基因,缺失大腸桿菌lpxM基因。結(jié)果顯示,J5ΔlacI::lpxEΔlpxM基因重組株的LPS鱟試劑活性較DH5α和J5原菌顯著降低;對(duì)4周齡的ICR小鼠腹腔注射LPS提取物,重組菌和PBS組的小鼠體征及肝臟切片均正常。同時(shí),腹腔注射大腸桿菌J5和DH5α的小鼠被毛凌亂、精神抑郁、肝臟細(xì)胞腫大,發(fā)生炎性浸潤(rùn),有明顯的毒性反應(yīng)。以上結(jié)果說(shuō)明,J5重組菌的LPS已經(jīng)區(qū)別于原菌,是低毒性的MPLA產(chǎn)物。上述重組株的成功構(gòu)建,能為生產(chǎn)廉價(jià)的獸用MPLA免疫佐劑奠定工作基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞:大腸桿菌;MPLA;Red同源重組;佐劑;疫苗;細(xì)菌脂多糖

    中圖分類號(hào):S182 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A ?文章編號(hào):1002-1302(2020)17-0054-05

    細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)主要由類脂A、核心多糖和O-抗原3部分組成,其中類脂A是LPS的活性中心,其保守的結(jié)構(gòu)可以被宿主細(xì)胞表面的Toll樣受體4(toll like receptor 4,TLR4)識(shí)別并引起機(jī)體炎癥反應(yīng),嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致機(jī)體休克或者死亡,因此LPS又被成為內(nèi)毒素[1]。單磷酸類脂A(monophosphoryl lipid A,MPLA)是類脂A在酶的催化作用下水解失去1-磷酸(或1-焦糖酸)后所形成的一種類脂A的衍生物,幾乎失去了LPS的毒性,但是仍舊能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生各種免疫活性因子,激活吞噬細(xì)胞,MPLA具備一定的免疫佐劑和免疫調(diào)理的作用[2-3]。

    大腸桿菌J5(O111:B4)菌株是美國(guó)Pfizer公司推出的用于奶牛乳房炎滅活菌苗的疫苗株[4]。它是1株O-抗原不完全的粗糙型(R)突變菌,其LPS只含有結(jié)構(gòu)較為單一的Kdo2-類脂A和核心多糖結(jié)構(gòu)。因J5株暴露的核心抗原具有良好的保守性和天然免疫原性,它作為抗革蘭氏陰性菌感染的疫苗株在奶牛等家畜上被廣泛應(yīng)用[5-7]??紤]到J5株的LPS天然缺失O抗原且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,30多年的疫苗使用情況顯示其安全性可靠,因此本研究選擇J5株作為出發(fā)菌。通過(guò)同源重組技術(shù)將J5株基因組乳糖操縱子lac的抑制子基因lacI置換為弗朗西斯氏菌屬(Francisella)的lpxE基因,達(dá)到常量表達(dá)的效果,該基因編碼的磷酸酶可以選擇性地降解存在于類脂A分子C1位上的磷酸基團(tuán),使其LPS成為MPLA結(jié)構(gòu)[8]。與此同時(shí),缺失J5株的lpxM基因,使細(xì)菌類脂A的分子C3′位無(wú)法正常添加十四碳羥基脂肪酸鏈,從而只存在5條?;?,進(jìn)一步降低LPS對(duì)TLR4的激活效率,減少M(fèi)PLA的毒性[9]。對(duì)J5株的LPS進(jìn)行定向重組改造使其成為可以產(chǎn)低毒性MPLA的工程菌,應(yīng)用于獸用佐劑的生產(chǎn)中。

    1 材料與方法

    1.1 菌株、質(zhì)粒與試驗(yàn)動(dòng)物

    大腸桿菌J5株(O111:B4)、Red重組系統(tǒng)質(zhì)粒pKD3和pCP20由揚(yáng)州大學(xué)朱國(guó)強(qiáng)教授惠贈(zèng);弗朗西斯菌(F.novicida)基因組DNA由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)蘇敬良教授惠贈(zèng);(20±2) g的清潔級(jí)ICR雌鼠購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

    1.2 培養(yǎng)基和主要試劑

    胰蛋白酶(tryptone)、酵母提取物(yeast extract),購(gòu)自O(shè)xoid公司;瓊脂(agar),購(gòu)自南京翼飛雪生物科技有限公司;β-半乳糖苷酶(ONPG)、L-阿拉伯糖、氯霉素(Cm)和氨芐青霉素(Amp),均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;DL 2 000 DNA Marker、Ex Taq(10 U/L)、dNTP,均購(gòu)自TaKaRa公司;DNA膠回收試劑盒,購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;Trans2K plusⅡ DNA Marker、克隆載體pEASY-T1 Simple和感受態(tài)細(xì)胞,均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;顯色基質(zhì)鱟試劑盒,購(gòu)于廈門(mén)鱟試劑廠。

    1.3 低毒性LPS重組株的構(gòu)建

    1.3.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank上發(fā)布的大腸桿菌(Escherichia coli) lacI基因和F.novicida lpxE基因序列,設(shè)計(jì)3對(duì)引物,P1、P2位于E.coli J5株中的lacI基因ORF的上下游外翼,用于擴(kuò)增檢測(cè)lacI基因及其缺失突變株。其后在P1、P2內(nèi)側(cè)設(shè)計(jì)1對(duì)同源重組引物P3、P6,其5′端序列與lacI兩翼序列同源,P2的3′端序列與lpxE基因序列同源,P6的3′端序列與cat基因序列同源。依照重疊延伸PCR(SOE-PCR)要求設(shè)計(jì)P4、P5,其中P4的5′端序列與cat基因序列同源,3′端序列與lpxE基因序列同源。再根據(jù)GenBank上發(fā)布的E.coli lpxM基因序列,設(shè)計(jì)2對(duì)引物,P7、P8位于E.coli J5株中的lpxM基因ORF的上下游外翼,用于擴(kuò)增檢測(cè)lpxM基因及其缺失突變株。另外,在P7、P8內(nèi)側(cè)設(shè)計(jì)1對(duì)同源重組引物P9、P10,其5′端序列與lpxM兩翼序列同源,3′端序列與cat基因序列同源。引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成,引物序列見(jiàn)表1。

    1.3.2 Red重組構(gòu)建J5ΔlacI::lpxE 為將lpxE基因插入細(xì)菌基因組并常量表達(dá),試驗(yàn)選擇lac操縱子中抑制子lacI基因作為插入位點(diǎn),利用Red重組技術(shù)用lpxE基因置換lacI基因。

    PCR反應(yīng)1以F.novicida基因組為模板,P3、P4為引物,擴(kuò)增lpxE基因;反應(yīng)2以質(zhì)粒pKD3為模板,P5、P6為引物,擴(kuò)增cat基因。反應(yīng)1和反應(yīng)2按照常規(guī)PCR的方法進(jìn)行操作,PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后通過(guò)DNA膠回收并送北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。SOE-PCR以反應(yīng)1和反應(yīng)2的產(chǎn)物為模板,P3和P6為引物,按照文獻(xiàn)[10]方法,分2輪PCR擴(kuò)增lpxE-cat重組片段。最后產(chǎn)物經(jīng)DNA膠回收后-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

    按照文獻(xiàn)[11]中的方法向已經(jīng)導(dǎo)入pKD46的J5株感受態(tài)細(xì)胞中電轉(zhuǎn)lpxE-cat重組片段,通過(guò)氯霉素抗性平板篩選1次同源重組菌J5ΔlacI::lpxE-cat,并進(jìn)行PCR鑒定。然后向陽(yáng)性菌種導(dǎo)入編碼Flp重組酶的質(zhì)粒pCP20,通過(guò)對(duì)Flp位點(diǎn)的識(shí)別消除抗性基因,獲得二次重組菌J5ΔlacI::lpxE,利用P1、P2引物擴(kuò)增目的片段,送北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

    1.3.3 Red重組構(gòu)建J5ΔlacI::lpxEΔlpxM 以構(gòu)建的J5ΔlacI::lpxE重組株為出發(fā)菌株,繼續(xù)構(gòu)建lpxM缺失株。以pKD3為模板,P9、P10為引物,按照文獻(xiàn)[11]方法擴(kuò)增cat基因,DNA膠回收后-20 ℃凍存?zhèn)溆?。重組的具體方法同“1.3.2”節(jié),分別通過(guò)一次重組和二次重組構(gòu)建J5ΔlacI::lpxEΔlpxM重組株,利用P7、P8引物擴(kuò)增目的片段,送北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

    1.4 β-半乳糖苷酶試驗(yàn)檢測(cè)lac操縱子的表達(dá)

    β-半乳糖苷酶試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行。將J5株和J5△lacI::lpxE重組株分別接種4 mL于裝有LB液體培養(yǎng)基的試管,放置在搖床中,37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)細(xì)菌8 h。收集菌液,10 000 r/min離心10 min,取培養(yǎng)上清備用。按照文獻(xiàn)[13]方法,配制0.02 mol/L ONPG底物溶液,過(guò)濾除菌,分裝成1 mL/管。分別在每管中加入100 μL的培養(yǎng)上清,另設(shè)置1管加入PBS作為空白對(duì)照,放置在37 ℃水浴鍋中共孵育6 h,觀察底物溶液顏色變化。

    1.5 細(xì)菌LPS的提取和純化

    細(xì)菌LPS的提取和純化按照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行。挑取J5株及重組株至LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)過(guò)夜,并轉(zhuǎn)接至500 mL細(xì)菌培養(yǎng)液中擴(kuò)大培養(yǎng)8 h。收菌時(shí)檢測(cè)菌液的吸光度D600 nm。菌液6 000 r/min離心20 min,并以1 ∶ 10比例濃縮。濃縮菌液在-20 ℃下反復(fù)凍融3 次;加入溶菌酶(含50 μg/mL),37 ℃水浴60 min。低溫條件下超聲破碎菌體,之后將菌液移至200 mL玻璃瓶中,在68~70 ℃下預(yù)加熱,加入新配制的等體積90%苯酚(體積分?jǐn)?shù)),68~70 ℃下反應(yīng)30 min,期間每 5 min 搖晃振蕩樣品,使反應(yīng)充分進(jìn)行。結(jié)束后將混合液轉(zhuǎn)移至離心杯中,并保存于 4 ℃ 過(guò)夜。次日 3 000 r/min 離心樣品30 min后取上清,在剩余酚相中加入等體積的ddH2O,重復(fù)提取1次,合并2次水相,并移至透析袋中。充分透析去除苯酚后,使用聚乙二醇(PEG 8000)濃縮,使體積至原液的1/5~1/6。將透析袋內(nèi)濃縮液吸出,離心(4 ℃,3 000 r/min,30 min)取上清,即為L(zhǎng)PS粗制品。

    在LPS粗制品中加入DNase I和Rnase A,37 ℃水浴60 min,然后置于65 ℃下10 min滅活酶。之后5 000 r/min離心10 min,去除沉淀,將上清凍干處理,得到LPS凍干粉。凍干粉稱質(zhì)量,計(jì)算得率,并加入滅菌ddH2O復(fù)溶,配制成1 mg/mL的LPS純品。

    1.6 鱟試劑檢測(cè)LPS活性

    按照鱟試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法配制內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液,按比例稀釋1.5倍,獲得LPS待測(cè)樣品,根據(jù)說(shuō)明試驗(yàn)步驟進(jìn)行顯色,使用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定545 nm波長(zhǎng)處的吸光度,根據(jù)讀值結(jié)果建立內(nèi)毒素濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計(jì)算LPS樣品的活性。

    1.7 動(dòng)物試驗(yàn)檢測(cè)LPS毒性

    選取20 g ICR雌鼠40只,10只/組進(jìn)行分組,設(shè)置3個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組。稀釋1.5倍,獲得J5、J5ΔlacI::lpxEΔlpxM和DH5α的LPS提取物至500 μg/mL,試驗(yàn)組分別腹腔注射不同LPS提取物(劑量5 mg/kg),注射量為200 μL/只,空白對(duì)照組注射200 μL PBS。觀測(cè)攻毒后小鼠的生理精神狀態(tài)(食欲、飲欲及活動(dòng)狀況等)和病癥,并在攻毒2 d后剖殺小鼠,取肝臟制作石蠟切片,觀察其組織病理變化從而判定不同LPS提取物的毒性強(qiáng)弱。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 J5Δlac I::lpxEΔlpxM重組株的鑒定

    將二次重組菌制備基因組模板,以P1和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定,對(duì)照野生型擴(kuò)增片段為 1 200 bp,重組菌擴(kuò)增片段為888 bp(圖1),PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果正確。以P7和P8為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增lpxM基因鑒定,對(duì)照野生型擴(kuò)增片段為 1 066 bp,重組菌擴(kuò)增片段為179 bp(圖2),PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果正確,命名重組菌為J5ΔlacI::lpxEΔlpxM。

    2.2 β-半乳糖苷酶試驗(yàn)檢測(cè)lac操縱子的表達(dá)

    由圖3可知,J5野生菌和J5ΔlacI::lpxE培養(yǎng)上清分別加入底物ONPG孵育后,J5野生菌培養(yǎng)液不變色;J5ΔlacI::lpxE培養(yǎng)液顯黃色,說(shuō)明重組株lac操縱子可正常轉(zhuǎn)錄表達(dá),lpxE基因置換lacI成功。

    2.3 脂多糖產(chǎn)量比較

    J5株及重組株的LPS水溶物均為無(wú)色透明液,凍干后為白色粉末狀。根據(jù)LPS凍干產(chǎn)物稱質(zhì)量的結(jié)果,計(jì)算出得率,見(jiàn)表1。

    2.4 內(nèi)毒素活性檢測(cè)

    鱟試劑中含有能被微量細(xì)菌內(nèi)毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原,是一種凝固蛋白原,能準(zhǔn)確、快速地定性或定量檢測(cè)樣品中是否含有細(xì)菌內(nèi)毒素[8-9]。根據(jù)定量試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品形成的標(biāo)準(zhǔn)曲線的計(jì)算公式為Y=0.819 0X+0.305 2,r2=0.990 2。推算測(cè)得DH5α的LPS活性為2.3×105 EU/mg,J5原菌的LPS活性為1.7×105 EU/mg,改造菌株J5ΔlacI::lpxEΔlpxM的LPS活性為4.3×103 EU/mg。改造菌株J5ΔlacI::lpxEΔlpxM的LPS活性較DH5α和J5原菌顯著降低,說(shuō)明重組菌株改造成功。

    2.5 LPS毒性試驗(yàn)結(jié)果

    2.5.1 臨床癥狀 通過(guò)對(duì)小鼠分別依次腹腔注射野生株J5,突變株J5ΔlacI::lpxEΔlpxM以及DH5α的LPS,結(jié)果發(fā)現(xiàn),大腸桿菌J5和DH5α的LPS提取物攻毒組,小鼠被毛凌亂、精神抑郁、有明顯毒性反應(yīng);而PBS組和J5ΔlacI::lpxEΔlpxM的LPS提取物組的小鼠正常,無(wú)任何臨床癥狀。說(shuō)明經(jīng)改造的突變株J5ΔlacI::lpxEΔlpxM的LPS毒性明顯降低。

    2.5.2 組織病理變化 對(duì)攻毒小鼠的肝臟組織進(jìn)行病理切片,由圖4可知,DH5α組和J5組的肝臟細(xì)胞腫脹,細(xì)胞間隙增大,同時(shí)出現(xiàn)不同程度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。相對(duì)于DH5α組和J5組,J5ΔlacI::lpxEΔlpxM組肝臟細(xì)胞與PBS組的肝臟細(xì)胞形態(tài)一致,沒(méi)有明顯的病理變化,僅發(fā)生局部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。說(shuō)明改造后的J5ΔlacI::lpxEΔlpxM突變株的毒性減弱。

    3 結(jié)論與討論

    細(xì)菌LPS會(huì)最大程度地激活機(jī)體TLR4、Notch[15]通路, 引起細(xì)胞毒性反應(yīng)。已有研究表明,

    改變脂肪酸鏈的數(shù)量、長(zhǎng)度以及磷酸基團(tuán)個(gè)數(shù)均可降低LPS的毒性,使其發(fā)揮佐劑作用[16],其中,MPLA作為類脂A的結(jié)構(gòu)變體,是一種免疫效力顯著的佐劑物質(zhì)。其傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法是收獲R型沙門(mén)菌突變株R595的LPS,并對(duì)其LPS采用酸解、堿解等一系列繁瑣的化學(xué)手段脫去磷酸基團(tuán)及?;湯@得。但該類產(chǎn)物的產(chǎn)率較低,MPLA純度無(wú)法保障,存在多種不同的陽(yáng)離子使其溶解度降低,可能發(fā)生沙門(mén)菌污染,生產(chǎn)成本極高。

    本研究選用O抗原不完全的大腸桿菌J5疫苗株作為出發(fā)菌,利用λ-Red同源重組技術(shù),從生物合成學(xué)的角度對(duì)細(xì)菌完成基因改造,使細(xì)菌直接合成MPLA。其中非常重要的改造位點(diǎn)是導(dǎo)入可以去除磷酸基團(tuán)的弗朗西斯菌的lpxE基因并保證常量表達(dá),因此筆者所在課題組選擇lac操縱子中常量表達(dá)的lacI基因作為重組位點(diǎn)。lacI具備獨(dú)立的啟動(dòng)子,可在非乳糖培養(yǎng)環(huán)境下常量表達(dá),J5野生菌中β-半乳糖苷酶LacZ在抑制子LacI的作用下轉(zhuǎn)錄被阻遏;當(dāng)lacI基因的ORF被完成置換為lpxE的ORF后,細(xì)菌常量表達(dá)LpxE而非LacI,原阻遏效應(yīng)結(jié)束,LacZ則開(kāi)始轉(zhuǎn)錄表達(dá)并催化底物ONPG,顯示黃色;同時(shí),常量表達(dá)的LpxE也保證了細(xì)菌LPS可以被催化轉(zhuǎn)變?yōu)镸PLA結(jié)構(gòu)。

    導(dǎo)致腹瀉的野生豬源大腸桿菌LPS的活性可以達(dá)到1.21×107 EU/mg,Sigma公司市售的LPS活性約為1×105 EU/mg[17]。而本研究中使用的大腸桿菌J5株由于其自身作為疫苗株的安全性優(yōu)勢(shì),經(jīng)筆者所在課題組測(cè)定LPS活性僅1.7×105 EU/mg,顯著低于豬源野生大腸桿菌。但從小鼠的毒性試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),J5株的LPS仍然可以引起小鼠包括被毛凌亂、精神抑郁等臨床反應(yīng),肝臟組織也存在明顯的病變。相對(duì)于J5野生株以及DH5α,經(jīng)改造J5菌株的LPS提取物對(duì)小鼠沒(méi)有造成明顯的臨床癥狀,且肝臟組織切片也確定沒(méi)有明顯病變,說(shuō)明該改造菌株的MPLA毒性顯著低于原野生株,該改造菌株更安全。

    盡管本研究已經(jīng)成功構(gòu)建了J5ΔlacI::lpxEΔlpxM重組菌,但是其產(chǎn)生的MPLA的佐劑效力仍有待進(jìn)一步通過(guò)動(dòng)物免疫試驗(yàn)驗(yàn)證和評(píng)估。而利用基因重組改造菌株生產(chǎn)并提取MPLA的技術(shù)思路,可以直接減少原生產(chǎn)的化學(xué)工藝流程中酸解和堿解的步驟,提高產(chǎn)品純度和產(chǎn)率,顯著降低生產(chǎn)成本,從而將廉價(jià)、高效的MPLA佐劑應(yīng)用于獸用疫苗。

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