陳燕燕,徐 魏,向 力,岳 靜,李興元,王 露,鄭 飛 ,唐俊明,4,鄭 敏
心力衰竭是一種預(yù)后不良的臨床綜合征,其特征是運動不耐受、早期疲勞和與萎縮相關(guān)的骨骼肌病[1],骨骼肌病是心力衰竭患者運動能力受限的主要決定因素[2]。長期以來交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活和副交感神經(jīng)系統(tǒng)的抑制被認為是心力衰竭臨床綜合征的表現(xiàn)[3]。有研究[1]表明交感神經(jīng)長期過度激活會導(dǎo)致心力衰竭患者誘發(fā)骨骼肌病,但相關(guān)機制知之甚少。課題組之前已證實異丙腎上腺素的持續(xù)刺激通過激活β1受體并失活β2受體抑制小鼠成肌細胞C2C12的分化、融合和肌管形成[4],但是否α受體也參與了交感神經(jīng)長期過度激活誘發(fā)骨骼肌病的病理過程,未有研究涉及。該研究應(yīng)用選擇性α2受體激動劑—右美托咪定刺激C2C12細胞,來揭示交感神經(jīng)長期過度激活與C2C12細胞增殖、分化和肌管形成的關(guān)系。
1.1 材料C2C12成肌細胞系(簡稱C2C12細胞)購自中國科學(xué)院上海細胞庫;胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司;馬血清購自美國Gibco公司;0.25%胰蛋白酶購自武漢安特捷生物技術(shù)有限公司;熒光倒置顯微鏡購自日本尼康公司;高糖DMEM購自美國Gibco公司。
1.2 方法
1.2.1CCK-8法檢測右美托咪定對C2C12細胞增殖的影響 取1 ml待傳代的C2C12細胞懸液接種于75 cm2的培養(yǎng)皿中,加入含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基(增殖培養(yǎng)基),調(diào)整細胞密度為 1×105/ml,將C2C12細胞接種于4個96孔板中,每個96孔板接種30個孔,每孔接種100 μl細胞懸液,將全部96孔板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待C2C12細胞增殖培養(yǎng)24 h后,將增殖培養(yǎng)基換成無血清高糖培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每個96孔板的30個孔分為6個實驗分組,每組5個復(fù)孔,6個實驗分組分別為對照組(右美托咪定0 mmol/L)和右美托咪定5個濃度梯度組(5、10、20、40、80 mmol/L)。將無血清高糖培養(yǎng)基換成增殖培養(yǎng)基,并按分組分別加入不同濃度的右美托咪定,4個96孔板分別培養(yǎng)12、24、48、72 h后,向每孔加入10 μl CCK-8溶液,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5 h,然后用酶標儀測定每孔細胞在450 nm處的吸光度值。
1.2.2C2C12細胞分化體系的建立 C2C12細胞常規(guī)復(fù)蘇并接種于75 cm2的培養(yǎng)皿中, 培養(yǎng)條件為含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基(增殖培養(yǎng)基),置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞增殖融合達80%~90%時,按1 ∶3傳代,傳代的C2C12細胞按上述條件繼續(xù)培養(yǎng), 以備后續(xù)實驗用。C2C12細胞在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng), 待細胞增殖融合至70%時, 換用含2%馬血清的高糖DMEM培養(yǎng)基(分化培養(yǎng)基)誘導(dǎo)C2C12細胞分化。每隔1 d換1次分化培養(yǎng)基, 同時每天在顯微鏡下觀察細胞的分化情況。
1.2.3實驗分組及給藥方式
1.2.3.1實驗分組 右美托咪定按濃度梯度分成6組:對照組(0 mmol/L),實驗組(5、10、20、40、80 mmol/L)。單次給藥和連續(xù)單次給藥均按這6組濃度梯度給藥。
1.2.3.2右美托咪定的給藥方式 單次給藥:在增殖培養(yǎng)基中C2C12細胞增殖融合至70%時, 換成分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)C2C12細胞分化, 此時加入右美托咪定, 隨后不再加入右美托咪定,并每隔1 d換分化培養(yǎng)基; 連續(xù)培養(yǎng)6 d。連續(xù)單次給藥: 在增殖培養(yǎng)基中C2C12細胞增殖融合至70%時, 換成分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)C2C12細胞分化, 此時加入右美托咪定, 隨后每天加入右美托咪定,并每隔1 d換分化培養(yǎng)基,連續(xù)培養(yǎng)6 d。
1.2.4細胞免疫熒光化學(xué)檢測 C2C12細胞按每孔1.25×104/ml密度接種于24孔板中, 待細胞貼壁并增殖融合至70%時,換成分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)C2C12細胞分化, 按上述實驗分組分別單次給藥和連續(xù)單次給藥,連續(xù)培養(yǎng)6 d,然后棄分化培養(yǎng)基,1×PBS連續(xù)清洗3次,4%的多聚甲醛固定15 min, 再用1×PBS振蕩清洗3次, 每次5 min, 然后用5%的山羊血清和0.3%Triton X-100室溫封閉1 h。封閉后的細胞每孔分別加入抗體稀釋液稀釋的肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain,MYH)(貨號:sc-376157, 抗體稀釋:1 ∶100,美國Santa Cruze公司),肌細胞增強因子2C(myocyte enhancer factor 2C,MEF2C)(貨號:#5030,抗體稀釋:1 ∶400,美國Cell Signaling Technology公司),肌細胞生成蛋白(myogenin,MyoG)(貨號:sc-12732,抗體稀釋:1 ∶50,美國Santa Cruze公司),其中MYH和MEF2C加入同一孔中,進行熒光雙染,MyoG加入不同孔中,進行熒光單染,將24孔板放入4 ℃冰箱孵育過夜。然后用1×PBS振蕩清洗3次, 每次5 min,在加了MYH和MEF2C熒光一抗的孔中加入抗兔的熒光二抗(1 ∶300), 在加了MyoG的熒光一抗的孔中加入抗鼠的熒光二抗(1 ∶300),室溫孵育1 h, 再用1×PBS振蕩清洗3次, 每次5 min,后加入DAPI 200 μl, 避光室溫15 min,再用1×PBS振蕩清洗3遍, 每次5 min,然后在倒置熒光顯微鏡下觀察并攝片。
2.1 α2腎上腺素能受體在C2C12細胞的表達特征免疫熒光結(jié)果顯示, 在C2C12細胞的增殖、分化階段呈現(xiàn)出α2腎上腺素能受體陽性的特征(圖1)。
圖1 α2腎上腺素能受體在增殖和分化C2C12細胞的表達特征 ×200A: 增殖階段;B:分化階段
2.2 右美托咪定對C2C12細胞增殖的影響CCK-8結(jié)果顯示,第12、24、48、72 h分組中,與對照組相比,除第12 h分組中,只右美托咪定(40、80 mmol/L)兩個高濃度組呈抑制C2C12細胞增殖外,其他3個分組中,不同濃度的右美托咪定均抑制C2C12細胞的增殖,且隨著濃度的增加,抑制作用越明顯(圖2)。
圖2 CCK-8法檢測不同濃度右美托咪定對C2C12細胞增殖的影響與對照組比較:*P<0.05
2.3 C2C12細胞分化體系的建立C2C12細胞經(jīng)常規(guī)傳代后接種在75 cm2的培養(yǎng)皿中, 在倒置顯微鏡下觀察, 細胞貼壁鋪開后多呈梭形或有突起,核為橢圓形, 單核, 核仁明顯。待細胞增殖至70%時, 更換為分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)C2C12細胞分化。分化的細胞呈現(xiàn)多核、串珠樣排列, 并形成肌管。第0、2、4、6天相比,隨著時間的推移肌管細胞核融合數(shù)目逐漸增多,且在分化第6天達到高峰(圖3)。
2.4 不同給藥方式下,右美托咪定對C2C12細胞分化的影響免疫熒光結(jié)果顯示,不論單次給藥還是連續(xù)單次給藥,與對照組相比,右美托咪定均呈現(xiàn)抑制肌管形成(MYH)和MEF2C、MyoG表達的現(xiàn)象,但連續(xù)單次給藥組抑制肌管形成(MYH)和MEF2C、MyoG表達的作用比單次給藥組顯著(圖4、5、6)。 將肌管分成細胞核融合數(shù)目為3~5、5~10、>10的3個不同分組,顯示在較高濃度組(20、40、80 mmol/L組),連續(xù)單次給藥抑制肌管形成的作用強于單次給藥,3個肌管細胞核融合數(shù)目分組均抑制,而單次給藥只在細胞核融合數(shù)目>10組抑制作用差異有統(tǒng)計學(xué)意義。其中,肌管細胞核融合的3個分組中,右美托咪定(80 mmol/L)組與對照組相比,單次給藥組:F=1.30,P<0.05;F=2.26,P<0.5;F=8.55,P<0.05;連續(xù)單次給藥組:F=25.83,P<0.05;F=9.00,P<0.05;F=1.45,P<0.05(圖4、5)。
圖4 單次給予不同濃度右美托咪定對C2C12細胞分化、融合為多細胞核的肌管數(shù)和MEF2C表達的影響 ×200A: 單次給不同濃度右美托咪定逐漸抑制C2C12細胞分化的肌管形成(MYH)和MEF2C表達的免疫熒光細胞化學(xué)染色; B~D:單次給不同濃度右美托咪定對C2C12細胞分化為含有不同數(shù)目細胞核的肌管數(shù)的影響;綠色:MYH陽性;紅色:MEF2C陽性;藍色:DAPI染的細胞核;與對照組比較:*P<0.05
圖5 連續(xù)單次給予不同濃度右美托咪定對C2C12細胞分化、融合為多細胞核的肌管數(shù)和MEF2C表達的影響 ×200A:連續(xù)單次給不同濃度右美托咪定逐漸抑制C2C12細胞分化的肌管形成(MYH)和MEF2C表達的免疫熒光細胞化學(xué)染色;B~D:連續(xù)單次給不同濃度右美托咪定對C2C12細胞分化為含有不同數(shù)目細胞核的肌管數(shù)的影響;綠色:MYH陽性;紅色:MEF2C陽性;藍色:DAPI染的細胞核;與對照組比較:*P<0.05
圖6 單次和連續(xù)單次給予不同濃度右美托咪定對C2C12細胞分化的MyoG表達的影響 ×200A: 單次給不同濃度右美托咪定逐漸抑制C2C12細胞分化的MyoG表達的免疫熒光細胞化學(xué)染色; B:連續(xù)單次給不同濃度右美托咪定逐漸抑制C2C12細胞分化的MyoG表達的免疫熒光細胞化學(xué)染色;綠色:MyoG陽性;藍色:DAPI染的細胞核
2.5 不同分化時間,右美托咪定對C2C12細胞分化的影響免疫熒光結(jié)果顯示,右美托咪定(20 mmol/L)組與對照組相比,在C2C12細胞分化的第2、4、6天均呈現(xiàn)右美托咪定抑制肌管形成(MYH)和MEF2C、MyoG表達的現(xiàn)象,且隨時間的延長,抑制作用越明顯(圖7)。
圖7 連續(xù)單次給予右美托咪定(20 mmol/L)時間依賴性抑制C2C12細胞分化、融合、肌管形成和MEF2C、MyoG的表達 ×200A:用免疫熒光染色法檢測不給予或連續(xù)單次給予右美托咪定(20 mmol/L)后C2C12細胞分化第2、4、6天的肌管形成(MYH)和MEF2C表達;綠色:MYH陽性;紅色:MEF2C陽性;藍色:DAPI染的細胞核;B:用免疫熒光染色法檢測不給予或連續(xù)單次給予右美托咪定(20 mmol/L)后C2C12細胞分化第2、4、6天的MyoG表達;綠色:MyoG陽性;藍色:DAPI染的細胞核
本研究利用國內(nèi)外通用的C2C12細胞作為研究對象,用免疫熒光的方法首次證實了C2C12細胞在增殖、分化階段均有α2受體的表達,提示交感神經(jīng)過度激活分泌的兒茶酚胺可能通過與骨骼肌上的α2受體結(jié)合而發(fā)揮作用。在增殖階段,用CCK-8法證實了右美托咪定在C2C12細胞增殖的第12、24、48、72 h均能抑制其增殖,且有濃度依賴性,說明交感神經(jīng)過度激活可能通過抑制成肌細胞的增殖而導(dǎo)致骨骼肌萎縮。在分化階段,利用C2C12細胞建立了骨骼肌細胞的分化體系, 免疫熒光結(jié)果證實連續(xù)單次給藥,與對照組相比,不同濃度右美托咪定均抑制C2C12的分化和肌管的形成,且隨著濃度的增加,抑制作用越明顯;而單次給藥,只有在高濃度組,才有明顯的抑制作用。而且在連續(xù)單次給藥組,C2C12細胞分化進而導(dǎo)致多細胞融合形成肌管的能力隨著濃度的增加而逐漸降低, 這與臨床交感神經(jīng)長期過度激活造成骨骼肌萎縮的臨床表現(xiàn)一致。所以連續(xù)單次給予右美托咪定建立模擬機體交感神經(jīng)長期過度激活造成骨骼肌萎縮的模型更接近臨床,且更有臨床意義。
骨骼肌再生是一個高度復(fù)雜的過程,是由肌肉特異性調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子(myogenic regulatory factors,Mrfs)家族和MEF2家族共同參與的[5]。Mrfs家族包括肌原性分化抗原(MyoD)、MyoG、肌源性因子5(Myf5)和肌源性調(diào)節(jié)因子4(Mrf4);MEF2家族包括MEF2A、-B、-C and -D,這兩類轉(zhuǎn)錄因子直接相互作用,為骨骼肌基因的激活建立了獨特的轉(zhuǎn)錄密碼[6]。其中MyoG的表達發(fā)生在肌管形成開始時,是導(dǎo)致C2C12細胞融合的關(guān)鍵因素[7];而激活的MEF2C誘導(dǎo)并加強C2C12細胞的分化[6,8]。
本研究同時分析了右美托咪定對C2C12細胞分化過程中MyoG和MEF2C表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)右美托咪定抑制MEF2C和MyoG表達的作用與抑制C2C12細胞分化、融合及肌管形成(MYH)和的作用相一致,同樣具有濃度依賴性,同樣是連續(xù)單次給藥比單次給藥抑制作用明顯,提示右美托咪定抑制肌管形成(MYH)與抑制MEF2C、MyoG的表達有關(guān)。
由于連續(xù)單次給藥組的右美托咪定(20 mmol/L)抑制C2C12細胞的肌管形成,但不影響C2C12細胞的數(shù)量,故利用免疫熒光分別測定對照組和連續(xù)單次給藥的右美托咪定(20 mmol/L)組中C2C12細胞分化第2、4、6天的肌管形成情況和MEF2C、MyoG的表達水平,結(jié)果顯示,與對照組相比,右美托咪定(20 mmol/L)組抑制C2C12細胞分化第2、4、6天的肌管形成(MYH)和MEF2C、MyoG的表達,且隨著時間的延長,抑制作用越明顯,從而進一步驗證了右美托咪定對C2C12細胞從分化到肌管形成的整個過程均有抑制作用。
綜上,本研究首次證實了C2C12細胞在增殖、分化階段均有α2受體的表達,且右美托咪定可能通過與C2C12細胞上的α2受體結(jié)合而抑制C2C12細胞的增殖、分化和肌管形成,而MEF2C和MyoG表達的變化特征說明右美托咪定通過抑制MEF2C和MyoG的表達而抑制C2C12細胞的分化和肌管形成,但右美托咪定對C2C12細胞抑制作用的具體分子機制在本研究中并未涉及,需進一步探究。本研究首次證實了心力衰竭患者交感神經(jīng)長期過度激活導(dǎo)致的骨骼肌病可能涉及的新機制,為臨床骨骼肌病的發(fā)病機制提供了實驗依據(jù)。