繼發(fā)性白血病患者T細(xì)胞亞群檢測(cè)

葉倩舲，宋明珠，王會(huì)平，肖 浩，翟志敏

急性髓系白血病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，據(jù)既往有無治療和疾病史，通?？蓪⑵浞譃樵l(fā)性急性髓系白血病(primary acute myeloid leukemia，P-AML)和繼發(fā)性髓系白血病(secondary acute myeloid leukemia，S-AML)兩類。S-AML是指前期存在骨髓增生異常綜合征或有明確職業(yè)及環(huán)境暴露史 ，或繼發(fā)于放、化療之后所形成的白血病[1]。與P-AML比較，S-AML發(fā)病率較低，但治療過程更為復(fù)雜，生存期更短，預(yù)后更差[2]。該文旨在了解與分析S-AML患者的T細(xì)胞亞群，為進(jìn)一步探究其發(fā)病機(jī)制奠定相關(guān)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病例資料2010年1月～2019年11月安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院收住的17例S-AML患者、23例P-AML患者。

1.2 主要試劑與儀器CD25-FITC、CD127-PE、CD4-PC5、CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5試劑盒，以及相關(guān)同型對(duì)照抗體購自美國Beckman-Coulter公司；溶血?jiǎng)?.83%的氯化銨溶液，由本實(shí)驗(yàn)室加去離子蒸餾水自行配制；流式細(xì)胞儀為美國Beckman-Coulter公司臨床應(yīng)用型流式細(xì)胞儀FC500，分析軟件為CXP軟件。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法外周靜脈血2 ml，肝素鈉抗凝。采用直接熒光法標(biāo)記細(xì)胞膜表面各個(gè)抗原(包括CD3、CD4、CD8、CD25和CD127)，檢測(cè)不同T淋巴細(xì)胞亞群比：識(shí)別總T淋巴細(xì)胞(CD3+T細(xì)胞)、輔助性T淋巴細(xì)胞(CD3+CD4+T細(xì)胞)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CD3+CD8+T細(xì)胞)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞，CD4+CD25+CD127low)和活化效應(yīng)性T細(xì)胞(Teff細(xì)胞群，CD4+CD25+CD127hi)。具體方法如下：取2個(gè)試管分別加入抗凝全血100 μl，其中一管加入檢測(cè)抗體各10 μl，另一管加入相應(yīng)的同型對(duì)照抗體各10 μl，混勻后室溫下避光反應(yīng)15 min；加溶血?jiǎng)? 000 μl混勻，室溫下放置10 min；立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

開機(jī)后對(duì)流式細(xì)胞儀進(jìn)行光路和流路質(zhì)量控制和熒光補(bǔ)償，使儀器各項(xiàng)指標(biāo)在質(zhì)量控制的允許值范圍。檢測(cè)樣本時(shí)根據(jù)前向散射光信號(hào)( forward sCattering，F(xiàn)SC)和側(cè)向散射光信號(hào)(side sCattering，SSC)對(duì)淋巴細(xì)胞群設(shè)門，每份標(biāo)本獲取淋巴細(xì)胞10 000個(gè)以上，數(shù)據(jù)以Listmode文件形式保存。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理Excel 2007錄入數(shù)據(jù)，IBM-SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布采用均值標(biāo)準(zhǔn)差描述，組間比較采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)采用LSD法進(jìn)行多組間兩兩比較；偏態(tài)分布資料采用M(P25，P75)描述，組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行多組間兩兩比較(調(diào)整檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.017)；定性資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料S-AML患者17例，男10例，年齡25～78(56.94±16.52)歲；陽性對(duì)照組，P-AML患者23例，男10例，年齡20～82(56.74±16.44)歲；健康對(duì)照34例，男13例，年齡26～77(48.38±14.95)歲。3組年齡(F=2.629，P=0.079)、性別(χ2=1.961，P=0.375)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中S-AML、P-AML診斷均符合世界衛(wèi)生組織急性髓系白血病診斷標(biāo)準(zhǔn)。S-AML組患者一般信息見表1。

表1 S-AML組研究對(duì)象一般情況

2.2 不同T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)結(jié)果Treg細(xì)胞在3組間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，其中S-AML組Treg水平高于健康對(duì)照組與P-AML組(P<0.05)，P-AML組高于健康對(duì)照組(P<0.05)；Treg/Teff比例在3組間差異也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.014)，S-AML組比值高于健康對(duì)照組 (P=0.009)。與健康對(duì)照組相比，P-AML和S-AML患者其余的T細(xì)胞亞群包括CD3+CD4+T、CD3+CD8+T細(xì)胞數(shù)量及CD4/CD8比值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 S-AML、P-AML與對(duì)照組T淋巴細(xì)胞亞群各亞群檢測(cè)結(jié)果

3 討論

繼發(fā)性白血病由外國學(xué)者Smit et al[3]于1970年首次報(bào)道，發(fā)病率遠(yuǎn)低于P-AML。由于該病致病因素復(fù)雜，人們雖對(duì)其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了近50年的探索，然而迄今尚無法明確它的病理機(jī)制。現(xiàn)一般被分為兩類：一類為實(shí)體腫瘤經(jīng)過綜合化療繼發(fā)的S-AML，認(rèn)為與拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、烷化劑等化療治療相關(guān)；另一類則由多種髓系相關(guān)血液疾病轉(zhuǎn)化形成，包括骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS)、原發(fā)性骨髓纖維化( primary myelofibrosis，PMF)、慢性髓系白血病( chronic myeloid leukemia，CML)等，其中以MDS為主，這一類疾病均有著不同程度向急性白血病轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)。

MDS是一組起源于異質(zhì)性惡性造血干祖細(xì)胞的克隆性疾病，特征包括血細(xì)胞異型增生、無效造血，多見于老年人，具有程度不一的急性白血病轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)；造血細(xì)胞從正常的干細(xì)胞轉(zhuǎn)化成MDS細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜的過程，包括基因突變、抑癌基因缺失或功能不全、以及與分化增殖有關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)異常等[4]。PMF、CML等這一類骨髓增殖性疾病，其主要特點(diǎn)包括骨髓纖維組織增生，一系或多系髓系細(xì)胞過度增殖以致外周血過度聚集，疾病終末期多形成無效造血及轉(zhuǎn)化為急性白血病[5-6]。相較于原發(fā)性白血病，上述髓系血液系統(tǒng)疾病患者一旦轉(zhuǎn)化為急性白血病，自然病程更短，對(duì)化療藥物反應(yīng)敏感性及反應(yīng)性均較差，給臨床治療帶來極大困難。Treg細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)一群特殊的免疫細(xì)胞，在人類外周血CD4+T細(xì)胞中不足10%，但具有免疫抑制和免疫無能功能，被認(rèn)為在腫瘤性疾病中發(fā)揮著重要作用[7]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、消化系統(tǒng)腫瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病等多種腫瘤性疾病中，Treg細(xì)胞水平均明顯升高[8-9]，這可能是因?yàn)門regs細(xì)胞能夠抑制T、B淋巴細(xì)胞、NK、NKT等多種免疫細(xì)胞功能，導(dǎo)致機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)，從而使腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)升高[10-11]。

因此，對(duì)S-AML這種血液腫瘤的Treg細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)與分析有著重要的臨床意義。本研究表明，S-AML患者的Treg細(xì)胞比例及Treg/Teff細(xì)胞比值明顯高于健康對(duì)照及P-AML，提示這一類型白血病免疫狀態(tài)向抑制性偏移，其免疫失衡更為嚴(yán)重。Treg細(xì)胞的改變可能是S-AML形成的重要誘因之一，同時(shí)，S-AML患者化療效果不佳及生存期短也極有可能是由Treg細(xì)胞的改變?cè)斐傻摹?/p>

現(xiàn)今，隨著免疫學(xué)新技術(shù)的快速發(fā)展，去除機(jī)體某些特定細(xì)胞的技術(shù)日臻成熟。近期已有學(xué)者[12]提出在治療急性白血病及其它惡性腫瘤過程中，可以將對(duì)Treg細(xì)胞水平的調(diào)控作為一個(gè)新的潛在靶點(diǎn)。而S-AML患者免疫狀態(tài)更為失衡，外周血Treg細(xì)胞數(shù)量異常升高，降低或去除機(jī)體Treg細(xì)胞，使機(jī)體免疫抑制狀態(tài)解除，以及通過各種方式提高機(jī)體免疫功能，都有可能成為今后延緩S-AML病程，甚至達(dá)到治療目的的手段。而在大劑量化學(xué)治療的同時(shí)，找到如何調(diào)控機(jī)體免疫平衡這一研究亮點(diǎn)可能也為治療該類白血病提供新的方向。