涂陰肺結(jié)核的臨床特征及結(jié)核桿菌利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)對(duì)其診斷價(jià)值

沈雷雷，范曉云，包訓(xùn)迪

肺結(jié)核(pulmonary tuberculosis, TB) 是一種經(jīng)呼吸道傳播的慢性疾病。WHO 2018結(jié)核病報(bào)告，全球結(jié)核疫情仍顯嚴(yán)峻，2017年全球患者高達(dá)1 000萬例，其中約10.04萬例患者單耐利福平(resistance to rifampicin resistanc，RIF)，約130萬例患者因此死亡。當(dāng)前我國結(jié)核疫情也較嚴(yán)重，2017年新發(fā)結(jié)核病例數(shù)占全球比例近9%，其中耐利福平結(jié)核患者占13%，兩者均居世界第二位[1]。涂陰肺結(jié)核的診斷困難，痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性率較涂片有所升高但培養(yǎng)周期較長[2]，易延誤診治而導(dǎo)致病情惡化，嚴(yán)重影響患者肺功能及生活質(zhì)量。故尋找快速、高效的檢測(cè)手段對(duì)涂陰結(jié)核病早期診斷有重要意義。該文著重研究涂陰肺結(jié)核臨床特征以及結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(GeneXpert mycobacterium tuberculosis/rifampin,Gene Xpert-MTB/RIF)對(duì)其診斷意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料納入2018年6月1日～2019年6月1日阜陽市第二人民醫(yī)院結(jié)核科收治的400例初治肺結(jié)核患者，所有患者經(jīng)過臨床癥狀體征、影像學(xué)表現(xiàn)、免疫學(xué)檢查、病原學(xué)監(jiān)測(cè)及診斷性的抗結(jié)核治療后療效觀察，最終確診為肺結(jié)核，均符合新的結(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。將此400名患者以痰涂片抗酸染色(指不同時(shí)間：夜間痰、晨痰、即時(shí)痰涂片抗酸染色3次)陽性為標(biāo)準(zhǔn)分為涂陰組(162例)、涂陽組(238例)。涂陰組男性111例，男女比例：2.17 ∶1，年齡17～83(43.5±19.1)歲；涂陽組男性174例，男女比例：2.72 ∶1，年齡13～87(50.8±19.3)歲。兩組患者性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而年齡差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1.2 研究方法將納入的400例患者痰標(biāo)本進(jìn)行痰涂片檢查、結(jié)核菌培養(yǎng)及Gene Xpert-MTB/RIF檢測(cè)。痰涂片抗酸染色及結(jié)核菌培養(yǎng)的具體操作方法分別參照《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》[4]及《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)》[5]進(jìn)行。

BD960液體培養(yǎng)法：采集患者合格痰標(biāo)本5 ml置入離心管中，按照1:1比例加入4%N-乙酰-L-半胱氨酸處理液，機(jī)器振蕩20 s，放置20 min后加PBS液使混合液達(dá)50 ml。離心15 min后去除上清液。倒入1～3 ml PBS液所得懸濁液備用。將0.8 ml Growth Supplement溶解后的PANTA雜菌抑制劑加至7 ml培養(yǎng)管中，取處理后的標(biāo)本液0.5 ml接種在培養(yǎng)管中，運(yùn)用BD960快速培養(yǎng)觀察結(jié)果，結(jié)果陽性者行藥敏試驗(yàn)。

Gene Xpert-MTB/RIF檢測(cè)：取合格痰樣本加入標(biāo)本處理液混勻(1 ∶2)，取2 ml 混合液貼壁加入Gene Xpert-MTB/RIF試劑盒(美國Cepheid 公司)后連同試劑盒一起放入檢測(cè)器中檢測(cè)2 h，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)判讀出檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果判讀：△CT≥3.5，RIF檢出，判定利福平耐藥；△CT<3.5，RIF未檢出，則判定利福平敏感。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的臨床表現(xiàn)比較兩組患者比較：涂陰組患者發(fā)熱、咳嗽伴咳痰發(fā)生率分別為43.8%、77.8%，而涂陽組患者分別為55.9%、89.1%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組患者在咯血、盜汗、貧血及低蛋白血癥的發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組患者臨床表現(xiàn)比較 (n)

2.2 兩組患者血常規(guī)指標(biāo)比較兩組患者比較示：涂陽組患者中性粒細(xì)胞(neutrophils,NEUT)水平顯著高于涂陰組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組患者中白細(xì)胞(white blood cell,WBC)、單核細(xì)胞(monocyte,Mono)、淋巴細(xì)胞(lymphocyte,Lym)、血紅蛋白(hemoglobin,HB)及血小板(platelet,PLT)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組患者血常規(guī)指標(biāo)比較

2.3 兩組患者影像學(xué)表現(xiàn)比較兩組患者比較：涂陽組患者發(fā)生肺部干酪性肺炎、雙側(cè)肺葉受累或累計(jì)3個(gè)肺葉以上、合并空洞形成的比例顯著高于涂陰組，發(fā)生胸膜炎、肺纖維化顯著低于涂陰組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而在主要病變類型、有無縱隔和(或)肺門淋巴結(jié)腫大兩組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表3。

表3 兩組患者影像學(xué)表現(xiàn)比較

2.4 兩組患者合并癥比較兩組患者比較：涂陽組患者合并糖尿病、慢性阻塞性肺病比例顯著高于涂陰組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。合并類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肺癌、慢性乙型病毒性肝炎、高血壓及冠心病的比較，兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 兩組患者合并癥比較

2.5 兩組患者痰病原學(xué)檢查結(jié)果涂陰肺結(jié)核患者痰標(biāo)本結(jié)核桿菌培養(yǎng)有20例為陽性，陽性率12.35%，Gene Xpert-MTB/RIF檢測(cè)陽性則有29例，陽性率17.90%。以BD960液體快速結(jié)核桿菌培養(yǎng)法作為金標(biāo)準(zhǔn)，Gene Xpert-MTB/RIF技術(shù)檢測(cè)涂陰肺結(jié)核的敏感度為90.0%，特異度為92.3%，陽性預(yù)測(cè)值為62.07%，陰性預(yù)測(cè)值為98.50%，一致率為91.98%，提示兩者具有極好的一致性。見表5。

表5 兩組患者痰Gene Xpert-MTB/RIF和痰BD960液體培養(yǎng)一致率比較

3 討論

有研究[6]表明近距離的飛沫傳播是我國結(jié)核病傳播的主要方式(31%)，其中35%以上的傳染源為痰涂片陰性而結(jié)核桿菌培養(yǎng)陽性的患者。據(jù)有關(guān)統(tǒng)計(jì)，我國涂陰肺結(jié)核的發(fā)病率由2005年的31.86/10萬上升至2014年的39.28/10萬，9年時(shí)間增加了23.29%，已超過涂陽肺結(jié)核所占比例，成為我國肺結(jié)核疫情的重要負(fù)擔(dān)[7]。所以，涂陰肺結(jié)核的早期診斷和治療對(duì)結(jié)核疫情控制至關(guān)重要。

Gene Xpert-MTB/RIF檢測(cè)基于PCR技術(shù)，其目的靶基因?yàn)閞poB。系統(tǒng)自動(dòng)提取DNA后檢測(cè)擴(kuò)增的rpoB基因，采用A～E 6種不同的分子探針同時(shí)選擇性地覆蓋rpoB基因的核心區(qū)，辨別該患者是否存在利福平耐藥情況。為識(shí)別DNA擴(kuò)增及其檢測(cè)效率，采用一種球芽孢桿菌的特異探針作為內(nèi)對(duì)照。有研究[8]表明95%以上利福平耐藥菌株中存在rpoB基因的變異，且變異的rpoB基因核酸序列相同，由此可以說明通過對(duì)rpoB基因檢測(cè)可以鑒別利福平耐藥菌株。通過檢測(cè)rpoB基因可以在一定程度上診斷結(jié)核病。Gene Xpert-MTB/RIF是一種體外定量PCR檢測(cè)技術(shù)，半自動(dòng)操作，在大大提高了痰結(jié)核桿菌的檢出率同時(shí)鑒別出利福平耐藥情況，且將檢測(cè)時(shí)間縮短為2 h[9]。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程基本不產(chǎn)生氣溶膠，減少了檢測(cè)人員感染的機(jī)會(huì)，試劑盒獨(dú)立放置，減少了DNA污染的可能，由此可以得出Gene Xpert-MTB/RIF檢測(cè)技術(shù)顯著優(yōu)越于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法[10]，對(duì)菌陰肺結(jié)核的早期診治意義重大。

本研究顯示，涂陰肺結(jié)核僅占納入患者的40.5%，明顯低于黃飛 等[7]于2014年相關(guān)研究中涂陰肺結(jié)核病例所占比例，考慮與納入患者均為住院患者，病情相對(duì)重，且痰液標(biāo)本留取相對(duì)規(guī)范有關(guān)。本研究通過對(duì)比涂陰和涂陽肺結(jié)核臨床特征得出涂陽組患者中性粒細(xì)胞水平顯著高于涂陰組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，WBC、Mono、Lym、HB及PLT水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與范春松 等[11]、李艷治[12]結(jié)果基本一致，其中性粒細(xì)胞水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析原因可能與住院患者同時(shí)合并細(xì)菌感染有關(guān)。涂陽肺結(jié)核患者的臨床表現(xiàn)及影像學(xué)中肺組織損傷更為嚴(yán)重，相關(guān)報(bào)道[13]也顯示，涂陽肺結(jié)核組織毀損明顯、受累肺葉較多，而涂陰肺結(jié)核的臨床表現(xiàn)無明顯特異性、影像學(xué)表現(xiàn)往往比較局限，診斷困難。Gene Xpert-MTB/RIF檢查的敏感性明顯高于痰抗酸染色涂片，且檢出時(shí)間控制在當(dāng)天，明顯提前了抗結(jié)核治療時(shí)間。研究中涂陰標(biāo)本中結(jié)核桿菌培養(yǎng)陽性率為12.35%，而Gene Xpert-MTB/RIF技術(shù)檢測(cè)陽性率為17.90%。此次研究中Gene Xpert-MTB/RIF檢測(cè)陽性率明顯低于石海萍 等[14]2016年研究的結(jié)果80.0%，分析原因，與研究納入的病例均為初治患者有關(guān)。以BD960液體培養(yǎng)作為金標(biāo)準(zhǔn)，Gene Xpert-MTB/RIF技術(shù)檢測(cè)的敏感度為90.00%，特異度為92.30%，陽性預(yù)測(cè)值為62.07%，陰性預(yù)測(cè)值為98.50%，一致率為91.98%，提示兩者具有極好的一致性，與劉巧 等[15]報(bào)道的結(jié)果接近。