基于TaqMan實時熒光PCR檢測鮮肉及加工制品中的鴨源性成分

劉國強(qiáng)　海小　羅建興

摘要：禽源性成分檢測既可以預(yù)防禽流感又能分析肉類的摻假問題。本研究參考行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（SN/T 2727-2010），對鴨和其它12種不同源性動物DNA進(jìn)行特異性檢測;將鴨來源DNA模板原液進(jìn)行梯度稀釋確定其檢出限，同時進(jìn)行靈敏度實驗和摻假實驗;在加工制品中檢測其適用性。結(jié)果表明：此引物和探針特異性強(qiáng)，只針對鴨有特異性擴(kuò)增曲線，對其它12種動物源性無擴(kuò)增曲線;當(dāng)鴨模板DNA濃度為10fg·μL-1時，仍能檢測到鴨源性，靈敏度可達(dá)到1%，同時可以很好地檢測摻假;此引物和探針在加工制品中檢測結(jié)果良好，適用于加工肉制品的檢測。本實驗通過所建立標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.4554x+42.663，R2=0.9942，其PCR擴(kuò)增效率為95%，可以有效地進(jìn)行定量。同時利用靈敏度檢測可以判斷此方法的摻假檢測能力較強(qiáng)。綜上所述，本研究可以有效檢測鴨源性的摻假問題，并能為標(biāo)準(zhǔn)提供一定的借鑒。

關(guān)鍵詞：鴨源性成分;特異性;檢出限;靈敏度;加工制品;定量檢測

中圖分類號：S-3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

作者簡介：劉國強(qiáng)（1994-），男，本科，研究實習(xí)員。研究方向：動物源性成分檢測和轉(zhuǎn)基因成分檢測;通訊作者郭梁（1986-），男，博士，助理研究員。研究方向：動物源性成分檢測和轉(zhuǎn)基因成分檢測以及微生物資源開發(fā)。

肉類是人們飲食中不可缺少的一部分，其含有多種營養(yǎng)物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、脂肪以及微量元素等）[1，2]。目前在肉及肉制品的生產(chǎn)和運(yùn)輸中會時常發(fā)生一些摻假的問題[3-6]，如將雞、鴨肉（低價肉）摻雜到牛、羊肉（高價肉）中。動物源性檢測技術(shù)針對上述問題，除了能保護(hù)消費者合法權(quán)益、維持市場公平交易機(jī)制，還能預(yù)防動物來源性疾病的傳播（瘋牛病、口蹄疫、牛海綿狀腦病等）[7-10]。

目前，動物源性檢測技術(shù)建立在對樣品蛋白質(zhì)、脂肪酸以及核酸等種屬特異分子鑒別肉與肉制品的動物來源[11-15]。動物源性檢測所涉及的技術(shù)手段包括電泳[16，17]、免疫組化[18，19]、質(zhì)譜[20]、色譜[21]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction， PCR）[22，23]。因為脫氧核糖核酸（DNA）的熱穩(wěn)定性[24]，使得以DNA為基礎(chǔ)的PCR技術(shù)成為了檢測動物源性檢測主流技術(shù)[25，26]。其中，熒光染料（SYBR Green 或Eva Green）[27，28]和TaqMan探針[29，30]成為了PCR檢測的主要技術(shù)。探針技術(shù)因為其種屬特異性探針提高了實時熒光PCR的擴(kuò)增效率和特異性，從而快速并且準(zhǔn)確地得到檢測結(jié)果。

本文參考行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（SN/T 2727-2010）[31]，建立肉與肉制品中鴨源性成分的TaqMan實時熒光PCR檢測方法，保證鴨源性成分的快速檢測，規(guī)范食品市場。

1材料與方法

1.1樣品準(zhǔn)備

鮮肉及加工肉制品均購買于本地農(nóng)貿(mào)市場，鮮肉包括鴨肉、羊肉、牛肉、豬肉、馬肉、鹿肉、驢肉、兔肉、狗肉、鵪鶉肉、雞肉、火雞肉和鴿子肉。加工肉制品包括口口丫鴨翅根、口口丫蜜汁烤腿、金鑼火腿腸、肉粒多火腿腸、尚清齋烤腸、蒙羊羊肉干、呼納斯牛肉干。樣品采集處理去除脂肪，并用滅菌水清洗，置于-20℃保存。

1.2試劑

TransStart Probe qPCR SuperMix （北京全式金生物技術(shù)有限公司）;實時熒光定量PCR引物和探針合成（北京睿博興科公司）;Takara MiniBEST Universal基因組提取試劑盒（寶生物工程（大連）有限公司）。

1.3儀器

Eppendorf 5418R Centrifuge高速臺式離心機(jī)（德國Eppendorf AG公司）;Nanodrop 2000c 核酸蛋白測定儀（美國Thermo Fisher公司）;7300plus實時熒光PCR擴(kuò)增儀（美國ABI公司）。

1.4方法

1.4.1引物和探針

引物和探針均由北京睿博興科公司合成。引物與探針序列如下表1。

1.4.2DNA提取

取1.1準(zhǔn)備好的鮮肉和肉制品樣品，利用Takara MiniBEST Universal基因組提取試劑盒其DNA，利用Nanodrop 2000c核酸蛋白分析儀測量其濃度，將母液稀釋至100ng·μL-1左右，保存于-20℃。

1.4.3反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

反應(yīng)體系（總體積20μL）：TransStart Probe qPCR SuperMix 10μL，左右引物各1μL，探針1μL，模板2μL，補(bǔ)ddH2O至20μL。

反應(yīng)條件：95℃5min，1個循環(huán);95℃5s，60℃30s，45個循環(huán)，在每次循環(huán)退火時收集熒光信號。

1.4.4特異性實驗

分別取鴨、羊、牛、豬、馬、鹿、驢、兔、狗、鵪鶉、雞、火雞和鴿子13種不同源性動物DNA模板進(jìn)行鴨源性特異性分析實驗。

1.4.5檢出限檢測實驗

從100ng·μL-1的鴨肉模板DNA稀釋液加滅菌ddH2O開始稀釋，每1/10稀釋1次，共稀釋7次。分別為100ng·μL-1、10ng·μL-1、1ng·μL-1、0.1ng·μL-1、0.01ng·μL-1、0.001ng·μL-1、0.0001ng·μL-1、0.00001ng·μL-1的鴨肉模板DNA稀釋液進(jìn)行檢出限檢測實驗。

1.4.6靈敏度和模擬摻假實驗

將鴨肉DNA與羊肉DNA以一定比例混合，制成鴨肉DNA含量分別為1%、5%、10%、30%、70%、90%、95%、99%的混合DNA樣品，進(jìn)行模擬摻假檢測實驗，同時依照1.4.3反應(yīng)體系對該方法的靈敏度進(jìn)行分析，每次實驗設(shè)3個平行。

1.4.7數(shù)據(jù)處理

利用Real-Time PCR Software 對結(jié)果進(jìn)行擴(kuò)增曲線和循環(huán)（Cycle threshold，Ct）的分析。每次實驗結(jié)果都是3個平行實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2結(jié)果與分析

2.1特異性實驗

將鴨、羊、牛、豬、馬、鹿、驢、兔、狗、鵪鶉、雞、火雞、鴿子的模板DNA（如圖1、表2所示），分別利用鴨的引物和探針進(jìn)行實時熒光定量PCR實驗，特異性擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳處理之后如圖3所示，產(chǎn)物條帶均為單一條帶，無非特異性擴(kuò)增，說明引物和探針組合具有較高的特異性。由圖2和表2可以看出，僅鴨的樣品出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，Ct值為14.01±0.18（鴨肉樣品1），13.92±0.35（鴨肉樣品2），13.86±0.12（鴨肉樣品3），13.78±0.43（鴨肉樣品4），13.74±0.07（鴨肉樣品5），其它12種動物（其它肉樣：羊、牛、豬、馬、鹿、驢、兔、狗、鵪鶉、雞、火雞和鴿子）均未有出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線且Ct值均為0。

2.2檢出限檢測實驗

通過鴨引物和探針對100ng·μL-1、10ng·μL-1、1ng·μL-1、0.1ng·μL-1、0.01ng·μL-1、0.001ng·μL-1、0.0001ng·μL-1、0.00001ng·μL-18個不同質(zhì)量濃度梯度的樣品DNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增實驗。結(jié)果如圖4所示和表3所示。由圖4和表3可知，稀釋至0.00001ng（即10fg）的鴨基因組DNA模板（3個平行實驗）出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，Ct值為38.37±0.19;以擴(kuò)增結(jié)果Ct<40時判定為確認(rèn)檢出，上述結(jié)果表明此探針已達(dá)到檢出限度，說明鴨特異性引物和探針的檢測限度可達(dá)到10fg。

2.3定量檢測

利用100ng·μL-1、10ng·μL-1、1ng·μL-1、0.1ng·μL-1、0.01ng·μL-1、0.001ng·μL-1、0.0001ng·μL-1、0.00001ng·μL-1的鴨肉模板DNA稀釋液，進(jìn)行引物和探針的檢測，制作鴨源性定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖5所示。所得鴨的特異性探針的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.4554x+42.663，R2=0.9942。由于PCR擴(kuò)增效率E（%）=[10（-1/slope）-1]×100，其PCR擴(kuò)增效率為95%，PCR效率的接受范圍在90%～110%[32，33]，對應(yīng)于回歸斜率在-3.1～-3.6，R2值≥0.98。綜上所述，此方法具有較好的定量檢測能力。

2.4靈敏度實驗

因為鴨肉經(jīng)常被摻雜到羊肉中，所以本實驗通過鴨引物和探針對鴨組分DNA和羊組分DNA混合樣（鴨組分含量分別為1%、5%、10%、30%、70%、90%、95%、99%）進(jìn)行模擬摻假實驗，結(jié)果如圖6所示，具體數(shù)值如表4所示。由圖6和表4可知，當(dāng)混合DNA樣品中鴨組分含量為1%時，出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，Ct值為27.34±0.71。因為當(dāng)混合DNA樣品中鴨組分含量為1%時，3個平行中均出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，所以可以證明此探針對鴨肉摻假羊肉檢測效果明顯，同時上述結(jié)果能充分證明此引物和探針具有較高的靈敏度。

2.5加工肉制品的檢測

提取1.1中已處理好加工肉制品的DNA，進(jìn)行實驗。其擴(kuò)增曲線結(jié)果和Ct值如表5和圖7所示。

3討論

與實時熒光PCR技術(shù)相比，普通PCR檢測的普遍弱點就是耗時長[25-27]，檢測人員常常需要花費大量時間來對實驗進(jìn)行重復(fù)工作，而且一個實驗結(jié)果通常都需要進(jìn)行一系列實驗才能得出。而實時熒光定量PCR由于添加了TaqMan探針和熒光信號，使得其靈敏度與特異性都高于普通PCR，特別是檢測大批量樣品時其優(yōu)勢尤為明顯。實時熒光定量PCR不僅能夠?qū)崟r監(jiān)測，同時得到檢測的結(jié)果迅速，在1～2h就可以得到結(jié)果，而且結(jié)果簡單直觀，易于分析。

本研究通過出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（SN/T 2727-2010）合成檢測鴨源性成分的引物和探針，通過實驗探索了最佳的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。創(chuàng)新點在于基于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，增加了特異性實驗、檢出限實驗、模擬摻假實驗和適用性實驗，并且通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線來評價方法的定量檢測能力。本研究對鴨、羊、牛、豬、馬、鹿、驢、兔、狗、鵪鶉、雞、火雞和鴿子13種不同源性動物進(jìn)行特異性實驗。結(jié)果顯示，只有鴨肉有特異性擴(kuò)增，其它動物均沒有;將鴨來源的DNA模板原液進(jìn)行濃度梯度稀釋，分別為100ng·μL-1、10ng·μL-1、1ng·μL-1、0.1ng·μL-1、0.01ng·μL-1、0.001ng·μL-1、0.0001ng·μL-1、0.00001ng·μL-1的鴨肉模板DNA稀釋液進(jìn)行檢出限檢測實驗，檢出限為10fg;建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，其PCR擴(kuò)增效率為95%，在90%～110%，標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=0.9942≥0.98可以評價此引物和探針定量檢測能力較好。同時還將鴨模板DNA與羊模板DNA按照1%、5%、10%、30%、70%、90%、95%、99%體積比例混合來模擬摻假實驗。結(jié)果顯示，鴨模板DNA體積比例為1%時仍可以檢測到鴨源性，同時證明此引物和探針的靈敏度可達(dá)1%。通過實時熒光PCR在鴨翅根、蜜汁烤腿、金鑼火腿腸、肉粒多火腿腸、尚清齋烤腸、蒙羊羊肉干、呼納斯牛肉干進(jìn)行適用性實驗，只有在具有鴨源性的鴨翅根和蜜汁烤翅中才能檢測到鴨源性，說明此引物和探針適用性較好。

本方法的檢出限為10fg，在本研究中的引物和探針組合與已報道的研究相比具有較大的優(yōu)勢，同時檢出限已超越了之前的研究[37-39]。林彥星等[40]建立了實時熒光定量PCR檢測畜禽肉制品中的鴨源性成分，可檢測到1.0pg鴨源DNA的存在;金萍等[41]基于鴨線粒體細(xì)胞色素Cytb基因建立了肉制品中鴨源性成分檢測的Real-time PCR檢測方法，檢出限為8pg;史艷宇等[42]建立了一種快速、特異、靈敏的鴨源性成分檢測方法，其檢出限為1.0mg;張弛等[43]建立肉制品中鴨源性成分定性和定量檢測的檢出限達(dá)到1.78pg;張秀平等[44]設(shè)計可特異檢測鴨肉成分的引物和探針，其檢出限為1pg;程欣[45]建立了添加有擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的用于檢測食品中鴨肉成分的實時熒光PCR方法，可檢出0.05ng的鴨DNA;董洋洋[46]建立了鑒別鴨肉單一成分的實時熒光PCR的方法檢測快速準(zhǔn)確，檢出限可達(dá)0.2ng。上述研究的檢出限均低于本研究。

綜上所述，此方法具有較強(qiáng)的特異性、較高的靈敏度和適用性廣等特點。可以有效檢測摻假，從而維護(hù)消費者權(quán)益和防止禽類疾病的傳播，為推動肉類食品領(lǐng)域向透明化、標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)展提供技術(shù)支持。

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（責(zé)任編輯 李媛媛）